本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种生产类胡萝卜素的方法。
背景技术：
类胡萝卜素是一类脂溶性色素，大多难溶于水，可溶于有机溶剂，呈黄色、橙色或红色的多烯类化合物，因其分布广泛、结构多样及功能较多而成为一种重要的天然色素。它同时存在于植物、动物和微生物中。类胡萝卜素因其结构特性而具有多种生物功效，研究表明，类胡萝卜素可能具有防治心脏病、癌症、白内障和几种人体慢性疾病的作用和其他生物活性作用。此外，类胡萝卜素作为一种优良的食品添加剂和改善人类营养的营养增补剂，它的优良品质和效果，很久以来就被世界各国所公认，被誉为最有希望的抗氧化剂。类胡萝卜素由于其良好的应用前景及卓越的功能，长久以来备受人们青睐。化学合成的胡萝卜素较难被人体所吸收，生理活性较低，而且会合成对人体有害的中间产物，不易分离，具有一定的毒副作用，没有被大规模推广使用。天然存在胡萝卜素没有毒副作用，越来越受到人们的重视。目前，天然类胡萝卜素的来源主要是从植物中提取和微生物发酵提取。植物提取是指从胡萝卜等富含类胡萝卜素的植物中提取类胡萝卜素。微生物发酵提取是指以三孢布拉氏霉，杜氏海藻，酵母等微生物发酵生产类胡萝卜素。中国发明专利cn102702777a公开了一种酶法水解从植物原料中提取类胡萝卜素的方法，首先将新鲜植物原料和水用匀浆机匀浆，用超声波破碎机破碎；再加入纤维素酶、果胶酶和表面活性剂进行酶解，然后在酶解液中加入硅藻土，过滤后将滤液真空干燥，即得到类胡萝卜素；该方法消耗原材料多，成本高，受原料影响较大等缺点。由于从天然植物中提取类胡萝卜素工艺复杂并且产率较低，受原料影响较大，因此通过微生物发酵法生产类胡萝卜素已成为研究热点。例如中国专利cn104805168a公开了采用光合细菌发酵生产类胡萝卜素的方法，通过调节培养条件至微氧，类胡萝卜素产量明显提高。也有部分研究对混合菌株发酵进行了研究，例如“混菌固态发酵山药皮产类胡萝卜素的工艺研究，食品工业科技2014年”，采用粗壮脉纹孢菌和植物乳杆菌混合固态发酵生产类胡萝卜素，固态发酵时间为60小时，产率不足200ug/g培养物，产率相对较低。受植物来源的类胡萝卜素含量的限制，当前天然胡萝卜素的价格较高，是化学品的两倍，成本相对较高，而微生物发酵法存在产量低，培养成本高的缺陷，申请人前期的专利技术“一种复合微生物培养物及其在生产类胡萝卜素中的应用”提供了一种成本低廉的微生物方法，该方法产率高，在该技术的基础上，申请人继续对类胡萝卜素产品进行了分离提取。技术实现要素：本发明的目的是解决现有技术类胡萝卜素生产存在的等缺陷，提供了一种生产类胡萝卜素的方法。本发明是通过如下技术方案来实现的：一种生产类胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：将复合微生物培养物离心，弃上清，收集菌体，然后添加丙酮，进行超声破壁，再静置30min，然后离心，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入koh甲醇溶液，静置10-30min，再添加nacl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。具体地，所述方法包括如下步骤：将复合微生物培养物于8000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清，收集菌体，然后按照1kg菌体：1-1.5l丙酮的量添加丙酮，超声破壁，超声功率为300w，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，总超声时间为30min，再静置30min，然后5000rpm离心5min，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理15min，超声功率为300w，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，然后5000rpm离心3min，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入五分之一体积的质量分数为30％的koh甲醇溶液，静置10-30min，再添加5%的nacl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。具体地，复合微生物培养物包括枯草芽孢杆菌、荚膜红假单胞菌以及粘红酵母菌。进一步地，所述复合微生物培养物按照如下步骤制备而得：步骤1）首先将水稻秸秆粉碎至1-5cm，然后进行蒸汽爆破预处理；步骤2）将经过蒸汽爆破处理的水稻秸秆过50目筛，收集筛下物，然后与酒糟按照3：1的质量比混合得到混合物，再添加到占混合物2-3倍重量的水中，加热至60-70℃，保温条件下100rpm搅拌60-90min，然后加热至121℃，保温3-5min，自然冷却至室温，得到培养液；步骤3）将枯草芽孢杆菌种子液按照5-7％的接种量接入含有培养液的光合培养发酵罐中进行培养，培养时间为24-36h，然后接种荚膜红假单胞菌种子液和粘红酵母菌种子液，接种量均为8-10％；继续培养24-36h，制得复合微生物培养物。优选地，所述蒸汽爆破预处理的条件为：压力1.5-1.8mpa、停留时间5-10min。优选地，所述培养条件为：温度为30℃，溶氧浓度为1-3mg/l，光照强度为2000-3000lux。优选地，所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌接种到lb固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到lb液体培养基上进行培养，得到枯草芽孢杆菌种子液。优选地，所述荚膜红假单胞菌种子液的制备方法为：荚膜红假单胞菌划线接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养，然后挑取菌落，接种到液体种子培养基中进行种子培养，得到荚膜红假单胞菌种子液。优选地，所述液体种子培养基组分为：葡萄糖3g/l、酵母膏2g/l、氯化铵0.5g/l、磷酸二氢钾0.1g/l、七水硫酸镁0.1g/l、七水硫酸亚铁0.01g/l。优选地，所述粘红酵母菌种子液的制备方法为：将粘红酵母菌接种到ypda固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到ypd液体培养基上培养，30℃培养24h，得到粘红酵母菌种子液。本发明实施例具体采用的菌株为枯草芽孢杆菌atcc6633、荚膜红假单胞菌atcc33762、粘红酵母菌atcc32759。所述菌株的种子液制备方式并不限于实施例记载的方式，还可以根据本领域的常规制备方式来完成。与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：本发明制备获得的类胡萝卜素产品纯度较高，达到94%以上，折算成收率达到90%以上。本发明提取工艺中，采用超声辅助破壁提取，减少了提取试剂的使用量；蒸汽爆破预处理使半纤维素和木质素部分降解，且破坏了木质素与半纤维素对纤维素的包裹作用，使纤维素的结晶区受到破坏，原料的孔隙率和内表面积增大，因而更有利于后续纤维素的酶水解作用进行。本发明对农业废弃物秸秆进行了粉碎和爆破处理，结合酒糟，可以为枯草芽孢杆菌提供正常的生长条件，原料相对低廉，能够降低企业成本；适当的营养缺乏或低氧条件胁迫条件下可以使得菌体细胞内产生更多的类胡萝卜素等物质，然后也容易造成菌株增殖缓慢，工业生产中，需要平衡类胡萝卜素产量、菌体增殖以及培养成本；荚膜红假单胞菌和粘红酵母菌是产类胡萝卜素的菌株，二者可以共生，能够利用木糖作为发酵底物，但是秸秆处理物中的木糖等还原糖养料不足，不利于菌株生长；本发明首先采用枯草芽孢杆菌对秸秆和酒糟进行发酵处理，枯草芽孢杆菌可以产生纤维素酶和蛋白酶，本发明的培养液中碳源主要是纤维素和木质素组分，糖类组分相对不足的胁迫条件下，使得枯草芽孢杆菌能够产酶效率提高，纤维素酶能够利用纤维素作为底物产生还原糖供荚膜红假单胞菌和粘红酵母菌利用，而荚膜红假单胞菌和粘红酵母菌存在营养竞争关系，胁迫条件下，胞内会产生大量的胡萝卜素类物质；枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶还可以酶解酒糟，酶解产物可以作为氮源；三种菌株在培养体系中可以协同共生，促进菌株增殖以及类萝卜素的产生。附图说明图1：混合培养时间对菌体生物量的影响；图2：混合培养时间对类胡萝卜素产量的影响。具体实施方式本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1一种生产类胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：将复合微生物培养物于8000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清，收集菌体，然后按照1kg菌体：1l丙酮的量添加丙酮，然后超声破壁，超声功率为300w，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，总超声时间为30min，再静置30min，然后5000rpm离心5min，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理15min，超声功率为300w，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，然后5000rpm离心3min，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用两倍重量的乙醚溶解，然后加入占溶解物五分之一体积的质量分数为30％的koh甲醇溶液，静置30min，再添加5%（质量分数）的nacl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。所述复合微生物培养物，其按照如下步骤制备而得：1）首先将水稻秸秆粉碎至2cm，然后置于压力1.5mpa、停留时间10min的条件下进行蒸汽爆破预处理；2）将经过蒸汽爆破处理的水稻秸秆过50目筛，收集筛下物，然后与酒糟按照3：1的质量比混合得到混合物，再添加到占混合物2倍重量的水中，加热至60℃，保温条件下100rpm搅拌90min，然后加热至121℃，保温5min，自然冷却至室温，得到培养液；3）将枯草芽孢杆菌种子液按照7％（体积比）的接种量接入含有培养液的光合培养发酵罐中进行培养，温度为30℃，溶氧浓度为1mg/l，光照强度为2000lux，培养时间为36h，然后接种荚膜红假单胞菌种子液和粘红酵母菌种子液，接种量均为10％（体积比）；继续培养36h，制得复合微生物培养物。所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌接种到lb固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到lb液体培养基上进行培养，得到菌体浓度为1×108cfu/ml的枯草芽孢杆菌种子液；所述荚膜红假单胞菌种子液的制备方法为：荚膜红假单胞菌划线接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养，然后挑取菌落，接种到液体种子培养基中进行种子培养，得到菌体浓度为3×108cfu/ml的荚膜红假单胞菌种子液；液体种子培养基组分为：葡萄糖3g/l、酵母膏2g/l、氯化铵0.5g/l、磷酸二氢钾0.1g/l、七水硫酸镁0.1g/l、七水硫酸亚铁0.01g/l；所述粘红酵母菌种子液的制备方法为：将粘红酵母菌接种到ypda培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到ypd液体培养基上培养，30℃培养24h，得到菌体浓度为5×107cfu/ml的粘红酵母菌种子液。实施例2一种生产类胡萝卜素的方法，其包括如下步骤：将复合微生物培养物于8000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清，收集菌体，然后按照1kg菌体：1.5l丙酮的量添加丙酮，然后超声破壁，超声功率为300w，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，总超声时间为30min，再静置30min，然后5000rpm离心5min，收集上清液和沉淀，往沉淀中添加相同体积的丙酮，采用超声处理15min，超声功率为300w，每次超声时间为10s，间歇时间为10s，然后5000rpm离心3min，收集上清液；合并两次上清液，然后用旋转蒸发器低温蒸干，残留物用乙醚溶解，然后加入六分之一体积的质量分数为30％的koh甲醇溶液，静置20min，再添加5%的nacl溶液使溶剂分层，收集上层乙醚相，将乙醚相蒸干，即得类胡萝卜素产品。所述复合微生物培养物，其按照如下步骤制备而得：1）首先将水稻秸秆粉碎至5cm，然后置于压力1.8mpa、停留时间5min的条件下进行蒸汽爆破预处理；2）将经过蒸汽爆破处理的水稻秸秆过50目筛，收集筛下物，然后与酒糟按照3：1的质量比混合得到混合物，再添加到占混合物3倍重量的水中，加热至70℃，保温条件下100rpm搅拌80min，然后加热至121℃，保温4min，自然冷却至室温，得到培养液；3）将枯草芽孢杆菌种子液按照6％（体积比）的接种量接入含有培养液的光合培养发酵罐中进行培养，温度为30℃，溶氧浓度为2mg/l，光照强度为3000lux，培养时间为24h，然后接种荚膜红假单胞菌种子液和粘红酵母菌种子液，接种量均为8％（体积比）；继续培养30h，制得复合微生物培养物。所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌接种到lb固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到lb液体培养基上进行培养，得到菌体浓度为2×108cfu/ml的枯草芽孢杆菌种子液；所述荚膜红假单胞菌种子液的制备方法为：荚膜红假单胞菌划线接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养，然后挑取菌落，接种到液体种子培养基中进行种子培养，得到菌体浓度为3×108cfu/ml的荚膜红假单胞菌种子液；液体种子培养基组分为：葡萄糖3g/l、酵母膏2g/l、氯化铵0.5g/l、磷酸二氢钾0.1g/l、七水硫酸镁0.1g/l、七水硫酸亚铁0.01g/l；所述粘红酵母菌种子液的制备方法为：将粘红酵母菌接种到ypda培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到ypd液体培养基上培养，30℃培养24h，得到菌体浓度为7×107cfu/ml的粘红酵母菌种子液。实施例3爆破对水稻秸秆主要成分的变化，具体见表1：表1指标爆破前爆破后半纤维素和纤维素%53.740.5木质素%27.922.1低聚木糖%03.4结论：爆破造成秸秆细胞壁破坏，部分半纤维素和纤维素降解而溶出,有利于后续纤维素酶对纤维素的酶解；爆破预处理过程中纤维素结晶度和聚合度下降,半纤维素通过自水解作用降解成单糖和寡糖，可作为菌株的碳源。实施例4菌体生物量以及类胡萝卜素产量测定：将复合微生物培养物于8000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清，45℃干燥36h左右达到恒重。准确称取菌体0.5g，加入2mol/l的盐酸2ml，混匀，抽滤，水洗至中性，取滤渣备用。滤渣加入10ml丙酮，室温浸提30min，两次，滤液进行离心，合并两次离心的上清液加丙酮定容25ml。混匀，以丙酮做空白对照，于461nm下测定吸光度值。类胡萝卜素含量方法测定，类胡萝卜素含量(mg/g菌体生物量)=（aλmax×d×v）/（1000×0.16×w）。式中:aλmax－类胡萝卜素最大吸收波长下的吸光度；v－提取所用溶剂量(ml)；d－测定试样时的稀释倍数；w－菌体重量(g)；0.16－类胡萝卜素的克分子消光系数。设置对照组验证各菌株的协同效果，对照组1：仅采用枯草芽孢杆菌和荚膜红假单胞菌，不添加粘红酵母菌，制备方法同实施例1；对照组2：仅采用枯草芽孢杆菌和粘红酵母菌，不添加荚膜红假单胞菌，制备方法同实施例1。具体检测结果见表2：表2组别菌体生物量干重g/l类胡萝卜素产量mg/g菌体生物量实施例112.72.08实施例212.11.96对照组110.91.65对照组29.81.50如表2所示，实施例1-2采用三种菌株混合发酵，菌体生物量和类胡萝卜素产量均高于对照组1-2，其中类胡萝卜素的产量明显高于对照组1-2。其中，实施例1中菌体生物量干重为12.7g/l，比对照组1和2分别高16.5%和29.6%；胡萝卜素产量为2.08mg/g菌体生物量，比对照组1和2分别高26.1%和38.7%。实施例5三种菌株混合培养时间对菌体生物量和类胡萝卜素产量的影响。以实施例1方法为例，分别设置不同的混合培养时间点，具体为6，12,18,24,30,36,42h。如图1-2所示，12h小时内菌体生物量增加明显，但是类胡萝卜素产量维持在较低的水平，随着培养时间的增加，菌体生物量和类胡萝卜素产量均增幅明显，培养时间24h后，菌体生物量增幅放缓，可能是因为培养液中培养成分降低，营养匮乏胁迫条件下，菌株增殖速率降低，但是类胡萝卜素产量继续提高，培养至36h时，菌体生物量达到峰值，随后菌体生物量降低，可能原因是菌株出现了死亡，相应地，类胡萝卜素产量也有所降低。实施例6本发明实施例1-2的提取方法对纯度和收率的影响：以复合微生物培养物含水量为70%计算，每100kg复合微生物培养物经过干燥可获得30kg菌体，类葫芦卜素含量的理论值为62.4g（实施例1）和58.8g（实施例2）。称重类胡萝卜素产品，并且采用分光光度法检测产品中类胡萝卜素的纯度。具体见表3：表3组别产品重量g纯度%实施例160.794.8实施例256.994.3如表3所示，本发明类胡萝卜素产品纯度较高，达到94%以上，折算成收率分别为92.2%（实施例1）和91.3%（实施例2）。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。当前第1页12