一种酸敏感两亲性嵌段聚合物及合成方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术、纳米医药及新材料领域，具体涉及含二代树枝状聚合物和β-羧基酰胺键的两亲性嵌段聚合物的合成及其应用，可用于制备具有溶酶体逃逸和酸触发药物释放功能的智能纳米药物传递体系。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类的身心健康，目前临床治疗仍然以小分子药物化疗为主。小分子化疗药物在初期取得了巨大成功，但随后严重的毒副作用，低选择性，易耐药性等缺陷，迫使人们急需对其加以改善。据此科学工作者们提出了针对肿瘤微环境的药物传递系统的概念，即肿瘤组织的快速增长，导致其差别正常组织的微环境。正常人体血液的ph为7.35-7.45，而肿瘤组织的ph稍低为6.0-6.5，溶酶体的ph更低为4.5-5.0。据此将ph敏感药物传递系统应用于肿瘤治疗中是目前较为新颖的治疗手段。

与小分子药物相比，具有纳米尺寸的多功能载体可将药物运送至靶组织、靶细胞，甚至是特定的细胞器。但药物载体进入细胞后只有不被溶酶体中的酸性环境以及大量存在的酶破坏，才可能产生生物效应。因此，协助药物逃逸溶酶体是提高药效实现细胞器靶向的新型肿瘤治疗手段。

阿霉素(dox)是一种能够抑制癌细胞dna合成的传统小分子抗肿瘤脂溶性药物。在临床上阿霉素是广谱抗癌药，可以治疗各类癌症，但阿霉素系统毒性较大，严重限制了其在临床上的应用。最主要的不良反应是心脏毒性、骨髓抑制以及消化系统反应。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种酸敏感两亲性嵌段聚合物及合成方法和应用，其聚合物peg-block-pgag2-hpa中的β-羧酸酰胺键在溶酶体酸性条件下易断裂。同时，两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa中的多个二代树型聚合物，在降低两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa有生物毒性的同时，增强了两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa的质子海绵效应。用该两亲性嵌段聚合物构筑的纳米药物载体，装载dox，得到载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox。peg-block-pgag2-hpa·dox经长循环，通过epr效应富集到肿瘤组织。通过胞吞进入溶酶体，在溶酶体酸性环境下peg-block-pgag2-hpa·dox中的β-羧基酰胺键断裂，胶束解体，同时释放出dox。胶束解体后，利用peg-block-pgag2聚合物的质子海绵效应促进溶酶体破裂，进一步帮助dox逃出溶酶体，进入细胞核杀伤肿瘤细胞。

实现本发明该目的的具体技术方案是：

一种酸敏感两亲性嵌段聚合物，特点是：将亲水性的mpeg-nh2和聚谷氨酸衍生物连接到一起得到两嵌段聚合物peg-block-pgan3；通过click反应将树枝状聚合物g2.0和peg-block-pgan3连接得到具有质子海绵效应的两嵌段聚合物peg-block-pgag2；最后将六氢苯酐修饰到peg-block-pgag2的氨基上，合成酸敏感两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa，其具有式(i)结构：

式(i)中：m为5-10，n为10-15。

一种上述聚合物的合成方法，该方法包括以下步骤：

(1)合成l-氯乙基谷氨酸酯-n-羰基-环内酸酐clg-nca

取1mmol的谷氨酸加入到反应容器中，加入1.5mmol的氯乙醇，再缓慢滴加0.3mmol的浓h2so4作为催化剂，在75℃反应4小时，加入三乙胺调ph至中性，过滤出淡黄色沉淀；将得到的沉淀溶解在80℃热水中，冷却重结晶，得到clg晶体；将1mmol的clg晶体与0.4mmol的三光气投入反应容器中，加入无水thf在60℃下反应4h至反应液澄清，除去溶剂，将产物溶解在正己烷中，加入ea进行萃取3-4次；通过旋转蒸发仪除去正己烷后，将得到的clg-nca于干燥环境中保存；其中，谷氨酸、氯乙醇与浓硫酸的摩尔比为1:1.5:0.3；clg与三光气的摩尔比为1:0.4；

(2)合成mpeg-nh2修饰的聚谷氨酸酯衍生物peg-block-pgacl

将1mmol的clg-nca溶解于无水thf中，在氮气保护下加入0.5mmol的mpeg-nh2(mw＝2000)进行nca开环，在25℃条件下反应，12h后，通过旋转蒸发仪除去thf，加入dcm溶解，产物浓缩后加入冰乙醚中重沉淀3次，抽滤后得到白色固体，干燥得到peg-block-pgacl；其中，clg-nc和mpeg-nh2的摩尔比为1:0.5；

(3)合成叠氮取代的聚谷氨酸酯衍生物peg-block-pgan3

将1mmol的peg-block-pgacl溶于dmf中，称量15mmol的nan3，加热至60℃反应，24h后将反应液中加入去离子水，滤去不溶物后转移至截留分子量5000的透析袋中，去离子水每6h换一次，透析24h后冻干得到peg-block-pgan3固体；其中，peg-block-pgacl和nan3的摩尔比为1:15；

(4)合成二代树枝聚合物g2

在冰浴条件下，将1mmol的炔丙胺溶解在甲醇溶液中，再滴加0.25mmol的丙烯酸甲酯，在室温n2保护下反应24h，反应液浓缩拌样过硅胶柱(流动相为ea:pe＝15:1)，纯化后得到黄色油状液体g0.5；在冰浴条件下将1mmol的g0.5溶解在甲醇中，然后滴加12mmol的乙二胺，在室温氮气保护下反应48h，通过除去甲醇得到油状黄色液体g1；重复本步骤得到g2；其中，炔丙胺和丙烯酸甲酯的摩尔比为1:0.25；g0.5和乙二胺的摩尔比为1:12；

(5)通过click反应合成peg-block-pgag2-hpa

peg-block-pgan3与树型聚合物g2发生click反应得到peg-block-pgag2；称量1mmol的peg-block-pgan3和1mmol的g2溶解在dmf中，加入0.3mmol的溴化亚酮作为催化剂，在氮气保护下65℃反应，36h后往反应液中加入去离子水，用截留分子量10000的透析袋在ph7.4的磷酸缓冲液中透析3天，冷冻干燥得到产物peg-block-pgag2；称量2mmol的顺式六氢苯酐与0.1mmol的peg-block-pgag2加入反应容器中，再加入无水dmf作为溶剂，在氮气保护下室温反应过夜，滤去不溶物后转移至截留分子量5000的透析袋中，去离子水每6h换一次，反应完后过滤，用截留分子量10000的透析袋透析在ph7.4的去离子水中透析3天，冷冻干燥得到产物peg-block-pgag2-hpa；其中，peg-block-pgan3、g2和溴化亚酮的摩尔比为1:1:0.3；顺式六氢苯酐和peg-block-pgag2的摩尔比为2:0.1。

一种上述两亲性嵌段聚合物在制备纳米药物载体的应用。

所述纳米药物载体为纳米胶束并为酸敏感型，能够装载小分子抗癌脂溶性药物，得到纳米药物传递系统。

所述纳米药物传递系统中，抗癌药物将从肿瘤细胞溶酶体中逃逸，提高药物传递效率。

本发明的两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa具有式(i)结构：

其中，peg-block-pga具有式(2)结构：

含有二代树枝状聚合物peg-block-pgag2具有式(3)结构：

hap具有式(4)结构：

所述两亲性嵌段共聚物可自组装形成纳米胶束，用该胶束可作为药物载体负载抗癌药物阿霉素得到阿霉素纳米药物传递系统。

其中，所述阿霉素纳米药物传递系统在病灶的溶酶体酸性微环境下胶束可解体，释放负载药物阿霉素。

其中，所述纳米药物载体具有质子海绵效应，可帮助负载抗癌药物从肿瘤细胞溶酶体中逃逸，提高药物传递效率。

本发明制备的两亲性嵌段聚合物应用于制备纳米药物载体，该纳米药物载体负载阿霉素，可得到纳米药物传递系统。

本发明的有益效果在于：本发明制备的两亲性嵌段聚合物可以用于构筑纳米胶束，负载阿霉素得到阿霉素纳米药物。该纳米药物具有较好的溶酶体内定点释药，较低的细胞毒性和良好的细胞吞噬性，能有效帮助阿霉素逃离溶酶体，进入细胞核发挥药效。

附图说明

图1为载阿霉素纳米药物peg-block-pgag2-hpa·dox示意图；

图2为两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa的合成路线图；

图3为两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa的¹h-nmr谱图；

图4为两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa在不同ph条件中降解24h后的¹h-nmr谱图；

图5为两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa·dox在ph5.0条件下降解曲线图；

图6a为空白胶束peg-block-pgag2-hpa的粒径分布图；图6b为载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox的粒径分布图；

图7a为载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox的原子力显微镜图；图7b为空胶束peg-block-pgag2-hpa的原子力显微镜图；

图8为用dls测定载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox的散射光强度随浓度变化曲线图；

图9为载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox在不同ph缓冲溶液中的药物释放行为图；图中9a为peg-block-pgag2-hpa·dox在ph＝5条件下的药物释放曲线；图9b为peg-block-pgag2-hpa·dox在ph＝6.5条件下的药物释放曲线；

图9c为peg-block-pgag2-hpa·dox在ph＝7.4条件下的药物释放曲线；

图10为空白胶束peg-block-pgag2-hpa、dox·hcl和载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox在正常培养基条件下，以及载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox在含40mmnh4cl培养基条件下的细胞毒性示意图；

图11为dox·hcl、载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox在正常培养条件和用40mmnh4cl预处理a549细胞后用倒置荧光显微镜拍摄的溶酶体逃逸效果图片(标尺为20μm)；(a)a组为a549细胞用peg-block-pgag2-hpa·dox胶束孵育4h后拍摄的荧光图片；(b)b组为a549细胞用peg-block-pgag2-hpa·dox胶束孵育12h后拍摄的荧光图片；(c)c组为用nh4cl预处理a549细胞再用peg-block-pgag2-hpa·dox胶束孵育12h后拍摄的荧光图片；(d)d组为a549细胞用dox·hcl孵育12h后拍摄的荧光图片；

图12为dox·hcl和载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox在4h、12h时a549中荧光含量的统计图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

l-氯乙基谷氨酸酯-n-羰基-环内酸酐(clg-nca)合成

称量谷氨酸(2.0g,24.8mmol)加入到圆底烧瓶中，加入氯乙醇(5ml,35.2mmol)，再缓慢滴加浓h2so4(0.4ml,7.5mmol)作为催化剂，在75℃反应。4h后，加入三乙胺调ph至中性，过滤出淡黄色沉淀。将得到的沉淀溶解在80℃热水中，冷却重结晶，得到晶体0.62g。将得到的clg(2g,9.5mmol)和三光气(1.1g,3.7mmol)投入圆底烧瓶中，加入无水thf在60℃下反应4h至反应液澄清。通过旋转蒸发仪除去溶剂，将产物溶解在正己烷中，加入适量ea进行萃取3-4次。通过旋转蒸发仪除去正己烷后，将得到的1.1g液体clg-nca于干燥环境中保存，产率为55％。

所述clg-nca结构式如式(5)所示

实施例2

合成mpeg-nh2修饰的聚谷氨酸酯衍生物peg-block-pgacl

clg-nca(1.7g,7.2mmol)溶解于10ml无水thf中，在氮气保护下加入mpeg-nh2(mw＝2000)(0.72g,0.36mmol)进行nca开环，在25℃条件下反应。12h后，通过旋转蒸发仪除去thf，加入dcm溶解，产物浓缩后加入冰乙醚中重沉淀3次，抽滤后得到白色固体，干燥得到1.5gpeg-block-pgacl(产率为84％)。

所述peg-block-pgacl的结构式如式(6)所示

实施例3

合成叠氮取代的聚谷氨酸酯衍生物(peg-block-pgan3)

将peg-block-pgacl(1.0g,0.2mmol)溶于dmf中，小心称量nan3(0.2g,3.1mmol)，加热至60℃反应。24h后将反应液中加入去离子水，滤去不溶物后转移至截留分子量5000的透析袋中，去离子水每6h换一次，透析24h后冻干得到peg-block-pgan3固体，产率83％。

所述peg-block-pgan3的结构式如式(7)所示

实施例4

合成二代树枝聚合物g2

在冰浴条件下将炔丙胺(1.6ml,18.0mmol)溶解在甲醇溶液中，再滴加丙烯酸甲酯(0.3ml,4.6mmol)，在室温n2保护下反应24h。反应液浓缩拌样过硅胶柱(流动相为ea:pe＝15:1)，纯化后得到0.8g黄色油状液体g0.5，产率为80％。在冰浴条件下将得到的g0.5(0.9g,4.2mmol)溶解在甲醇(5ml)中，然后滴加乙二胺(3.4ml,50.4mmol)，在室温氮气保护下反应48h。通过旋转蒸发仪除去甲醇得到油状黄色液体g1，产率为99％。重复以上步骤，得到g2，产率为90％。

所述g2的结构式如式(8)所示

实施例5

通过click反应合成peg-block-pgag2-hpa

peg-block-pgan3与树枝状构聚合物g2发生click反应得到peg-block-pgag2。称量peg-block-pgan3(0.9g,0.2mmol)和g2(0.15g,0.2mmol)溶解在dmf中，加入催化剂溴化亚酮(0.01g,0.06mmol)，在氮气保护下65℃反应。36h后往反应液中加入去离子水，用截留分子量10000的透析袋在ph7.4的磷酸缓冲液中透析3d，冷冻干燥得到产物peg-block-pgag2。称量顺式六氢苯酐(0.25g,1.6mmol)与peg-block-pgag2(1.0g,0.08mmol)，加入圆底烧瓶中。再加入无水dmf(5ml)作为溶剂，在氮气保护下室温反应过夜。滤去不溶物后转移至截留分子量5000的透析袋中，去离子水每6h换一次，反应完后过滤，用截留分子量10000的透析袋透析在ph7.4的去离子水中透析3d，冷冻干燥得到产物peg-block-pgag2-hpa，产率为90％。peg-block-pgag2-hpa聚合物核磁图谱如图3所示。

所述peg-block-pgag2-hpa的结构式如式(1)所示

实施例6

两亲性嵌段聚合物peg-block-pgag2-hpa的酸降解性能

用核磁共振仪监测体外模拟肿瘤部位酸性条件下peg-block-pgag2-hpa的降解情况，通过核磁图积分比例计算酰胺键的降解百分率。用pbs缓冲盐(na2hpo4/nah2po4)溶解在d2o中的制备ph为7.4(模拟正常组织ph)、6.5(模拟肿瘤组织ph)和5.0(模拟肿瘤细胞溶酶体ph)浓度为0.1m的溶液。然后将100mgpeg-block-pgag2-hpa分别溶解在ph值为7.4、6和5的0.5mld2o中。每个样品每小时扫描一次，并对得到的¹hnmr谱进行分析。得到聚合物peg-block-pgag2-hpa在不同ph条件下孵育24h后的核磁图谱如图4所示，可以看出酸性越强，聚合物中β-羧酸酰胺键断裂越多。还可得到ph为5.0的降解曲线图如图5所示，通过进一步通过降解动力学分析得到ph为5.0的降解半衰期为11.26小时。

实施例7

空白胶束peg-block-pgag2-hpa胶束的制备、粒径测试及形貌观察

取10mgpeg-block-pgag2-hpa聚合物溶于0.5ml的dmso，搅拌0.5h，用纳米沉淀法制备peg-block-pgag2-hpa胶束，即将混合溶液滴加入转子速度为500r/min的5ml超纯水中。然后将过滤后的滤液装入截留分子量3500的透析袋在ph为7.4的磷酸缓冲盐中透析48h，除去dmso。将透析液通过冷冻干燥机除去水，制得peg-block-pgag2-hpa胶束的固体粉末。采用dls对载药胶束peg-block-pgag2-hpa胶束的平均粒径，粒径分布，zeta电位及多分散性指数(pdi)进行测试。如图6a所示，该空白胶束的粒径为137.1nm。得到胶束粒径为用原子力显微镜(afm)对peg-block-pgag2-hpa胶束的形貌进行表征。取新鲜制备的胶束溶液滴至干净的盖破片上，避光置于干燥处自然挥干。用原子力显微镜观察胶束形貌并拍照，得到的afm图如图7a所示。可以观察得到胶束大小均一，形貌为球形。

实施例8

peg-block-pgag2-hpa·dox载药胶束的制备、粒径测试及形貌观察

取10mgpeg-block-pgag2-hpa聚合物和2mgdox·hcl溶于0.5ml的dmso，加入2μl三乙胺，搅拌4h。用纳米沉淀法制备peg-block-pgag2-hpa·dox胶束，即将混合溶液滴加入转子速度为500r/min的5ml超纯水中。然后将过滤后的滤液装入截留分子量3500的透析袋在ph为7.4的磷酸缓冲盐中中透析48h，除去未载入胶束的药物和dmso，在制备过程中注意避光。将透析液冷冻干燥，制得peg-block-pgag2-hpa·dox胶束冻干粉。

采用dls对载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox胶束的平均粒径，粒径分布，zeta电位及多分散性指数(pdi)进行测试。如图6b所示，该空白胶束的粒径为121.7nm。采用原子力显微镜(afm)观察peg-block-pgag2-hpa·dox胶束的形貌。用原子力显微镜(afm)对peg-block-pgag2-hpa·dox载药胶束的形貌进行表征。取新鲜制备的胶束溶液滴至干净的盖破片上，避光置于干燥处自然挥干。用原子力显微镜观察胶束形貌并拍照。用原子力显微镜观察胶束形貌并拍照，得到的afm图如图7b所示。可以观察得到胶束大小均一，形貌为球形。

实施例9

临界胶束浓度(cmc)的测定

将peg-block-pgag2-hpa·dox胶束冻干粉配制成浓度为2,1,0.5,0.250.05,0.1,0.05,0.025,0.01,5×10^-3,2.5×10^-3,1×10^-3mg/ml的溶液，分别用dls测定3次，记录不同上述溶液的散色光强度值(kcps)。所测得的散射光强随浓度变化曲线如图8所示，cmc值可由曲线的突变点求出。peg-block-pgag2-hpa·dox胶束的cmc值为0.696mg/ml。

实施例10

peg-block-pgag2-hpa·dox载药胶束的载药量(dlc)和包封率(dle)的测定

称取10mgpeg-block-pgag2-hpa·dox胶束冻干粉用二甲亚砜溶解，用容量瓶配制浓度为1mg/ml的溶液。分别配制浓度为1,0.1,0.75,0.05,0.04,0.03,0.02,0.01,5×10^-3,1×10^-3,5×10^-4,2.5×10^-4,1×10^-4mg/ml的阿霉素溶液。用紫外可见分光度计测定上述溶液在480nm的吸收值，绘制dox吸光度值与溶度的标准曲线。通过阿霉素标准曲线可算出1mg/mlpeg-block-pgag2-hpa·dox胶束溶液中的dox的浓度，然后可根据以下公式得到载药胶束的dle和dlc。通过计算可得，该载药胶束的dlc为8％，dle为38％。

dlc(wt％)＝(载入的药物质量/胶束的质量)＊100％

dle(％)＝(载入的药物质量/投入的药物质量)＊100％

实施例11

peg-block-pgag2-hpa·dox载药胶束的释药特征

将1ml载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox溶液装入截留分子量1000的透析袋中。并放置到25ml干净的棕色样品瓶中，分别往瓶中加入10ml的ph＝5.0的柠檬酸缓冲液，ph＝6.5的磷酸缓冲液和ph＝7.4的磷酸缓冲液。放入在37℃恒温摇床中。在预设的时间间隔取出透析液，加入新的缓冲液。用紫外可见分光度计测定透析液中的dox含量，绘制peg-block-pgag2-hpa·dox胶束的体外药物释放曲线。如图9所示，在ph7.4介质中，药物释放速度较慢，48h内累计释药量约为18％。随着介质ph降低释药量明显增加，在ph5.0介质中，24h内释放量高达78％。

实施例12

peg-block-pgag2-hpa·dox胶束对人非小细胞肺癌细胞a549细胞毒性试验

通过mtt比色法，测定peg-block-pgag2-hpa·dox胶束及载体peg-block-pgag2-hpa·dox对a549细胞毒性。实验方法为：

1.首先收集对数期a549细胞，按照细胞浓度为7000个/孔均匀的接种到96孔板中，每孔加入180μl细胞悬液。

2.将96孔板并置于37℃，5％co2的培养箱中孵育24h后，96孔板每孔底单层铺满a549细胞。将其中一个96孔板的培液移除，加入含有40mmolnh4cl的完全培养基180μl/孔放入孵箱中培养2h。

3.取出三块在未用nh4cl处理的96孔板，分别加入20μl含有不同浓度梯度的peg-block-pgag2-hpa胶束、peg-block-pgag2-hpa·dox载药胶束和dox·hcl的完全培养基。取出一块用用nh4cl的处理的96孔板，加入20μl含有不同浓度的peg-block-pgag2-hpa·dox胶束的完全培养基。上述peg-block-pgag2-hpa·dox载药胶束和dox·hcl的浓度均按照含有的dox浓度作为标准，即含有的dox的浓度为0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5，10，20μg/ml。

4.在37℃，5％co2条件下培养48h后，加入浓度为5mg/mlmtt溶液20μl/孔。

5.4h后，往每个孔中加入100μl三联液(10％sds+5％异丁醇+0.01mol/lhcl)，在37℃下放置过夜。

6.在酶联免疫检测仪在od570nm处测量各孔的吸光度，并根据一下公式得到不同浓度下a549细胞的存活率。

细胞存活率(％)＝[(od实验组-od空白组)/(od对照组-od空白组)]×100％

od实验组：实验组的od值

od空白组：空白组的od值，即不含细胞的完全培养基。

od对照组：对照组的od值，即步骤3中阴性对照组。

如图10所示，空白胶束peg-block-pgag2-hpa显示出极低毒性，dox·hcl和载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox细胞毒性呈现浓度依赖关系，用40mmnh4cl预处理细胞提高溶酶体ph值后，载药胶束对肿瘤细胞毒性明显降低，表明载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox的酰胺键可以在溶酶体的酸性条件下断裂，引起胶束解体释放出dox。

实施例13

载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox的荧光成像实验

1.细胞培养：将生长状态良好的对数期a549细胞接种到6孔板上，以20万/孔的浓度加入2ml细胞悬液。将6孔板置于37℃，含5％co2条件下培养24h后，6孔板每孔底单层铺满a549细胞。将其中一个6孔板的培液移除，每孔加入2ml含有40mmolnh4cl的完全培养基在37℃，含5％co2条件下培养2h。

2.加入药物：加入pbs溶液洗3次去除死细胞。加入2ml用完全培养基配制的dox浓度为5mg/l的peg-block-pgag2-hpa·dox胶束和dox·hcl的溶液。将加好药6孔板的在37℃，含5％co2条件下培养。

3.细胞染色：分别在培养4h和12h后，除去药液，加入pbs洗1-2次去除死细胞。每孔避光加入1ml溶酶体染色剂aatbioquest-22656。置于孵箱中培养8min后取出6孔板，吸出aatbioquest-22656，加入pbs溶液洗1-2次。然后每孔避光加入1ml细胞核染色剂hoechst3334，在37℃，含5％co2条件下培养8min。加入pbs洗1-2次去除染色剂，每孔加入2mlpbs溶液保持水环境。

4.拍摄荧光照片：将6孔板置于倒置荧光显微下观察细胞对peg-block-pgag2-hpa·dox胶束和dox·hcl摄取情况并拍摄荧光照片。

如图11所示，在12h时，载药胶束组中的阿霉素可以成功逃离溶酶体进入细胞核发挥药效。

实施例13

载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox细胞吞噬试验

采用流式细胞仪在a549中对的peg-block-pgag2-hpa·dox胶束和dox·hcl的吞噬量进行表征。细胞培养方法：将a549接种于6孔板上，置于孵箱中培养24h(20万个/孔，2ml/孔)。每孔分别加入1ml含有1μg/mldox的peg-block-pgag2-hpa·dox载药胶束及dox·hcl。对照组加入1ml正常培养基，分别在37℃，含5％co2条件下培养4h，12h。用胰酶消化各组细胞，转移到离心管中，用ph7.4的pbs洗3次。最后用pbs配制成300-800个细胞/μl，转移到96孔板中，用流式细胞仪对各组的荧光量进行测定并分析各组的荧光强度。如图12所示，从图中可以看出，在4h载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox的细胞吞噬量的小于游离dox。而在12h时载药胶束peg-block-pgag2-hpa·dox的细胞吞噬量的大于游离dox。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。