一种非病毒载体共表达IL18的CAR-T细胞构建及其应用的制作方法

本发明涉及免疫细胞制备领域，具体地，本发明涉及一种il-18共表达于cd19特异性嵌合抗原受体t细胞及其用途。

技术背景

嵌合抗原受体t细胞治疗(chimericantigenreceptortcelltherapy,car-ttherapy)是一种新兴的肿瘤免疫治疗，该疗法是通过对患者体内的t细胞进行改造，在t细胞膜上表达一种肿瘤特异性的嵌合抗原受体(chimericantigenreceptors,cars)，使其能够通过肿瘤特异性的、非mhc分子依赖性的途径激活，从而发挥抗肿瘤作用。car是一种跨膜受体，主要由胞外识别结构域、跨膜区和胞内激活结构域组成，其胞外识别结构域通常为肿瘤细胞特征性表面分子的单链抗体(single-chainvariablefragment,scfv)，胞内激活结构域为t细胞受体(tcellreceptor,tcr)的cd3ζ，当car胞外的单链抗体与肿瘤细胞识别、结合，即可激活cd3ζc，进而直接激活t细胞。

至今已发展出三代car，其中第二代car是研究最多、最具应用前景，第二代car分子在跨膜区和激活结构域之间还偶联了一个t细胞共刺激分子，如cd28、4-1bb等，在共刺激分子的协同作用下，car-t细胞表现出更持久的增殖能为和更强的抗肿瘤功能。

近年来，改造car-t细胞使其表达某些细胞因子，可对cd8+t细胞的功能、生存和分化有促进作用，这些因子包括il-12、il-15、il-7和il21等，如在car分子上偶联某种细胞因子如il-15，使细胞因子与car共表达于t细胞，也能显著提高t细胞的体内、体外生存和杀伤靶细胞的能力。与外源性细胞因子相比，car-t细胞共表达的细胞因子只作用于肿瘤局部微环境，无血液稀释的影响，并且不会对正常组织带来副作用。

细胞因子il18是一种具有抗肿瘤活性的蛋白质，il-18可作用于t、b以及nk细胞等效应细胞的增殖与分化，促进ifn-γ的表达和克里梅的释放，从而发挥其抗肿瘤功能。il-18和il12也可直接作用于cd8+t细胞和nk细胞，诱导其产生更多的ifn-γ、释放颗粒酶b、表达fasl，从而进一步杀伤肿瘤细胞。同时，il18因其相对低毒的特性以及和传统疗法的的协同作用引人注目。

目前，将细胞整合进t细胞的方式包括病毒载体和非病毒载体两种方式。其中病毒载体虽然可以较高的拷贝数整合入宿主细胞基因组，但病毒载体的制备具有一定难度，特别是大规模制备；且慢病毒也有安全性的潜在风险。睡美人转座子(sleepingbeaut,sb)作为表达非病毒载体结构简单，操作容易，能插入大片段核酸序列，并且成本相较慢病毒很低。有研究表明，sb介导的基因修饰t细胞能在体外扩增2,200至2,500倍，car表达率可达84％，未发现有整合热点存在，说明sb转座子/转座酶系统极具car-t细胞的临床应用潜力。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，通过将含有cd19car和il18的睡美人质粒转座系统转染入t细胞中，同时加入特定剂量的il2和anti-cd3/cd28磁珠抗体，从而获得共表达il18的cd19car-t细胞，并证明其在实体瘤治疗中的潜在应用。具体的说，本发明提供一种共表达il18的cd19car-t细胞的构建方法，并赋予t细胞杀伤带有cd19靶点肿瘤细胞的能力。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一个目的是构建共表达il18和cd19的嵌合抗原受体分子il18cd19car，其包括信号肽、抗原结合区、铰链区、跨膜区、共剌激信号传导区、cd3ζ信号传导区、t2a短肽和il18表达区。

为了进一步优化上述cd19特异性嵌合抗原受体，所述抗cd19scfv抗体序列来源于本领域己公开的fmc63，该单克隆抗体氨基酸序列如seqidno.3所示。进一步地，所述较链区为cd8hinge区域，其氨基酸序列如seqidno.4所示。进一步地，所述跨膜区所述跨膜区为cd28跨膜区，其氨基酸序列如seqidn0.5所示。

进一步地，所述胞内共刺激信号传导区为cd28和4-1bb，其氨基酸序列如seqidno.6所示。

进一步地，所述胞内信号区为t细胞信号传导激活区域cd3ζ，其氨基酸序列如seqidno.7所示。

进一步地，所述胞内细胞因子共表达信号为il18，其氨基酸序列如seqidno.8所示。

更进一步地，基于以上cd19car分子的结构，本发明所述的该嵌合抗原受体为cmv-csf2ra-cd19scfv-cd8α-cd28-4-1bb-cd3ζ-t2a-il18(rz-fmc63-28bbz-il18)，其结构如图1所示，其核苷酸和氨基酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种共表达il18的cd19car的转座子重组质粒/转座酶系统。

进一步地，所述重组表达载体为原始重组表达载体为睡美人转座子载体pt/svneo(以下简写为pt/s)，其图谱见图2。通过限制性内切酶bglii/noti双酶切后，与含有bglii/noti双酶切位点的cd19car-il18的核酸片段通过dnat4连接酶构建为重组转座子质粒pt/svneo-cmv-cd19car-il18。

进一步的，将重组转座酶质粒sb11与重组转座子质粒pt/svneo-cmv-cd19car-il18按照质量比1:3的比例混合，从而得到共表达il18的cd19car的转座子重组质粒/转座酶系统。

本发明的第三个目的是提供一种含有共表达il18和cd19特异性嵌合抗原受体的核酸重组表达载体的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞为t细胞或含有t细胞的细胞群。

进一步的，将pt-cmv-cd19car-il18转座子及辅助转座酶sb11与peipro阳离子聚合物按照质量比1:4转染t细胞，可获得cd19car-il18阳性的cd19car-t细胞。

本发明还涉及一种上述宿主细胞的构建方法，其包括重组表达载体的构建步骤以及将重组表达载体转导至宿主细胞的步骤。

最后，本发明还提供一种上述共表达il18和cd19特异性嵌合抗原受体，上述编码cd19特异性嵌合抗原受体的核酸，上述重组表达载体以及宿主细胞在哺乳动物肿瘤治疗中的应用。

进一步地，哺乳动物实体肿瘤包括但不限于，血液瘤、卵巢癌肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、神经母细胞瘤等。

更具体的说，上述应用为一种共表达il18和cd19的car-t细胞，其通过sb转座子/转座酶系统电转染t细胞，从而赋予了t细胞表达il18和识别cd19分子的能力，并靶向cd19阳性的哺乳动物实体肿瘤。

附图说明

图1为共表达il18的cd19特异性嵌合抗原受体(car)分子结构的说明示意图：

图2为转座子载体pt/svneo结构的说明示意图：

图3为流式细胞检测car分子在t细胞中的表达率；

图4为il18基因在t细胞的表达情况；

图5为t细胞、cd19car-t细胞和il18cd19car-t细胞和靶细胞作用后的细胞亚群变化情况；

图6为t细胞、cd19car-t细胞和il18cd19car-t细胞和靶细胞daudi的杀伤作用。

具体实施

本发明提供一种含有cd19car和il18的睡美人质粒转座系统电转入t细胞中，同时加入特定剂量的il2和anti-cd3/cd28磁珠抗体，从而获得共表达il18和cd19car的t细胞，并证明其在实体瘤治疗中的潜在应用。

本发明在实施例一提供了构建构建共表达il18和cd19的嵌合抗原受体分子cd19scfv-il18的方法。实施例二提供了将car分子转染入t的方法。实施例三提供了构建共表达il18的cd19car-t细胞，以及car-t细胞杀伤肿瘤靶细胞的能力。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例一

本实施例提供了构建共表达il18和cd19的嵌合抗原受体分子cd19car-il18的方法

cd19抗体scfv构建：通过基因合成cd19抗体fmc63基因片段(南京金斯瑞)，分别在fmc63上下游加入bamhi和xhoi限制性酶切位点，并将片段构建入puc57载体中；

fmc63-28bbz载体构建：通过bamhi和xhoi限制性内酶切对已有载体pcdh-cmv-csf2ra-trop2scfv-cd8α-cd28-4-1bb-cd3ζ-t2a-copgfp和puc57-fmc63载体进行双酶切，分别将目标酶切片段进行t4连接酶进行连接反应，最后得到pcdh-cmv-csf2ra-fmc63scfv-cd8α-cd28-4-1bb-cd3ζ-t2a-copgfp，随后通过in-fusionpcr将copgfp用il18进行置换得到pcdh-cmv-csf2ra-fmc63scfv-cd8α-cd28-4-1bb-cd3ζ-t2a-il18，简称pcdh-cmv-cd19car-il18。通过bagii上游引物和noti下游引物扩增得到带有bagii和noti的cd19car-il18片段，随后将该片段链接入bagii和noti双酶切的pt2/svneo载体中，从而获得pt2/svneo-cmv-cd19car-il18。

实施例二

本实例为cd19scfv-il18car-t细胞的制备

睡美人转座子重组质粒/转座酶系统：通过qiagen无内毒素质粒大抽提试剂盒抽提pt2/svneo-cmv-cd19car-il18以及睡美人的转座酶质粒sb11，将重组转座酶质粒sb11与重组转座子质粒pt-cmv-cd19car-il18按照质量比1:3的比例混合，从而得到共表达il18和cd19scfv的转座子重组质粒/转座酶系统。t细胞转导：按照easyseq试剂盒(stemcell)说明书分别分离t细胞，然后将t细胞在37℃培养3h，用t细胞培养基(superculture^tml100)和il2将病毒上清稀释2倍，将t细胞在该上清中过夜培养，之后再用superculture^tml100(含有il2)培养48h后备用。

共表达il18的cd19car-t细胞的制备：pt-cmv-cd19car-il18转座子及辅助转座酶sb11与peipro阳离子聚合物按照质量比1:4混合于无血清的t细胞培养基(superculture^tml100)，4℃放置15-30min，将混合物转染t细胞4-6h后，更换为正常无血清t细胞培养基，72h后用流式细胞术检测gfp的表达以检测car分子的转导效率，如图3所示，il18-cd19cart细胞上阳性率大约为50％；共培养8-10天，期间每3天换一次液，即可获得cd19scfv-il18阳性的cd19car-t细胞。收集t细胞、cd19car-t细胞、il18cd19cart细胞，分别提取总mrnaa，经pcr检测其细胞因子il18的表达情况，结果显示，在il18cd19car-t细胞中高表达il18，而另外两种t细胞中几乎没有表达，与实验设计一致，见图4。

实施例三

本实施例为表达il18的cd19car-t细胞体外对肿瘤细胞的杀伤作用。

在24孔细胞培养板中将daudi、nalm-6肿瘤细胞的密度调整为2×10⁵个/ml，向24孔板中加入500μl制备的cd19scfv-il18car-t细胞(数量为1×10⁵个)；类似地，将效应细胞：靶细胞比例(效：靶比)按照5:1、2.5:1、1:1、0.5:1、0:1、1:0的比例将效应细胞和靶细胞混合均匀(见表1)，并补充完全培养基至1ml，混合均匀正常培养6h。收集各组共培养后的细胞，用人抗cd19荧光抗体染色，经流式细胞分析cd19+阳性细胞百分比，与各组初始靶细胞百分比比较，计算得出各组靶细胞杀伤率。从流式细胞术散点从流式细胞术散点图中可以看出，杀伤6h后，cd19car-t细胞中还可以检测到明显的分群，而共表达il18cd19car-t细胞的共培养体系中，cd19+细胞群的比例显著降低(见图5)，计算结果表明，对照组(cd19car-t细胞)对靶细胞杀伤率50％，而共表达il18cd19car-t细胞杀伤效率达90％(见图6)。结果表明，il18表达的cd19car-t细胞具有很强的杀伤靶细胞的能力，既具有很强的抗肿瘤功能。

表1不同效应细胞和靶细胞的混合比例表

序列表

<110>杭州荣泽生物科技有限公司

<120>一种非病毒载体共表达il18的car-t细胞构建及其应用

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