本发明涉及药物耐药性诊断领域，更具体的说是涉及一种lncrna在作为肿瘤耐药性诊断试剂方面的应用以及试剂盒。
背景技术
近年来，我国结直肠癌发病率逐年上升，尤其在北京、上海等大城市，已稳居消化道肿瘤的第一位。肿瘤远处转移是影响结直肠癌预后的主要因素。一半以上的结直肠癌病人在原发灶确诊时或行根治性切除术后发生远处转移，且超过60％的结直肠癌患者死亡是由远处转移导致的，因此转移性结直肠癌治疗是临床工作中的重点和难点。
近年来，以西妥昔单抗(cetuximab)和贝伐单抗为代表的靶向药物的出现使转移性结直肠癌治疗进入到靶向治疗时代，开创了治疗模式转变的里程碑。众多靶向药物中，特异性靶向于egfr的cetuximab作为第一个通过美国fda正式批准，且首个进入了中国的应用于转移性结直肠癌的靶向药物，从一开始就引起了我们的关注。而2008年发现kras基因野生型者能从cetuximab治疗中获益更大，这无疑是对传统治疗模式的选择产生重要影响，使个体化治疗从愿望走到了现实。
在临床研究过程中，我们一方面认识到昂贵的cetuximab靶向治疗会给患者带来沉重的经济负担，另一方面发现并不是所有kras野生型的患者能从cetuximab治疗中获益。同时在2014年美国临床肿瘤年会(asco)上，诸多学者进一步报道kras基因野生型人群中，nras、braf、areg等基因的突变或异常表达同样影响cetuximab的疗效。可见深入研究cetuximab耐药的机制，并寻找潜在的能预测靶向治疗效果的生物标记物是十分迫切而有必要的。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于公开一种lncrna在作为肿瘤耐药性诊断试剂方面的应用以及提供一种能够简单快速高灵敏度检测直肠癌cetuximab耐药性的诊断试剂盒。
一种lncrna在作为肿瘤耐药性诊断试剂方面的应用，所述lncrna为lncrna-ac006159.3，该lncrna-ac006159.3的基因序列如seqidno:1所示。
进一步地，为在肿瘤cetuximab耐药性诊断试剂方面的应用。
进一步地，为在直肠癌cetuximab耐药性诊断试剂方面的应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种直肠癌cetuximab耐药性诊断试剂盒，所述的试剂盒包括：对lncrna-ac006159.3具有检测特异性的pcr引物。
作为本发明的进一步改进，所述pcr引物包括上游引物和下游引物，该上游引物为seqidno:2-4中的任意一条和所述下游引物为seqidno:5-7中的任意一条。
作为本发明的进一步改进，还包括pcr缓冲液、dntp、逆转录酶(m-mlv)、pcr反应混合物、rnase抑制剂、寡聚胸腺嘧啶引物、rox参比染料和rtaqdna聚合酶。
作为本发明的进一步改进，还包括有阳性对照物和阴性对照物，所述阳性对照物为正常细胞的lncrna-ac006159.3转录的cdna样品，所述cdna的序列为seqidno:8；阴性对照物为无lncrna-ac006159.3的灭菌双蒸水。
1、本发明通过检测患者直肠癌肿瘤组织样本和患者无生理病变部位组织样本中lncrna-ac006159.3的表达水平，对比可得到直肠癌cetuximab的耐药情况，肿瘤组织样本和无生理病变组织样本中lncrna-ac006159.3的表达比越低，则提供肿瘤组织样本者发生cetuximab耐药的可能性也就越高。
2、本发明采用的检测方法简单快速，通过检测比对患者直肠癌肿瘤组织样本和患者无生理病变部位组织样本，极大程度地减轻了肿瘤病人的痛苦。
3、通过本发明可以初步检测出病人在该阶段的耐药情况，其检测目标较为明确，相对其他通过基因突变来检测病人耐药的技术手段，其由于基因突变在病发过程中的变化性，本发明能快速的初步确定其耐药性的结果，以减少患者等待结果时间，争取最佳治疗时间，同时联合其它已有的直肠癌cetuximab耐药诊断技术，可有利于指导医生提出更加准确的治疗方案，以获得最佳疗效。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步的详述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本实施例1公开的一种直肠癌cetuximab耐药性诊断试剂盒，包括还包括pcr缓冲液、dntp、逆转录酶(m-mlv)、pcr反应混合物、rnase抑制剂、寡聚胸腺嘧啶引物、rox参比染料、和rtaqdna聚合酶、上游引物、下游引物、灭菌双蒸水；上游引物为seqidno:2-4中的任意一条；下游引物为seqidno:5-7中的任意一条，
优选的试剂盒中还含有阳性对照物和阴性对照物，其中阳性对照物为正常细胞的lncrna-ac006159.3转录的cdna样品，所述cdna的序列为seqidno:8；阴性对照物为无lncrna-ac006159.3的灭菌双蒸水。
实施例2公开一种直肠癌cetuximab耐药性的检测方法，采取直肠癌患者的外周血，按照常规方法从待测血液样品提取总rna，按照说明书的操作步骤进行提取，提取的rna浓度为10-100ng/μl，提好的总rna反转录成cdna，并将剩余rna保存于-80℃；
逆转录反应如下：
1.建立lncrna标准曲线
lncrna标准品既可以用于质量控制，又可以确定rna样品中lncrna的绝对数量。本发明的lncrna标准品是吉玛公司提供的人工合成序列，以1pmol干粉的贮存形式，
稀释：把装有rna标准品的管子于10000转/分钟离心1分钟。小心打开管盖，加入1ml无dna酶水将此rna标准品干粉稀释至1nm标准品，然后将该标准品十倍梯度稀释成0.1nm、1nm、10pm、1pm共4个梯度标准品。绝对定量时各取2μl标准品溶液至逆转录体系中，4个梯度分别代表每个pcr反应6×108、6×107、6×106、6×105个拷贝；0.1nm标准品也可以作为质控品与质检报告中给的对应ct值比较。
2.逆转录引物的稀释
试剂盒中提供的逆转录引物是10μm的贮存液，针对本发明提供的试剂盒，使用时将oligodt逆转录引物(eg.12μl)和polya逆转录引物(eg.12μl)混合，一起稀释10倍成1μm逆转录引物工作液(eg.加96μlrnasefreeh2o)，一次逆转录反应同时得到lncrna和rna的定量pcrcdna模板，获得和分开逆转录同样的效果。在一次标准的rna逆转录中，逆转录引物的终浓度为60nm。
3.逆转录反应体系的制备
20μl逆转录反应加样量体系
4.逆转录程序
取反应体系中的血液样品中提取的总rna为1-3μg，加入rnase抑制剂0.25μl，离心混匀后，70℃反应5分钟，立即置于冰上冰浴5分钟；依次加入以下各成分，pcr缓冲液4μl，10mmdntps0.75μl，rna酶抑制剂(20u/μl)1μl，稍离心混匀各成分，25℃反应30分钟；加mmlv逆转录酶(200u/μl)0.2μl，42℃反应30分钟；85℃5分钟灭活mmlv逆转录酶；迅速置于冰浴中5分钟，反转录得到的cdna可以4℃保存。
5.逆转录产物的操作
为了用于实时定量分析，混匀cdna并且从中吸取2μl(20μl体系)或者4μl(40μl体系)当作定量pcr的模板。
6.分别将已知拷贝数的lncrna-ac006159.3基因标准品梯度稀释至6×108、6×107、6×106、6×105个拷贝；
7.分别以步骤5所得的cdna和以步骤6梯度稀释的基因标准品为模板，加入pcr反应体系,其pcr反应体系包括如下物质：
特异性的pcr引物序列如下：
1f:gagaaaggcttagggctcagaaa
1r:tttagaaagtcacccattcacca
2f:cagaaaccgcacagagcaggagg
2r:tttagaaagtcacccattcacca
3f:tgaaataattctgcaagccagtg
3r:acattcatctatcctcctgctct
18srna内参引物序列如seqidno:9-10所示：
18s-f:accgcagctaggaataatgga
18s-r:caaatgctttcgctctggtc
反应体系为：pcr反应混合物10μl、特异性的pcr引物和18srna内参引物0.4μl、cdna模板2μl、5u/μltaq酶0.2μl、rox参比染料(50×)0.4μl、去离子水7μl，组成共20μl体系。
反应条件：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，62℃退火40秒，40个循环。1％琼脂糖凝胶电泳，其琼脂糖凝胶含有sybrgreeni荧光染料，进行点样电泳，用软件genesnap拍摄凝胶电泳条带图像，软件genetools进行灰度值分析，以目的条带与内参照条带的比值(lncrna-ac006159.3/gapdh)代表目的基因lncrna-ac006159.3相对水平。
8.检测结果分析：根据检测模板的循环阈值(ct值)与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，将各个标准品的初始拷贝数取对数作为横坐标，将其所对应的循环阈值为纵坐标，做出相应的标准曲线，再根据待测cdna的循环阈值对其含有的目标基因的初始拷贝数进行分析，从标准曲线上读取其含有的目标基因的初始拷贝数。
实施例3：本发明直肠癌cetuximab耐药性的检测方法准确性试验
(1)构建单纯cetuximab耐药的肠癌细胞株，即选用kras野生型，且在100μg/ml浓度cetuximab作用下抑制率达到50％以上的肠癌细胞系caco2与ht29细胞，采用逐步增加剂量法诱导建立cetuximab耐药细胞株，标记为caco2-cr与ht29-cr。
(2)对cetuximab敏感组的原发灶肠癌细胞株以及cetuximab耐药诱导前后的caco2-cr与ht29-cr细胞株进行lncrna-ac006159.3定量表达谱的分析，其结果表示caco2-cr与ht29-cr细胞株的cetuximab的lncrna-ac006159.3表达量大大低于敏感组的原发灶肠癌细胞株的lncrna-ac006159.3表达量。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<120>一种lncrna在作为肿瘤耐药性诊断试剂方面的应用以及试剂盒
<141>2018-07-24
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
<211>694
<212>rna
<213>artificialsequence
<400>2
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