具有活性氧和pH双重响应性及电荷反转特性的智能基因载体的制备方法与流程

本发明属于生物医用高分子基因缓控释技术领域，是一种利用原子转移自由基聚合方法(atrp)，将具有不同功能组分的链段聚合成一整段阳离子高分子，进而与脱氧核糖核酸(dna)通过正负电荷相互作用自组装成纳米粒子。

背景技术：

原子转移自由基聚合技术(atrp)，是以简单的有机卤化物为引发剂、过渡金属配合物为卤原子载体，通过氧化还原反应，在活性种与休眠种之间建立可逆的动态平衡，从而实现了对聚合反应的控制。atrp聚合体系的引发剂主要是卤代烷rx(x＝br,cl)，苄基卤化物，α-溴代酯，α-卤代酮，α-卤代腈等，另外也有采用芳基磺酰氯、偶氮二异丁腈等。

原子转移自由基聚合技术是近几年迅速发展并有着重要应用价值的一种活性聚合技术，可有效地对聚合物的分子结构进行设计，制备出各种不同性能、不同功能的新型聚合物材料,即所谓的“量体裁衣”。它可以通过分子设计制得多种具有不同拓扑结构(线型、梳状、网状、星形、树枝状大分子等)、不同组成和不同功能化的结构确定的聚合物及有机/无机杂化材料。与离子聚合等传统活性聚合技术相比，它具有单体覆盖面广，聚合条件温和，易于实现工业化等显著优点，将成为合成新型高分子材料的一个新方向。其产品在高性能粘合剂、分散剂、表面活性剂、高分子合金增溶剂和加工助剂、热塑性弹性体、绿色化学品、电子信息材料及新型含氟材料等高技术领域都具有广泛的应用前景。atrp的独特之处在于使用了卤代烷作引发剂，并用过渡金属催化剂或退化转移的方式，有效地抑制了双基终止反应。

与传统的活性聚合如阴或阳离子聚合和基团转移聚合(gtp)相比，atrp可以同时适用于非极性和极性单体，如苯乙烯(st)、二烯烃类和(甲基)丙烯酸酯类单体，可以制备包括无官能团的均聚物及无规、嵌段、星形和梯度共聚物与超支化物(hyper-brench)、树枝状物(dentrimer)在内的诸多结构清晰的高分子化合物，其相对分子质量可以控制在10³～10⁵、mw/mn在1.05～1.5之间。

本发明中涉及的自组装技术是通过非化学键链接形成的纳米结构，包括静电引力，氢键作用，主客体包络作用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种具有活性氧和ph双重响应性及电荷反转特性的智能基因载体的制备方法，该制备方法工艺简单、成本低廉且易于实施。

本发明的技术方案:

一种具有活性氧和ph双重响应性及电荷反转特性的智能基因载体的制备方法，所述智能基因载体为将2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯(deaea)、2-(5,5-二甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基丙烯酸酯(dmdea)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)三种单体以原子转移自由基聚合技术(atrp)进行共聚形成高分子(pd-pdm-pg)，再以4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和乙二胺化β-环糊精(cden)分别对pd和gma端进行修饰，得到高分子聚合物(bp-pdm-pg)，最后通过主客体作用，引入四苯基乙烯，得到最终纳米载体(bp-pdm-pg(tpe))，制备步骤如下：

1)将deaea、dmdea和gma按摩尔比1:2:1进行投料，并根据聚合度依次加入1当量的引发剂2-溴异丁酰溴、1.5当量的联吡啶和1当量的溴化亚铜(cubr)，溶解于适量无水二甲基甲酰胺(dmf)中，氮气保护下80℃反应24小时，反应粗产物经过冷却，柱洗脱和沉淀纯化处理后，得到共聚高分子产物(pd-pdm-pg)；

2)将上述pd-pdm-pg溶于无水dmf中，分别加入4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，室温过夜搅拌，再分别加入乙二胺化β-环糊精(cden)和乙二胺，70℃各反应24小时，去离子水透析3天，冻干后得到bp-pdm-pg，取适量bp-pdm-pg与苯硼酸化四苯基乙烯(tpedb)，室温摇床过夜搅拌，即得到纳米智能基因载体(bp-pdm-pg(tpe))。

所述β-环糊精(β-cd)为7个葡萄糖单元分子组成的大环分子；所述乙二胺与pd-pdm-pg的投料摩尔比为100:1。

进一步的，步骤1)中聚合度指的是单体与引发剂之间的摩尔比，柱洗脱为中性氧化铝柱，以去除反应中生成的铜盐。

进一步的，步骤2)中dmf的用量为30ml，在上述溶液中先加入4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，其比例与pd-pdm-pg的质量比为2:1。

本发明的优点是：

该胶束制备方法形成的两亲性共聚高分子(bp-pdm-pg)中环糊精的引入可以有效抑制阳离子高分子的毒性作用，增加生物相容性。同时，再通过主客体作用，修饰上具有光敏性和聚集发光效应的四苯基乙烯衍生物。同时该方法简便易行、成本低廉，可广泛应用于材料学、生物学、医学等领域，既可以控制dna的释放，可控的光调节活性氧的生成，并可通过荧光来追踪载体。

附图说明

1)图1为纳米智能基因载体的设计和作用机理；

2)图2为bp-pdm-pg的核磁氢谱；

3)图3为bp-pdm-pg(tpe)的粒径分布和扫描电镜图；

4)图4为bp-pdm-pg(tpe)的荧光谱图；

5)图5为a)bp-pdm-pg(tpe)光照下的zeta电势和b)酸性条件下的粒径变化图

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

附图1给出了本发明纳米智能基因载体设计和作用机理，由附图1可知，本发明运用atrp聚合法，将活性氧响应性单体deaea、ph酸性响应性单体dmdea和gma单体共聚成聚合物，再通过4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和cden对共聚物进行修饰，进而以主客体作用将苯硼酸化四苯基乙烯(tpedb)引入，得到两亲性智能纳米基因载体(bp-pdm-pg(tpe))。

本发明中涉及的自组装技术是通过非化学键链接形成的纳米结构，包括静电引力，氢键作用，主客体包络作用。

下面给出本发明具体实例阐述:

将3.6mmolgma、7.2mmoldeaea和3.6mmoldmdea三种单体以及0.12mmol2-溴异丁酰溴、0.18mmol联吡啶和0.12mmol溴化亚铜溶解于10ml无水dmf中，氮气保护下80℃反应24小时，粗产物冷却至室温，用50ml四氢呋喃(thf)稀释并以其作为流动相通过中性氧化铝柱洗脱除去铜盐，然后利用旋转蒸发仪除去多余溶剂，浓缩粗产物，再在冷的正己烷中沉淀三次，得到pd-pdm-pg。

将上述pd-pdm-pg溶解于30mldmf中，加入3倍质量的cden，70℃反应24小时，其目的是将pd-pdm-pg中的pg链段修饰上β环糊精(β-cd)，所述β-环糊精(β-cd)为7个葡萄糖单元分子组成的大环分子。随后加入10ml的乙二胺，其中乙二胺与pd-pdm-pg的投料摩尔比为100:1，继续反应24小时，其目的是将未修饰上β-cd的pg链段上的环氧基团进行开环反应，提高亲水性能；待反应冷却至室温后，加入2倍质量的4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，室温反应一天，其目的是在pd-pdm-pg的pd链段上修饰上具有活性氧响应的苯硼酸频哪醇酯，该组分由于对活性氧具有高灵敏性，因此具有电荷反转的特性；然后在去离子水中透析3天，除去未反应的杂质小分子和低聚产物，然后冻干即得bp-pdm-pg；再将40μltpedb溶液(10mm)滴加到2mgml^-1bp-pdm-pg溶液中(ph7.4，pbs)，室温摇床反应12小时，得到bp-pdm-pg(tpe)，这是由于β-cd具有特有的疏水空腔，可利用主客体作用，将具有聚集诱导效应和光催化产生活性氧特性的tpedb小分子缀合到β-cd的空腔中。

图2为本发明bp-pdm-pg的核磁氢谱。

该图说明：本发明运用atrp聚合法和小分子功能修饰成功合成出了具有活性氧和ph酸性响应及电荷反转特性的bp-pdm-pg共聚物。

图3给出了本发明bp-pdm-pg(tpe)与dna复合后复合体的粒径分布和扫描电镜图。

该图说明：本发明最终制备的智能基因载体是形状规则，分布单一的纳米级的粒子，因此具有优良的基因运载与传递功能，并具备了临床应用的潜力。

图4为bp-pdm-pg(tpe)的荧光谱图。

该图说明：证实tpe通过主客体作用与环糊精相互作用并产生聚集诱导发光效应，表明具有荧光成像的功能。

图5为a)bp-pdm-pg(tpe)光照下的zeta电势和b)酸性条件下的粒径变化图。

该图说明：证明bp-pdm-pg(tpe)高分子是具有活性氧和ph酸性响应性，并且具有光敏和电荷反转的特性，表明其可以在癌症细胞内保证基因有效的释放。