大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性分析方法与流程

本发明涉及生物科学
技术领域：
，尤其是涉及大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性分析方法。技术背景大黄鱼(larimichthyscrocea)广泛分布于我国东南沿海，俗称“黄花鱼”，肉质鲜嫩爽滑，营养价值高，是百姓餐桌上的常见食用鱼，在经历了从资源紧缺状态到后来大规模人工养殖以及大力开拓国内外市场后，大黄鱼的经济地位不断提升，其人工养殖也越来越受到广泛关注，但养殖大黄鱼通常离不开抵抗病原菌的问题，因而免疫相关基因的开发和利用尤显重要。基于大黄鱼的全基因组测序的完成，人们对大黄鱼的基因研究上了一个新台阶，大黄鱼先天性免疫基因特征也逐渐被解析，其中作为免疫防御第一防线的模式识别受体(patternrecognitionreceptors，prrs)尤为关键，该类分子通过两种模式防止感染和识别内部损伤：即病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，pamps)和损伤相关分子模式(damage-associatedmolecularpatterns，damps)。清道夫受体(scavengerreceptors，srs)是第一个被描述的prrs，srs是多种结构功能各异的蛋白分子的统称，能结合、转移、在细胞内降解乙酰化/氧化修饰的低密度脂蛋白(acetylatedlowdensitylipoproteins，acldl/oxidisedlowdensitylipoproteinsoxldl)，并能与多种配体结合发挥不同作用。目前发现的清道夫受体大致有a到h共8类，称为清道夫受体家族，另有i、j类仍处于探索阶段。该家族成员在内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、血细胞、破骨细胞、脂肪细胞、树突状细胞、血小板等细胞中发现清道夫受体家族成员表达调控。根据中心法则，密码子是将核酸序列信息转变为蛋白质序列信息最为直接的载体，在生物体的遗传密码中，每一个密码都会对应一种氨基酸，除终止密码子uaa、uag和uga外(翻译终止信号)，一共61个遗传密码分别对应20种不同的氨基酸，由于甲硫氨酸(aug)和色氨酸(ugg)只有一种密码子，其他氨基酸都会有2个及以上的简并密码子，共59种不同的同义密码子，最多时1个氨基酸对应6种密码子。所有密码子都可被细胞质中的trna所识别，继而完成整个蛋白质翻译过程。编码同一种氨基酸的密码子在翻译过程中并非均一使用的，会出现一定的不均衡性，即对于某种氨基酸而言，会出现某个或某几个密码子被广泛使用的现象，因此不同生物体对基因编码蛋白质的密码子选择具有一定的偏好性，被优先使用的密码子也称为最优密码子。该现象广泛存在，是物种长期进化选择性的产物，是为了保证翻译准确而高效地进行下去的产物，一定程度上促进物种分离、进化进而慢慢产生新物种。解析密码子的偏好性可以帮助人们改造基因以及实现高效表达。大黄鱼全基因组已经基本解析完成，在基因组水平上对密码子的使用情况进行全面了解十分必要。因此，对大黄鱼清道夫受体基因的密码子偏好性进行分析，可为后续该类蛋白表达奠定基础。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种简单可行，可准确地判断大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性，更好地帮助认识清道夫受体家族基因特征，在后续改造基因以及实现其高效表达中发挥重要作用的大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性分析方法。本发明针对
背景技术：
：中提到的问题，采取的技术方案为：大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性分析方法，包括，获得大黄鱼清道夫受体家族基因；利用密码子偏好性分析软件codonw统计所有基因的第三位密码子频率和密码子第三位为g或c的频率，同时计算所述受体家族基因的偏好性指数，得出清道夫受体家族在进化中的密码子偏好性使用情况；其中，获得的清道夫受体家族基因中有a家族中的scara3、scara5和marco；b家族中的scarb1和cd163；d家族中的cd68；f家族中的srec-i和srec-ii共8个基因。本发明分析方法简单可行，可准确地判断大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性，可以更好地帮助认识清道夫受体家族基因特征，在后续改造基因以及实现其高效表达中发挥重要作用。作为优选，获得的scara3、scara5、marco、scarb1、cd163、cd68、srec-i和srec-ii的cdna外显子长度分别为1938bp、1677bp、1218bp、1527bp、1086bp、972bp、3024bp、2832bp。作为优选，偏好性指数包括gc含量和gcn。每个生物在长期进化过程中都会形成一种特定的密码子使用模式，其中gc含量是生物基因组中碱基组成的一个重要指标，在基因组的演变中具有重要意义，gc含量往往反映了方向性突变的强弱，尤其是同义密码子的主要差别体现在第3位碱基上(gc3s)，由于密码子第3位上碱基受到的突变压力较小，因此选择gc3s作为分析密码子使用模式的一个重要参数。作为优选，偏好性指数还包括相对同义密码子使用度(relativesynonymouscodonusage,rscu)、密码子适应指数(codonadaptationindex，cai)、有效密码子数(effectivenumberofcodon，enc)、密码子偏爱指数(codonbiasindex，cbi)、密码子偏好参数(codonpreferenceparameter，cpp)、对应分析(correspondenceanalysis，ca)、高频密码子(high-frequencycodon)、高表达密码子(high-expressioncodon)、最优密码子使用频率(frequencyofoptimalcodons，fop)。本发明利用上述偏好性指数参数指标对大黄鱼清道夫受体全家族八个基因进行相关性分析及主成分分析，能够获得清道夫受体分子密码子偏好性使用情况，为后续该类蛋白表达奠定基础。作为优选，分析方法还包括大黄鱼清道夫受体家族的表达调控分析，具体步骤为：1)大黄鱼腹腔注射溶藻弧菌菌液，收集大黄鱼各类样品，提取总rna；2)采用荧光定量pcr法，以β-actin为内参，分析大黄鱼清道夫受体家族基因mrna在组织中的组织差异表达分布。清道夫受体家族各基因虽然功能相近，但其在受感染后的表达上存在明显差异，很大程度上是由于密码子使用模式的不同造成的。进一步作为优选，β-actin为：β-actin-f：5'-tcgtctgtcgtcacagccatcag-3'；β-actin-r：5'-atgccgtgcggcagagcataacc-3'。进一步作为优选，qrt-pcr引物为：scara3-f：5'-gaccaccgactggcagaactac-3'；scara3-r：5'-ctgcgttggatggtcgtctg-3'；scara5-f：5'-cctgggttggtaggattgaga-3'；scara5-r：5'-ccgttcaccagacgcacc-3'；marco–f：5'-gcgatgacaccctccaaactc-3'；marco-r：5'-tccgttgtcaccctttagtcc-3'；scarb1-f：5'-cggtgatgatggagaagttgc-3'；scarb1-r：5'-tgaggagtccgccagtaggtc-3'；cd163-f：5'-tcaggctggtgaatgggtcta-3'；cd163-r：5'-ggtccagcgaaagccatcc-3'；cd68-f：5'-gtgcctgttggctcagatgg-3'；cd68-r：5'-ccagcaatgtcactcccacc-3'；srec-i-f：5'-cgcccgtgctcgtctggttat-3'；srec-i-r：5'-catcagccacagttgccgtac-3'；srec-ii-f：5'-cactactgcggcactctatg-3'；srec-ii-r：5'-gggagccattgacttctgc-3'。作为优选，pcr扩增反应体系为：primer-f0.8μl，primer-r0.8μl，premixextaqtmⅱ(takara)10μl，cdnasample(100ng/μl)0.8μl，roxii0.4μl，ddh2o7.2μl。作为优选，pcr扩增反应程序为：95℃预变性1min，95℃变性10s，65℃延伸45s，共40个循环。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明分析方法简单可行，可准确地判断大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性，可以更好地帮助认识清道夫受体家族基因特征，在后续改造基因以及实现其高效表达中发挥重要作用；本发明利用偏好性指数参数指标对大黄鱼清道夫受体全家族八个基因进行相关性分析及主成分分析，能够获得清道夫受体分子密码子偏好性使用情况，为后续该类蛋白表达奠定基础。附图说明图1为本发明实施例1中大黄鱼清道夫受体家族有效密码子数(enc)-gc3；图2为本发明实施例1中大黄鱼清道夫受体家族gc总含量、gc1、gc2和gc3汇总；图3为本发明实施例1中同义密码子ending图及主成分分析与gc3；图4为本发明实施例1中大黄鱼清道夫家族各基因表达量及对照组。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性分析方法，包括，获得大黄鱼清道夫受体家族基因；利用密码子偏好性分析软件codonw统计所有基因的第三位密码子频率和密码子第三位为g或c的频率，同时计算所述受体家族基因的偏好性指数，得出清道夫受体家族在进化中的密码子偏好性使用情况；上述获得的清道夫受体家族基因中有a家族中的scara3、scara5和marco；b家族中的scarb1和cd163；d家族中的cd68；f家族中的srec-i和srec-ii共8个基因。该分析方法简单可行，可准确地判断大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性，可以更好地帮助认识清道夫受体家族基因特征，在后续改造基因以及实现其高效表达中发挥重要作用。所使用的软件有codonw(http://www.mybiosoftware.com/codonw-1-4-4-codon-usage-analysis.html)、emboss6.3.1的cusp(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#welcome)、matlab(http://www.brothersoft.com/matlab-for-bioinformatics-385045.html)、excel2013、spss16.0、origin8等软件。上述获得的清道夫受体家族基因中有a类中的scara3、scara5和marco、b类中的scarb1和cd163、d类中的cd68、以及f类中的srec-i和srec-ii共8个基因。上述获得的scara3、scara5、marco、scarb1、cd163、cd68、srec-i和srec-ii的cdna外显子长度分别为1938bp、1677bp、1218bp、1527bp、1086bp、972bp、3024bp、2832bp。上述偏好性指数包括gc含量和gcn。每个生物在长期进化过程中都会形成一种特定的密码子使用模式，其中gc含量是生物基因组中碱基组成的一个重要指标，在基因组的演变中具有重要意义，gc含量往往反映了方向性突变的强弱，尤其是同义密码子的主要差别体现在第3位碱基上(gc3s)，由于密码子第3位上碱基受到的突变压力较小，因此gc3s通常被作为分析密码子使用模式的一个重要参数。上述偏好性指数还包括相对同义密码子使用度(relativesynonymouscodonusage,rscu)、密码子适应指数(codonadaptationindex，cai)、有效密码子数(effectivenumberofcodon，enc)、密码子偏爱指数(codonbiasindex，cbi)、密码子偏好参数(codonpreferenceparameter，cpp)、对应分析(correspondenceanalysis，ca)、高频密码子(high-frequencycodon)、高表达密码子(high-expressioncodon)、最优密码子使用频率(frequencyofoptimalcodons，fop)。利用上述偏好性指数参数指标对大黄鱼清道夫受体全家族八个基因进行相关性分析及主成分分析，能够获得清道夫受体分子密码子偏好性使用情况，为后续该类蛋白表达奠定基础。其中，a)大黄鱼清道夫受体家族相对同义密码子使用度分析用codonw软件分析得到大黄鱼清道夫受体全家族cdnas序列的rscu值，结果如表1所示。scara3、scara5、marco、scarb1、cd163、cd68、srec-i、srec-ii有偏好性(rscu>1)的密码子分别分别为25、25、25、26、24、24、31、29个。其中，scara3的tag(终止密码子)、aga、ctg、cca，scara5的taa(终止密码子)、ctg、cct、atc、gtg，marco的tag(终止密码子)、atc、ctg、agg、acc、gtg，scarb1的ctg、aga、gtg，cd163的taa(终止密码子)、ctg、agg、cca、gct、gga、aga，cd68的ctg、tga(终止密码子)、tct、gtg、atc、cct、cag、agg，srec-i的taa(终止密码子)、ctg和srec-ii的taa(终止密码子)、ctg的rscu值≥2，有较高的偏好性。而scarb1中的ctg的rscu值最高，为3.23。综合八个基因较高偏好性(rscu值≥2)的密码子都有ctg(表达为亮氨酸)，一般表达为亮氨酸的密码子共有6个，说明清道夫受体家族基因在编码亮氨酸的使用上有明显的偏好性。分别统计八个基因的有偏好性的密码子(rscu值>1)和较高偏好性(的密码子rscu值≥2)第三位密码子的碱基类型(以g/c结尾或以a/t结尾)见表2。scara5、marco、scarb1、cd68、srec-ⅰ和srec-ⅱ密码子偏好以g/c结尾，其中marco和cd68基因有较高偏好性的密码子中明显偏向以g/c结尾，而cd163有较高偏好性的密码子中则多以a/t结尾。表1清道夫受体家族相对同义密码子使用度(rscu)分析表2清道夫受体家族相对同义密码子使用度(rscu)相关分析b)密码子适应指数根据codonw软件的分析，scara3、scara5、marco、scarb1、cd163、cd68、srec-i、srec-ii的密码子适应指数(cai)分别为0.2370、0.2590、0.2120、0.2720、0.2130、0.2630、0.2400、0.2660，将这组数据与其平均值0.2453做单样本t检验(sig>0.05)，说明大黄鱼清道夫受体家族基因的cai之间差异不大，且cai在0-1之间小于中间值0.5，表示其偏好性不强。c)有效密码子数与gc3大黄鱼清道夫受体全家族各成员的enc范围为47.42-53.04(enc值小于30或大于55的基因被认为是高表达基因或低表达基因)，说明其密码子偏好性较弱，其表达量一般；其gc3含量在54％-71％之间浮动较大，说明其第三位密码子偏好以g/c结尾。做enc与gc3相关分析如图1，曲线为标准曲线：enc＝(2+gc3s+29)/[gc3s2+(1-gc3s)2]。如果密码子的使用仅由gc3决定，则散点应该落入标准曲线上或者距离相近；而实际上全部散点都落在曲线下方，且距离曲线较远，说明其它因素对其密码子使用的影响非常大。d)gc和gcn从cusp获取大黄鱼清道夫受体家族八个基因的gc总含量、gc1、gc2和gc3，汇总作图2。全家族基因gc总含量均大于50％，多数基因gc1、gc2和gc3都在0.5以上，且gc2含量一般低于gc1和gc3。所有基因的gc3含量都超过50％，多在50％-60％之间，只有scarb1基因的gc3含量高达70.53％。gc总含量、gc1、gc2和gc3相关分析见表3。清道夫受体家族中gc1与gc总量之间相关性达到显著水平，而其余项相关性较弱。表3大黄鱼清道夫受体家族gc总含量、gc1、gc2和gc3的相关性分析gc1gc2gc3gcgc11gc20.0741gc3-0.123-0.6371gc0.743*0.4700.0491*在0.05水平(双侧)上显著相关e)密码子偏好参数分析scara5、marco、scarb1、cd68、srec-ⅰ和srec-ⅱ的cpp值分别为：4.0100、4.9865、5.1677、3.8336、4.8184、4.3314、5.4837、和5.2393，在0-18中小于中间值9，且更接近0，表示偏好性不强。f)主成分分析及对应分析基于59个同义密码子的相对同义密码子使用度(rscu)，对大黄鱼清道夫受体家族八个基因进行主成分分析，得到两个主成分，记为pca1和pca2。将59个同义密码子按照以a、t、g、c结尾分类，以各个同义密码子对应的pca1和pca2值为横纵坐标做ending散点图(图3中a)，可以看出以g/c结尾的同义密码子大部分分布在y轴右侧，以a/t结尾的同义密码子大部分分布在y轴左侧。再以pca1为横坐标，pca2为纵坐标做散点图，标为三角形，另取清道夫受体家族各基因的gc3为第二纵坐标做散点图，标为圆形，分别做两个散点图的拟合线交于一点(图3中b)，说明gc3含量对两个主成分存在较为重要的影响作用，结合ending图结果，说明可能为主成分之一。g)高表达密码子、高频密码子和最优密码子使用频率a.高表达密码子根据表4的高表达和低表达基因的rscu值之差并用卡方检验，得出：ctt、ctc、att、gtc、tcc、agt、ccc、cca、act、gca、tat、taa、cac、caa、aac、cgt、cga、ggt、ggc高低表达差异较为明显，并最终确定ctc、att、gtc、tcc、cca、gca、cac、caa、aac、ggc共10个密码子为高表达密码子。b.高频密码子计算所有相对同义密码子使用频率及其占总频率的比例，超过60％的记为高频密码子。综合八个基因的高频密码子都有aac(编码天冬酰胺，asn)，它的同义密码子是aat，但aat出现的频率远远低于aac，推测可能是由于清道夫受体家族密码子偏好以g/c结尾。以上除了终止密码子能达到100％的使用频率之外，cd68中的cag密码子也达到100％。cag是编码谷氨酰胺(gln)的密码子，与gaa互为同义密码子，此密码子在清道夫受体家族的其他成员中均为高频密码子(marco基因除外，但也非常接近，为59.3％)，但只有在cd68基因中仅有cag而没有gaa，推测是cd68基因的特殊使用偏好。c.最优密码子的确定和最优密码子使用频率为了减少误差，结合高表达密码子和高频密码子的结果，最终确定aac、cac为清道夫受体的最优密码子。其使用频率(fop)直接由codonw软件得出，scara3、scara5、marco、scarb1、cd163、cd68、srec-i、srec-ii的最优密码子使用频率分别为：0.4740、0.5180、0.4910、0.5530、0.4500、0.4910、0.4630和0.4790。该指标与密码子偏爱指数等其他参数指标做相关性分析。h)各参数相关性分析将所得到的gc3、gc、密码子适应指数(cai)、密码子偏爱指数(cbi)、密码子偏好参数(cpp)、最优密码子使用频率(fop)、有效密码子数(enc)的值汇总，进行相关性分析(表5)。结果表明大黄鱼清道夫受体家族基因的gc3含量与cbi、fop，以及cbi和fop之间的相关性达到极显著水平(p<0.01)。gc3含量与cbi的相关系数r为0.953，gc3含量与fop的相关系数r为0.980，cbi与fop的相关系数为0.986。所以密码子偏爱指数(cbi)与最优密码子使用频率(fop)的相关性最强。说明密码子偏爱选择最优密码子，且这种偏好以及最优密码子的来源于密码子第三位碱基的gc含量也密切相关。此外，还发现几组负相关参数：gc3与cpp和enc、gc含量与cai、cai与enc、cbi与cpp和enc、cpp与fop、以及fop与enc。但是这些负相关均不显著，未有定论。表4清道夫受体家族高/低表达样本组的密码子使用与最优密码子的确定和验证表57个参数相关系数显著性检验表gc3gccaicbicppfopencgc31gc0.0491cai0.672-0.4131cbi0.953**0.0510.5291cpp-0.4380.632-0.324-0.5661fop0.980**0.070.6290.986**-0.4851enc-0.3460.021-0.148-0.5010.343-0.4281**在0.02水平(双侧)上显著相关密码子偏好性是解析密码子使用模式的一种参考，基于密码子多态性的阅读规则，第三位密码子的碱基尤显重要。研究发现，以g/c结尾的密码子有更高的结合能，因而更有利于转录表达，长期生物进化容易选择使用这种能保证翻译准确性的密码子。本研究发现大黄鱼清道夫受体家族的密码子都偏好以g/c结尾，尤其是scarb1基因。通常来说，高表达的密码子使用偏性也越大。本实施例得到的高表达密码子有ctc、att、gtc、tcc、cca、gca、cac、caa、aac、ggc，对照其rscu值都比较高。本实施例研究密码子偏好性使用了相对同义密码子使用度(rscu)、密码子适应指数(cai)、有效密码子数(enc)、密码子偏爱指数(cbi)、gc(％)含量、gcn、密码子偏好参数(cpp)、对应分析(ca)、高频密码子、高表达密码子和最优密码子使用频率(fop)共11个参数指标。其中cai、enc、cbi、cpp均得出偏好性不强的结果，但cbi的结果能直接通过codonw软件获得并且cbi与gc3、fop极显著相关(p<0.01)，因而更具参考价值。此外，rscu、高频密码子、高表达密码子和fop的分析针对基因偏好使用的特定密码子，而ca主要分析影响同义密码子rscu的主要因素。上述分析方法还包括大黄鱼清道夫受体家族的表达调控分析，具体步骤为：1)大黄鱼腹腔注射溶藻弧菌菌液，收集大黄鱼各类样品，提取总rna；2)采用荧光定量pcr法，以β-actin为内参，分析大黄鱼清道夫受体家族基因mrna在组织中的组织差异表达分布。。清道夫受体家族各基因虽然功能相近，但其在受感染后的表达上存在明显差异，很大程度上是由于密码子使用模式的不同造成的。其中，β-actin为：β-actin-f：5'-tcgtctgtcgtcacagccatcag-3'；β-actin-r：5'-atgccgtgcggcagagcataacc-3'。其中，qrt-pcr引物为：scara3-f：5'-gaccaccgactggcagaactac-3'；scara3-r：5'-ctgcgttggatggtcgtctg-3'；scara5-f：5'-cctgggttggtaggattgaga-3'；scara5-r：5'-ccgttcaccagacgcacc-3'；marco–f：5'-gcgatgacaccctccaaactc-3'；marco-r：5'-tccgttgtcaccctttagtcc-3'；scarb1-f：5'-cggtgatgatggagaagttgc-3'；scarb1-r：5'-tgaggagtccgccagtaggtc-3'；cd163-f：5'-tcaggctggtgaatgggtcta-3'；cd163-r：5'-ggtccagcgaaagccatcc-3'；cd68-f：5'-gtgcctgttggctcagatgg-3'；cd68-r：5'-ccagcaatgtcactcccacc-3'；srec-i-f：5'-cgcccgtgctcgtctggttat-3'；srec-i-r：5'-catcagccacagttgccgtac-3'；srec-ii-f：5'-cactactgcggcactctatg-3'；srec-ii-r：5'-gggagccattgacttctgc-3'。其中，pcr扩增反应体系为：primer-f0.8μl，primer-r0.8μl，premixextaqtmⅱ(takara)10μl，cdnasample(100ng/μl)0.8μl，roxii0.4μl，ddh2o7.2μl。其中，pcr扩增反应程序为：95℃预变性1min，95℃变性10s，65℃延伸45s，共40个循环，反应结束后，温度从55℃缓慢升到95℃，制备熔解曲线。实验设置无模板对照和阴性对照，每个反应3个重复。其中，实验大黄鱼(体长20-30cm，体重350-400g)取自浙江舟山东极养殖场，于25℃洁净海水中暂养1周，每天换新鲜海水。随后将大黄鱼随机分为2组，每组30条，其中实验组腹腔注射100μlpbs重悬的鳗弧菌菌液(ph7.4，1×108cfu/ml)，对照组注射100μlpbs(ph7.4)。收集注射后0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h的肝脏组织提取总rna。大黄鱼清道夫受体家族各基因mrna在感染溶藻弧菌后0、6、12、24、48和72h的表达量与对照组的结果如图4。各基因表达模式各不相同，但scara5和marco基因均在24-72h有极高表达量，srec-ⅱ在6-12以及48h有极高表达。除了scara3和cd163在0-72h表达量仅有小量增幅外，其余基因的表达上升明显。其中scara5、marco、scarb1和cd68在24h时表达量最高，而srec-ⅰ在12h时表达量最大，srec-ⅱ在6h时表达量最大，而scara3、scara5和cd163在6h时表达无显著上升现象。可以说明清道夫受体家族各基因虽然功能相近，但其在受感染后的表达上存在明显差异，很大程度上是由于密码子使用模式的不同造成的。本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>浙江海洋大学<120>大黄鱼清道夫受体家族基因的密码子偏好性分析方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>引物(artificialsequence)<400>1tcgtctgtcgtcacagccatcag23<210>2<211>23<212>dna<213>引物(artificialsequence)<400>2tcgtctgtcgtcacagccatcag23当前第1页12