本发明涉及一种口腔黏膜细胞基因组dna快速提取方法,属于生物技术领域。
背景技术:
市面上针对口腔黏膜细胞基因组dna的提取试剂盒很多,大部分试剂盒的dna提取质量od260/od280都保持在1.8左右,为了增加dna的提取量,可能涉及多个步骤,因此成本和抽提时间都会增加。
随着检测技术的不断发展,仪器本身的灵敏度增加,成本较低、操作简洁、耗时较短,并且所获得dna能符合绝大部分平台的方法成为绝大部分基因检测行业者的首选。
技术实现要素:
本发明的目的是解决现有技术存在的问题,提供一种口腔黏膜细胞基因组dna快速提取方法。
本发明的技术方案如下:
一种口腔黏膜细胞基因组dna快速提取方法,包括如下步骤:
1)取450-500μl的naoh(50mm)加入到试管中,涡旋混匀10-45s,95℃放置5-6min;
2)室温放置2-5min后瞬离,用镊子取出拭子,并将55-60μltris-hcl(20mm)溶液加入管中,涡旋混匀10-15s;12000rpm离心1min,取45-50μl上清;
3)将90-95μl磁珠加入至装有上述上清的pcr管中,轻轻吸打混匀6次,室温静置孵育5-10min,将pcr管置于磁力架上3-5min;
4)移除上清,将pcr管继续放置于磁力架上,向pcr管中加入300-350μl75%乙醇溶液,分2次旋转管子180度,静置30s;
5)移除上清,再向pcr管中加入300-350μl75%乙醇溶液,分2次旋转管子180度,静置30s后彻底移除上清;
6)室温静置2-5min,使残留乙醇彻底挥发;
7)加入10-12μl的nucleasefreewater,把pcr管从磁力架取下,轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡,室温静置2min;
8)将pcr管置于磁力架上2min;用移液器吸取10μl左右上清液,转移到新的pcr管中,在反应管上标记样本编号。
本发明的方法中,主要包括如下创新点:
相对于现有的方法,省略了试剂且应用效果良好。现有的dna提取一般采用试剂盒提取,试剂盒通常对应多种平台,因此试剂盒中包括的试剂种类较多,成本较高。本发明的方法专门针对massarray平台,只涉及了4种试剂,成分十分简单并且成本低廉,针对性强。
本发明选用的试剂、仪器都是常见的实验用品,无需购买昂贵的试剂盒,在任何地方均能很好的开展,可重复性高。
本发明具有如下技术效果:
1)本发明在整个dna的提取过程中只涉及了4种试剂,成分简单并且纯度等要求不高,因此成本可控制得较低;
2)整个提取过程的反应时间最快需要24分钟;
3)通过实际项目验证,采用该方法提取的dna,符合绝大部分pcr反应以及massarray平台的检测。
4)本方法是针对dna纯度(od260/od280)在1.7左右的高效提取方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的方法。
实施例1
使用普通的口腔拭子采集12个人的口腔黏膜细胞。
按照下列操作步骤,进行dna的提取:
1)取450μl的naoh(50mm)加入到试管中,涡旋混匀10s,95℃放置5min;
2)室温放置2min后瞬离,用镊子取出拭子,并将55μltris-hcl(20mm)溶液加入管中,涡旋混匀10s。12000rpm离心1min,取45μl上清。
3)将90μl磁珠加入至装有上述上清的pcr管中,轻轻吸打混匀6次,室温静置孵育5min,将pcr管置于磁力架上3min;
4)移除上清,将pcr管继续放置于磁力架上,向pcr管中加入300μl75%乙醇溶液,分2次旋转管子180度,静置30s。
5)移除上清,再向pcr管中加入300μl75%乙醇溶液,分2次旋转管子180度,静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。
6)室温静置2min,使残留乙醇彻底挥发。
7)加入10μl的nucleasefreewater,把pcr管从磁力架取下,轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡,室温静置2min;
8)将pcr管置于磁力架上2min。用移液器吸取10μl上清液,转移到新的pcr管中,在反应管上标记样本编号。
制备获得12个dna样本,分别标记1-12。1-12号样本通过nanodrop2000检测dna质量,见表一的样本浓度和样本纯度;
12个样本统一使用massarray平台进行检测,所使用的试剂和方法参考
massarray分型技术是建立在多重pcr反应的基础上,本次实施例是含有12个多重pcr反应的项目,正常情况下会存在一定程度的引物二聚体等情况,这均属于技术范围内可接受的失败,其失败率进行检测的项目有关。正常情况下,该项目的分型失败率是低于20%的,从这一指标来看,新的口腔黏膜细胞基因组dna快速提取方法的样本质量是符合massarray的分型。
另外从dna的nanodrop2000检测结果来看,其浓度均高于10ng/ul,od260/od280绝大部分都在1.8左右,说明通过本方法获得的dna符合绝大部分检测平台的要求,实用性相对较广。