红景天及红景天苷在干细胞定向分化为心肌样细胞中的应用的制作方法

本发明涉及红景天尤其是红景天苷在诱导干细胞定向分化为心肌样细胞中的应用。

背景技术：

红景天系景天(crassulaceae)科红景天属(rhodiolal.)植物，为多年生草本或亚灌木植物，主要分布在北半球的喜马拉雅山区、亚洲西北部和北美洲海拔在1600～4000米的地区。红景天药用历史悠久，素有“黄金人参”之称。药典记载红景天为景天科植物大花红景天的干燥根及茎根，其性甘、苦、平，益气活血、通脉平喘，可用于气虚血瘀、胸痹心痛、中风偏瘫和倦怠气喘。现代药理研究表明，红景天的生物活性与其所含有的多种化学成分密不可分。

红景天苷(salidroside)是从红景天中分离提纯的天然产物，为一种单体化合物，是红景天的有效成分之一，部分相关科属中药也含红景天苷，其药理作用有以下几方面：

提高和改善抗各种抗高原反应能力。

抗缺氧、抗疲劳作用。研究表明它通过维持5-ht含量正常化起到了抗中枢疲劳的作用。

抗衰老，具有抗氧化作用及体外清楚自由基和超氧阴离子自由基的能力。

抑制大鼠肾小管上皮细胞及间质细胞向肌成纤维细胞转化，有效缓解肾间质损伤，防止肾间质纤维化。

抗纤维化化作用。红景天苷可明显抑制乙醛刺激的hsc增值及胶原基因的表达，在体外有显著的抗肝纤维化作用。

对心脑血管的保护作用。红景天苷可抑制大鼠缺血再灌注引起的白细胞介素iβ表达的增加，减少脑缺血再灌注后脑组织中tnf-α的表达起到的保护脑血管的作用，通过抑制血管ace的表达，在一定程度上可抗心肌缺血。

提高机体免疫能力、抗肿瘤、抗病毒。

抗辐射。红景天苷有防护x射线损伤机体组织和细胞膜的作用。

提高记忆力和防止老年痴呆，保护神经细胞。红景天苷可抑制缺氧缺糖损伤所致的线粒体膜电位和活性的降低，从而具有稳定线粒体膜电位的作用，抑制神经细胞凋亡的发生；体外促进神经干细胞想神经元方向分化为红景天药物用于相关神经系统疾病的临床治疗提供了实验依据。

干细胞作为一种具有自我更新及多向分化的细胞，在一定条件下可分化为具有功能性的胰岛细胞，因此可作为胰岛细胞的全新来源。目前由干细胞分化获得心肌样细胞有几种途径：胚胎干细胞分化和成体干细胞分化。由于胚胎干细胞具有伦理争议，而成体干细胞来源广泛，无伦理争议，可作为心肌样细胞的来源。

脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪间充质干细胞，简称脂肪干细胞。其生物学性质与骨髓间充质干细胞相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景，因此脂肪间充质干细胞已成为继骨髓间充质干细胞后干细胞领域另一个备受关注的热点。

目前的干细胞诱导方式主要有体外诱导、基因修饰、蛋白转导与组织微环境诱导，其中体外诱导是采用不同刺激因子组合，将干细胞诱导分化为目的细胞。各实验室诱导分化条件各异，诱导分化机制尚不明确，诱导分化效率低，胰岛分泌能力仅为正常胰岛1％左右，且诱导过程复杂，诱导时间长，所得细胞数量少，功能低。

目前还未有红景天及红景天苷具有诱导干细胞定向分化为心肌样细胞和修复心肌损伤的作用报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供红景天及红景天苷的新用途，即红景天及红景天苷诱导干细胞定向分化为心肌样细胞的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

红景天或红景天苷在制备诱导干细胞定向分化为心肌样细胞诱导剂中的应用。

优选地，诱导剂在低氧条件下诱导干细胞定向分化为心肌样细胞。

优选地，所述低氧条件是指氧气的体积百分含量为2～14％。

优选地，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。

本发明还提供一种诱导干细胞定向分化为心肌样细胞的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂中含有红景天苷。

优选地，所述诱导剂通过诱导培养基诱导干细胞定向分化为心肌样细胞，所述红景天苷在所述诱导培养基中的浓度为1～400μm。

本发明还提供一种诱导干细胞定向分化为心肌样细胞的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

取动物脂肪间充质干细胞进行传代培养，选用稳定传代的脂肪间充质干细胞在低氧条件下培养于含有红景天苷的诱导培养基中进行诱导，分化获得成熟心肌样细胞。

本发明还提供红景天苷在制备利用干细胞治疗心肌梗死、心肌炎、冠心病的药物中的应用。

优选地，所述药物为口服制剂时，所述红景天苷在所述药物中的质量百分含量大于20％；所述药物为注射制剂时，所述红景天苷在所述药物中的质量百分含量大于5％。

优选地，所述药物为口服制剂时，所述红景天苷在所述药物中的质量百分含量大于10％；所述药物为注射制剂时，所述红景天苷在所述药物中的质量百分含量大于2％。

优选地，所述口服制剂为片剂、胶囊、颗粒、滴丸、口服溶液剂或悬混剂。

本发明的目的在于还提供一种利用干细胞治疗心肌损伤相关疾病的药物，所述药物中含有红景天苷；优选地，所述药物为口服制剂时，所述红景天苷在所述药物中的质量百分含量大于20％；所述药物为注射制剂时，所述红景天苷在所述药物中的质量百分含量大于5％。

优选地，所述药物为口服制剂时，所述红景天苷在所述药物中的质量百分含量大于10％；所述药物为注射制剂时，所述红景天苷在所述药物中的质量百分含量大于2％。

本发明的有益效果在于：本发明提供了红景天及红景天苷在诱导干细胞定向分化为心肌样细胞中的应用，尤其是红景天苷与低氧联合作为诱导剂用于诱导脂肪间充质干细胞定向分化为心肌样细胞。本发明开拓了红景天苷的新用途，即体外诱导脂肪干细胞等干细胞定向分化为心肌样细胞；提供了红景天及红景天苷在诱导成体干细胞定向分化为心肌样细胞中的作用，有利于体内干细胞移植治疗急慢性心肌损伤及心血管疾病领域的深入研究，为新药开发提供了基础。

附图说明

图1为脂肪间充质干细胞生长状态示意图，其中a为第3代脂肪间充质干细胞(×100)，b复苏的第3代细胞(×100)。

图2为脂肪间充质干细胞转分化心肌样细胞的鉴定结果示意图，其中a为ctni蛋白表达(呈红色荧光，阳性细胞，×400)，b为connexin43蛋白表达(呈绿色荧光，阳性细胞，×400)。

图3为红景天苷及低氧对脂肪间充质干细胞诱导转分化心肌样细胞相关标志蛋白(ctni、ctnt、α-actinin和gata-4)表达情况的示意图。

图4为红景天苷及低氧对脂肪间充质干细胞诱导转分化心肌样细胞相关标志蛋白(ctni、ctnt、α-actinin和gata-4)表达情况的差异显著性分析示意图。(*表示p<0.5，**表示p<0.01，***表示p<0.001。)

图5为红景天苷及低氧对脂肪间充质干细胞诱导转分化心肌样细胞相关调控因子(notch1、jagged1和hes1)表达情况示意图。

图6为红景天苷及低氧对脂肪间充质干细胞诱导转分化心肌样细胞相关调控因子(notch1、jagged1和hes1)表达情况的差异显著性分析示意图。(*表示p<0.5，**表示p<0.01，***表示p<0.001。)

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例以及附图对本发明做进一步的详细描述。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件

实施例1

试剂及材料

红景天苷(美国sigma公司)、脂肪间充质干细胞(ascs)(赛业生物科技有限公司)、脂肪间充质干细胞完全dmem(赛业生物科技有限公司)、成骨诱导分化培养基(赛业生物科技有限公司)、成脂诱导分化培养基(赛业生物科技有限公司)、dmem培养基(美国gibco公司)、双抗混合液(北京索莱宝公司)、胎牛血清(美国hyclone公司)、兔抗鼠ctnt多克隆抗体(美国cellsignalingtechnology公司)、兔抗鼠ctni多克隆抗体(美国cellsignalingtechnology公司)、兔抗鼠α-actinin多克隆抗体(美国cellsignalingtechnology公司)、兔抗鼠gata-4多克隆抗体(美国cellsignalingtechnology公司)。

实验步骤：

(1)脂肪间充质干细胞培养

大鼠脂肪间充质干细胞购自biosciencesinc.(广州，中国)。分别接植在75cm²培养瓶，培养于基础培养基，添加10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺和1％青霉素链霉素溶液。将细胞培养在5％co2、37℃。每两天更换一次培养基，在大约80％汇合时传代(如图1a所示)。

(2)红景天诱导脂肪间充质干细胞定向分化为心肌样细胞

取培养地3代的ascs，接种于细胞培养皿(含2％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的低糖dmem培养基)37℃，5％co2条件下培养至细胞汇合率大于90％(如图1b所示)，将细胞培养基更换为基础培养基，分为3个实验组(normoxia+sal，ns组)和1个对照组(nc组)，在基础培养基中分别添加：

对照组：基础培养

红景天苷诱导组(ns组)：红景天诱导组设有3个不同浓度分别为1μm、200μm、400μm；

每3天换液1一次，并观察细胞形态的变化，培养地5天收获细胞，通过检测ctni与connexin43蛋白来鉴定脂肪间充质干细胞分化为心肌细胞情况，通过westernblot检测脂肪间充质干细胞中心肌标志物ctni与、ctnt、α-actinin和gata-4的表达情况。

实施例2

本实施例的试剂及材料均与实施例1相同。

实验步骤：

(1)脂肪间充质干细胞培养：本实施例步骤(1)与实施例1相同。

(2)低氧处理诱导脂肪间充质干细胞定向分化为心肌样细胞

取培养地3代的ascs，接种于细胞培养皿(含2％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的低糖dmem培养基)37℃，5％co2条件下培养至细胞汇合率大于90％，将细胞培养基更换为基础培养基，设置3个实验组分别在不同低氧条件下培养。

低氧诱导组(hypoxia，hc组)：三个不同诱导组的氧含量分别为2％、5％、14％；

每3天换液1一次，并观察细胞形态的变化，培养地5天收获细胞，通过westernblot检测脂肪间充质干细胞中心肌标志物ctni、ctnt、α-actinin和gata-4的表达情况。

实施例3

本实施例的试剂及材料均与实施例1相同。

实验步骤：

(1)脂肪间充质干细胞培养：本实施例步骤(1)与实施例1相同。

(2)红景天苷和低氧联合处理诱导脂肪间充质干细胞定向分化为心肌样细胞

取培养地3代的ascs，接种于细胞培养皿(含2％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的低糖dmem培养基)37℃，5％co2条件下培养至细胞汇合率大于90％，将细胞培养基更换为基础培养基，分为3个实验组，分组以及实验条件如下：

红景天苷+低氧处理诱导组(hypoxia+sal，hs组)：该诱导组设有三个不同红景天苷浓度与低氧含量组合，其分别为1μm+2％o2、200μm+5％o2、400μm+14％o2；

每3天换液1一次，并观察细胞形态的变化，培养地5天收获细胞，通过westernblot检测脂肪间充质干细胞中心肌标志物ctni、ctnt、α-actinin和gata-4的表达情况。

将上述实施例1-3提取到的心肌样细胞的特异性蛋白(ctni、ctnt、α-actinin和gata-4)的表达情况进行检测，实施例1-3各组的情况分布，见表1。

表1：实施例1-3各组的情况分布

实验检测结果：

由图2可见，ctnt蛋白(红色荧光，阳性细胞，×400)与connexin43蛋白(绿色荧光，阳性细胞，×400)已获得表达，说明脂肪间充质干细胞已成功分化为心肌样细胞。

由图3可见，与nc组相比，ns组中的ctnt与gata-4的表达量均高于nc组，hc组中的gata-4表达量较高，hs组的ctni、ctnt、α-actinin和gata-4的表达量均高于hc组。同时，在ns组中，红景天苷浓度为400μ时mgata-4的表达量最高；在hc组中，低氧含量为5％时α-actinin的表达量最高；在hs组中，红景天苷的浓度为200μm，低氧含量为5％时ctni、α-actinin与gata-4的表达量均最高，因此，红景天苷的浓度为200μm，低氧含量为5％时为本发明的最佳实施例。

由图4可知，相比于对照组(nc组)，hc组中ctni升高至nc组的2.4倍，ns组中ctnt升高至nc组的1.4倍，具有统计学差异，说明红景天苷和低氧可作用于不同的肌钙蛋白；而hs组中ctni和ctnt分别升高至nc组的3.5和1.7倍，并且具有显著差异，说明红景天苷和低氧联合预处理对于两种肌钙蛋白均有促进作用，优于单纯红景天苷或低氧预处理(图4a、b)。同样的，红景天苷联合低氧预处理可促进α-actinin和gata-4的表达，并且优于单纯红景天苷或低氧预处理(图4c、d)。

实施例4红景天苷和低氧预处理诱导脂肪间充质干细胞向心肌样细胞分化的分子机制

一、实验材料

红景天苷(美国sigma公司)，dmem培养基(赛业生物科技有限公司)，双抗混合液(北京索莱宝公司)，胎牛血清(美国hyclone公司)，bca测定蛋白浓度试剂(上海碧云天生物技术有限公司)，兔抗鼠akt多克隆抗体(美国cellsignalingtechnology公司)，兔抗鼠p-akt多克隆抗体(美国cellsignalingtechnology公司)，兔抗鼠erk多克隆抗体(美国cellsignalingtechnology公司)，兔抗鼠p-erk多克隆抗体(美国cellsignalingtechnology公司)。

二、实验方法

1、实验分组：

取培养地3代的ascs，接种于细胞培养皿(含2％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的低糖dmem培养基)37℃，5％co2条件下培养至细胞汇合率大于90％，将细胞培养基更换为基础培养基，1个对照组(nc组)和3个实验组，分别为红景天苷组(ns组)、低氧处理组(hc组)、红景天苷与低氧联合处理组(hs组)，每组三个平行，：

对照组：基础培养

红景天苷诱导组(ns组)：红景天苷浓度为50μμ；

低氧处理组(hc组，氧含量为5％o2)；

红景天苷与低氧联合处理组(hs组，红景天苷浓度为50μm+5％o2)；

每3天换液1一次，并观察细胞形态的变化，培养地5天收获细胞，通过检测ctni与connexin43蛋白来鉴定脂肪间充质干细胞分化为心肌细胞情况，通过westernblot检测脂肪间充质干细胞中心肌标志物ctni与、ctnt、α-actinin和gata-4的表达情况。

2、实验方法

(1)将提取的细胞蛋白，通过bca法蛋白溶液浓度测定，进行电泳后转膜(90v，120min)；配制tbs(1包粉+2l双蒸水)→tbs-t(500mltbs+500μltween20).

(2)酶免疫定位，封闭：转膜后的pvdf膜用tbs-t洗涤5次，每次5min，用含5％脱脂奶粉封闭液室温封闭2h。孵一抗：封闭后用tbs-t洗膜5次，每次5min，用一抗封闭液孵育，4℃过夜。孵二抗：回收一抗封闭液，tbs-t洗膜5次，每次5min，用二抗稀释液孵育1h，回收二抗稀释液，tbs-t洗涤。

(3)显色、曝光：将pvdf膜在ecl化学发光剂中反应5min，晾干，置于x线暗盒，胶片曝光5min，取出胶片显影、定影。

(4)灰度分析：胶片扫描后，在imagej图形分析软件进行分析。

三、实验结果

notch信号通路在心脏发育过程中具有重要作用，通过检测notch信号通路受体蛋白notch1，以及其配体蛋白jagged1和靶蛋白hes1的表达水平，以明确notch1通路在脂肪间充质干细胞的作用。结果发现(如图5、6所示)，相比于nc组，ns组中jagged1升高至nc组的3.1倍并具有统计学差异，但是hc组中jagged1水平并无差异；而hs组中jagged1升高至nc组的7.5倍，并且hs组与其他各组之间均具有显著差异，说明红景天苷联合低氧预处理可显著促进配体蛋白jagged1的合成。此外，相比于nc组，ns组、hc组和hs组中notch1的表达均升高，均具有统计学差异，说明各预处理组均可上调受体蛋白notch1的水平。接下来我们发现，相比于nc组、ns组和hc组，hs组中hes1的表达下调，且均具有统计学差异，说明红景天苷联合低氧预处理组可下调靶蛋白hes1的水平，从而促进ascs向心肌样细胞分化。

四、实验结论

红景天苷联合低氧预处理首先显著促进notch1的活性配体jagged1的合成(显著优于单纯红景天苷和低氧预处理的作用)，使得受体蛋白notch1上调，配体蛋白jagged1和受体蛋白notch1结合后，通过细胞内级联反应，作用于靶蛋白hes1并下调其表达水平，从而发挥促进ascs向心肌样细胞分化的作用。

实施例5

取红景天苷作为原料药，加入医学上可接受的辅料组成，制备成片剂，口服，其中每日用制剂量中红景天苷含量0.2g。

实施例6

取红景天苷作为原料药，加入医学上可接受的辅料组成，制备成胶囊剂，口服，其中每日用制剂量中红景天苷含量0.2g。

实施例7

取红景天苷作为原料药，加入医学上可接受的辅料组成，制备成颗粒剂，口服，其中每日用制剂量中红景天苷含量0.2g。

实施例8

取红景天苷作为原料药，加入医学上可接受的辅料组成，制备成滴丸剂，口服，其中每日用制剂量中红景天苷含量0.2g。

实施例9

取红景天苷作为原料药，加入医学上可接受的辅料组成，制备成口服溶液剂，口服，其中每日用制剂量中红景天苷含量0.2g。

实施例10

取红景天苷作为原料药，加入医学上可接受的辅料组成，制备成悬混剂，口服，其中每日用制剂量中红景天苷含量0.2g。

实施例11

取红景天苷作为原料药，加入医学上可接受的辅料组成，制备成注射制剂，口服，其中每日用制剂量中红景天苷含量0.05g。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。