一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法。

背景技术：

副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus，vp)是一种常见的革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于近海岸的海水、海底沉积物和海产品中，食用被该致病菌污染的海产品极易导致严重的急性肠胃炎和原发性败血症，并伴随有腹部绞痛、恶心、呕吐、头疼、低烧、寒战等临床症状，被视为全球范围内腹泻类疾病暴发的主要原因之一。根据我国食源性疾病监测网的数据显示，副溶血性弧菌污染是微生物引起的食源性疾病爆发事件中的重要因素，是一种非常重要的食源性致病菌，对水产品安全和公众健康造成了极大的威胁。

抗生素作为一种良好的药剂，可以有效地治愈常见的食源性疾病。但随着抗生素的过度和不规范使用，导致细菌的耐药性不断增强。细菌耐药性的出现和蔓延给人和动物疾病的治疗带来了极大困难，引起了世界范围内的广泛关注。副溶血性弧菌作为常见的人畜共患病原菌，已频繁出现耐药和多重耐药现象，且具有耐药率高、耐药谱广的特点。而喹诺酮作为一类被广泛使用的广谱抗菌药物，对副溶血性弧菌具有明显的抗菌作用。但随着临床、农业及养殖业等行业的广泛使用，造成副溶血性弧菌对喹诺酮类抗菌药物耐药性越来越严重。构建诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，将有助于探究副溶血性弧菌对左氧氟沙星的耐药机制，具有良好的科研价值和实际意义，但现阶段仍缺乏相关的技术手段。

技术实现要素：

为弥补上述技术空白，本发明的目的在于提供一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，包括以下步骤：

s1、制备种子液：将副溶血性弧菌菌株从保存于-80℃的甘油管中取出，划线接种于tcbs平板上，于37℃恒温培养箱中培养16h；挑取生长良好的单菌落于9ml含nacl且其质量浓度为3％的tsb试管中，在37℃、转速为180r/min的摇床中培养活化16h，并连续活化2次，作为种子液备用；

s2、敏感菌株筛选：取步骤s1中所述种子液，调节od600使其接种量为1.5×10⁸cfu/ml，然后利用质量浓度为0.85％的nacl将其调整为6logcfu/ml，并接种于含有不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板中，每孔100ul所述种子液，置于37℃培养箱中培养16h后，用酶标仪测得上述每孔的od值后，根据耐药标准确定最低抑菌浓度mic，筛选1/2的mic值中可生长的左氧氟沙星敏感型副溶血性弧菌菌株；

s3、亚致死抗生素浓度初步诱导：吸取步骤s2中筛选的所述左氧氟沙星敏感型副溶血性弧菌菌液于10ml离心管中，用质量浓度为0.85％的nacl将所述菌液浓度调至6logcfu/ml，并接种于所述含有不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板中，置于37℃恒温培养箱中培养16h；

s4、亚致死抗生素浓度连续诱导：将步骤s3中初步诱导后的左氧氟沙星敏感型副溶血性弧菌菌株持续存在于所述亚致死抗生素浓度条件下继续生长，直至所述副溶血性弧菌的mic值≥8mg/l，得耐药性副溶血性弧菌菌株；

s5、保藏步骤s4中所述耐药性副溶血性弧菌菌株；

s6、副溶血性弧菌左氧氟沙星获得耐药性的验证：将步骤5中保藏的突变菌株重新活化，运用k-b纸片法和肉汤倍数稀释法检测突变株的耐药性，以验证该突变株获得了能够稳定遗传的耐药性。

进一步地，步骤s1中，所述种子液的浓度为1×10⁸～9×10⁹cfu/ml。

进一步地，步骤s2中，所述含有不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板的制备过程如下：取1ml左氧氟沙星母液于19mlmhb液体培养基中，充分震荡混匀后得浓度为256mg/l的左氧氟沙星抗生素；再取200ul上述左氧氟沙星抗生素于96孔板第1列每孔中，第2列至第11列每孔加100ul的mhb培养基，第12列每孔加200ul的mhb培养基作为空白对照；然后用100ul的排枪由第1列吸取100ul液体至第2列，充分吸打后吸取100ul液体至第3列，如此依次进行梯度稀释至11列，此列充分吹打后吸出100ul液体，即得不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板，置于-80℃冰箱中冷藏，备用。

更进一步地，步骤s2中，所述不同浓度的左氧氟沙星抗生素96孔板由第1列至第11列左氧氟沙星抗生素浓度依次为256mg/l，128mg/l，64mg/l，32mg/l，16mg/l，8mg/l，4mg/l，2mg/l，1mg/l，0.5mg/l，0.25mg/l，且每孔体积均为100ul。

进一步地，步骤s4中，所述左氧氟沙星敏感型副溶血性弧菌持续生长12～30天，直至所述副溶血性弧菌的mic值≥8mg/l。

进一步地，步骤s5中，所述保藏的耐药性副溶血性弧菌菌株为经步骤s4连续诱导后培养至9logcfu/ml的突变株。

进一步地，步骤s5中，所述的保藏方法具体为：将诱导后获得耐药性的副溶血性弧菌突变株重新划线培养，挑取生长良好的单菌落于9ml含nacl且其质量浓度为3％的tsb试管中，培养至9logcfu/ml，再将菌悬液与甘油按照体积比为1:1混合后置于-80℃中保藏。

进一步地，步骤s6中，所述的耐药性验证方法具体为：将步骤s5中保藏的突变菌株重新活化，划线于含8mg/l左氧氟沙星的mha固体培养基上培养16h，挑取生长良好的单菌落于9mltsb(3％nacl)的试管中，在37℃、转速为180r/min的摇床中培养16h；吸取10ul菌悬液于9mltsb(3％nacl)的试管中，在37℃、转速为180r/min的摇床中培养16h；重复此操作，连续传代培养5天，运用k-b纸片法和肉汤倍数稀释法检测突变株的耐药性，诱导后每一代的副溶血性弧菌菌株，其最低抑菌浓度均大于8mg/l，证实该方法可获得能够稳定遗传左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌菌株。

更进一步地，步骤s6中，所述k-b纸片法检测突变株的耐药性，具体步骤为：取种子液调节od600使得其接种量为1.5×10⁸cfu/ml，用棉拭子吸取菌液，在mueller-hintonagar(mha)培养基表面进行涂布，待培养基表面菌液完全晾干后贴上抗生素纸片，置于37℃培养箱中过夜培养16h，观察并记录试验结果；根据美国临床实验室标准化协会(clsi)标准，测量抑菌圈的直径，判断副溶血性弧菌的耐药性为耐药、中介和敏感三类，进一步证实诱导后的副溶血性弧菌最低抑菌浓度均达到clsi规定的耐药标准(直径≤13mm)，说明通过诱导获得可稳定遗传左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌。

更进一步地，步骤s6中，所述肉汤倍数稀释法检测突变株的耐药性，具体步骤为：取种子液调节od600使得其接种量为1.5×10⁸cfu/ml，然后利用0.85％nacl将其调为6logcfu/ml后，接种于含有不同浓度左氧氟沙星抗生素的96孔板中，每孔100ul菌液，且最后一列设为空白对照，置于37℃培养箱中过夜培养16h，观察并记录试验结果；根据美国临床实验室标准化协会(clsi)标准，测得最低抑菌浓度(mic)，判断副溶血性弧菌的耐药性为耐药、中介和敏感三类；进一步证实诱导后的副溶血性弧菌最低抑菌浓度均达到clsi规定的耐药标准(mic≥8mg/l)，说明通过诱导获得可稳定遗传左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

通过上述方法可以快速获得具有稳定遗传特性的耐药性菌株，填补诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性方法的研究空白，为副溶血性弧菌对左氧氟沙星耐药机制的研究提供一种可靠的工具，具有良好的科研价值和实际意义。

附图说明

图1为本发明方法的流程图；

图2为本发明实施例2中副溶血性弧菌左氧氟沙星耐药性变化的示意图；

图3为本发明实施例3中k-b纸片法验证副溶血性弧菌左氧氟沙星耐药性；

图4位本发明实施例4中肉汤倍数稀释法验证副溶血性弧菌左氧氟沙星耐药性。

具体实施方式

下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

1菌株来源

副溶血性弧菌由海产品中分离而得，质控菌株为埃希氏大肠杆菌atcc25922。

2仪器和试剂

仪器：mls-3750型高压灭菌锅，日本三洋电机生物医药株式会社；垂直流超净工作台，a2型二级生物安全柜，escochina公司；ql-901型漩涡振荡器，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；ghp-9270型隔水式恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；震荡培养箱(zqzy-70b)，上海知楚仪器有限公司；biotek多功能酶标仪(synergy2)，美国伯腾仪器有限公司。

试剂：硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐蔗糖琼脂(tcbs)，胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb，3％nacl)，0.85％nacl，北京陆桥技术有限责任公司；mueller-hintonagar(mha)，mueller-hintonbroth(mhb)，英国oxoid公司；左氧氟沙星(lev)粉末，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；左氧氟沙星(lev)药敏纸片，英国oxoid公司。

实施例1诱导方法

诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性的方法，具体步骤如下：

步骤1、左氧氟沙星抗生素96孔板配制

左氧氟沙星抗生素母液(5120mg/l，25ml)配制：其中抗生素质量计算如下：质量(mg)＝母液浓度(mg/l)×溶剂(l)/纯度(％)＝5120mg/l×25×10^-3l/98％＝131mg。采用万分之一分析天平秤量131mg的左氧氟沙星溶于灭菌的25mlddh2o中，然后用直径为0.22um的滤膜过滤除菌后置于50ml的离心管中，于-80℃保存，备用。

其中，左氧氟沙星抗生素96孔板的配制：取1ml左氧氟沙星母液于19mlmhb液体培养基中，充分震荡混匀后得到浓度为256mg/l的抗生素，备用。取200ul该浓度的左氧氟沙星于96孔板第1列每孔中。第2列至第11列每孔加100ul的mhb培养基，第12列每孔加200ul的mhb培养基，作为空白对照。然后用100ul的排枪由第1列吸取100ul液体至第2列，充分吸打后吸取100ul液体至第3列，如此依次进行梯度稀释至11列，此列充分吹打后吸出100ul液体。即配好的左氧氟沙星抗生素板子由第1列至第11列浓度依次为256mg/l，128mg/l，64mg/l，32mg/l，16mg/l，8mg/l，4mg/l，2mg/l，1mg/l，0.5mg/l，0.25mg/l，每孔体积为100ul。将配好的左氧氟沙星抗生素板子置于-80℃冰箱中冷藏，备用。

步骤2、菌种活化及接种液制备

将副溶血性弧菌菌株从-80℃保存的甘油管中取出，划线接种于tcbs平板上，于37℃恒温培养箱培养16h，挑取生长良好的单菌落于9mltsb(3％nacl)的试管中，在37℃转速为180r/min的摇床中培养16h，连续活化2次，作为种子液(约10⁹cfu/ml)，备用。

步骤3、左氧氟沙星敏感型副溶血性弧菌菌株筛选

取种子液调节od600使得其接种量为1.5×10⁸cfu/ml，然后利用0.85％nacl将其调为6logcfu/ml后，接种于含有不同浓度左氧氟沙星抗生素的96孔板中，每孔100ul菌液，且最后一列设为空白对照，置于37℃培养箱中培养16h。培养后，用酶标仪测得每孔的od值，观察并记录试验结果，利用肉汤倍数稀释法，测定17株副溶血性弧菌对左氧氟沙星的最低抑菌浓度(mic)，参照clsi标准，左氧氟沙星敏感、中介、耐药的标准依次为：mic(mg/l)≤2、4、≥8，判定17株副溶血性弧菌菌株均为敏感型菌株。如表1所示。

表117株副溶血性弧菌对左氧氟沙星药物敏感实验结果

步骤4、初步诱导

诱导副溶血性弧菌获得左氧氟沙星耐药性的实验流程，如图1所示，根据肉汤倍数稀释法确定野生型菌株的初始mic值后，吸取1/2mic中可生长的副溶血性弧菌菌液于10ml离心管中，用0.85％nacl将菌液浓度调至6logcfu/ml，并重新接种于含有不同浓度左氧氟沙星的96孔板中，于37℃恒温培养箱中培养16h。

步骤5、连续诱导

将上述副溶血性弧菌菌株持续存在于亚致死的抗生素浓度条件下连续培养12-30天，直至抗生素抑制副溶血性弧菌的最低抑菌浓度达到clsi规定的耐药标准，获得不同耐药程度的副溶血性弧菌。

步骤6、保藏

将诱导后mic值大于8、16、32、64、128、256mg/l的耐药性的副溶血性弧菌突变株重新划线培养，挑取生长良好的单菌落于9mltsb(3％nacl)的试管中，培养至9logcfu/ml，将菌悬液与甘油1:1混合后置于-80℃中保藏，保藏的菌株信息为：vpd8m、vpd14m、vpd31m、vpd33、vpd34m、vpd58m、vpd61m、vpr102m、vpr103m、vpr104m、vpr105m、vpr106m、vpr107m、vpr108m、vpr110m、vpr111m。

实施例2验证方法

将保藏的突变菌株重新活化，划线于含8mg/l左氧氟沙星的mha固体培养基上培养16h，挑取生长良好的单菌落于9mltsb(3％nacl)的试管中，在37℃、转速为180r/min的摇床中培养16h；吸取10ul菌悬液于9mltsb(3％nacl)的试管中，在37℃、转速为180r/min的摇床中培养16h；重复此操作，连续传代培养5天。然后，通过k-b纸片法和肉汤倍数稀释法检测突变株的耐药性，诱导后每一代的副溶血性弧菌菌株，其最低抑菌浓度均大于8mg/l，证实上述诱导方法可获得能够稳定遗传左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌菌株。

其中，k-b纸片法检测突变株的耐药性的具体步骤为：取种子液调节od600使得其接种量为1.5×10⁸cfu/ml，用棉拭子吸取菌液，在mueller-hintonagar(mha)培养基表面进行涂布，待培养基表面菌液完全晾干后贴上抗生素纸片，置于37℃培养箱中过夜培养16h，观察并记录试验结果；根据美国临床实验室标准化协会(clsi)标准，测量抑菌圈的直径，判断副溶血性弧菌的耐药性为耐药、中介和敏感三类，进一步证实诱导后的副溶血性弧菌最低抑菌浓度均达到clsi规定的耐药标准(直径≤13mm)，说明通过诱导获得可稳定遗传左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌。

其中，肉汤倍数稀释法检测突变株的耐药性的具体步骤为：取种子液调节od600使得其接种量为1.5×10⁸cfu/ml，然后利用0.85％nacl将其调为6logcfu/ml后，接种于含有不同浓度左氧氟沙星抗生素的96孔板中，每孔100ul菌液，且最后一列设为空白对照，置于37℃培养箱中过夜培养16h，观察并记录试验结果；根据美国临床实验室标准化协会(clsi)标准，测得最低抑菌浓度(mic)，判断副溶血性弧菌的耐药性为耐药、中介和敏感三类；进一步证实诱导后的副溶血性弧菌最低抑菌浓度均达到clsi规定的耐药标准(mic≥8mg/l)，说明通过诱导获得可稳定遗传左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌。

综上所述，经过亚致死抗生素浓度条件下的连续诱导，敏感型的副溶血性弧菌于第12天产生了左氧氟沙星耐药性，其mic值随诱导天数的增加而增大，在第30天达到256mg/l。经验证可知，本发明诱导产生左氧氟沙星耐药性的副溶血性弧菌的耐药性能够稳定地遗传，其每一代的菌株对左氧氟沙星的mic值均大于8mg/l，达到clsi所规定的耐药标准。本发明填补了诱导副溶血性弧菌产生左氧氟沙星耐药性方法的研究空白，为副溶血性弧菌对左氧氟沙星耐药机制的研究提供一种可靠的工具，具有良好的科研价值和实际意义。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。