本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，尤其涉及一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法。
背景技术：
壳聚糖酶可用于食品工业，将壳聚糖水解成壳寡糖。壳寡糖是甲壳素、壳聚糖产品的升级产品，具有壳聚糖不可比拟的优越性。它具有分子量低、水溶性好、功能作用大、易被人体吸收、生物活性高等优势，在医药、食品、农业、环境及水处理等领域具有广泛的应用前景。关于产壳聚糖酶的菌种来源，国内外大多数从自然界中筛选诱变得到，但发酵产酶活性普遍不高。有些菌株本身的安全性也有待深入研究。枯草芽孢杆菌属于微生物发酵和酶工程技术领域长期使用的安全菌株，无毒无害，用于发酵生产壳聚糖酶已经有一些报道。但枯草芽孢杆菌本身会分泌表达大量的蛋白酶，从而对发酵液中的壳聚糖酶进行降解，使其逐渐失去活性。
中国专利cn107236721a提供了一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用，根据毕赤酵母密码子的偏好性，对枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶编码基因进行了优化，进一步利用毕赤酵母表达系统对该所述优化的壳聚糖酶编码基因进行高效分泌表达，获得枯草芽孢杆菌壳聚糖酶。该方法避免了芽孢杆菌本身分泌表达的蛋白酶对壳聚糖酶的降解，但是需要利用转基因微生物进行生产。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌wb800，保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，cicim编号为b0132，所述方法包括以下步骤：
s1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌wb800接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置培养以活化菌株；
s2：种子培养
挑取步骤s1活化后的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡培养至种子液的od600达到0.6~1.0；
s3：发酵产酶
将步骤s2中的种子液接入发酵培养基中，置于摇床震荡培养；
s4：离心分离
将步骤s3发酵后的产物进行离心，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
其中，所述种子液按体积百分比1.5~3%的接种量接入所述发酵培养基中。
其中，步骤s1中所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨8~12g/l，酵母提取物3~7g/l，氯化钠7~11g/l，琼脂粉15~20g/l，用氢氧化钠调节所述活化培养基的ph为7.2~7.6。
优选地，所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉20g/l，用氢氧化钠调节所述活化培养基的ph为7.4。
其中，步骤s2中所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨8~12g/l，酵母提取物3~7g/l，氯化钠7~11g/l，用氢氧化钠调节所述种子培养基的ph，使其达到7.2~7.6。
优选地，所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述种子培养基的ph，使其达到7.4。
其中，步骤s3中所述发酵培养基的配方为：壳寡糖20~30g/l，胰蛋白胨9~11g/l，酵母提取物4~6g/l，氯化钠9~11g/l，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的ph，使其达到7.2~7.6。
优选地，所述发酵培养基的配方为：壳寡糖25g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述种子培养基的ph，使其达到7.4。
其中，所述壳寡糖是聚合度为2~10的壳聚糖部分水解的产物。
其中，步骤s1中，所述菌种活化的培养温度为35~39℃，时间为12~24h。
优选地，
所述培养温度为36℃，37℃，38℃；
所述培养时间为13h，14h，15h，16h，17h，18h，19h，20h，21h，22h，23h。
其中，步骤s2中，所述种子培养的温度为35~39℃，时间为12~16h，转速为180~220r/min。
优选地，
所述培养温度为36℃，37℃，38℃；
所述培养时间为13h，14h，15h；
所述培养转速为185r/min，190r/min，195r/min，200r/min，205r/min，210r/min，215r/min。
其中，步骤s3中，所述发酵产酶的温度为35~39℃，时间为25~30h，转速为180~220r/min。
优选地，
所述发酵温度为36℃，37℃，38℃；
所述发酵时间为26h，27h，28h，29h；
所述发酵转速为185r/min，190r/min，195r/min，200r/min，205r/min，210r/min，215r/min。
其中，步骤s4中，所述离心分离的时间为10~20min，转速为3000~5000r/min。
优选地，
所述离心分离的时间为11min，12min，13min，14min，15min，16min，17min，18min，19min；
所述离心分离的转速为3500r/min，4000r/min，4500r/min。
本发明的有益效果：
本发明提供的利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌wb800，枯草芽孢杆菌wb800属于微生物发酵和酶工程技术领域长期使用的安全菌株，无毒无害，生产的壳聚糖酶可放心应用于壳寡糖的生产。另外，发酵周期短，发酵液壳聚糖酶活力达到45u/ml，离心分离获得的粗酶液可直接应用于壳寡糖的生产。
具体实施方式
以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供了一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌wb800，包括以下步骤：
s1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌wb800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养20h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉20g/l，用氢氧化钠调节所述活化培养基的ph为7.4；
s2：种子培养
挑取步骤s1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为37℃，转速为200r/min于摇床震荡培养15h至种子液的od600达到0.8；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述种子培养基的ph，使其达到7.4；
s3：发酵产酶
将步骤s2中的种子液按体积百分比2%的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为200r/min于摇床震荡培养28h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖25g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的ph，使其达到7.4；
s4：离心分离
将步骤s3发酵后的产物进行离心，控制转速为3500r/min，离心15min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
通过本实施例生产的壳聚糖酶的活力达到45u/ml。
实施例2
本发明提供了一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌wb800，包括以下步骤：
s1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌wb800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养15h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉20g/l，用氢氧化钠调节所述活化培养基的ph为7.4；
s2：种子培养
挑取步骤s1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为38℃，转速为220r/min于摇床震荡培养14h至种子液的od600达到0.7；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述种子培养基的ph，使其达到7.4；
s3：发酵产酶
将步骤s2中的种子液按体积百分比2.5%的接种量接入发酵培养基中，控制温度为36℃，转速为220r/min于摇床震荡培养25h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖25g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的ph，使其达到7.4；
s4：离心分离
将步骤s3发酵后的产物进行离心，控制转速为4000r/min，离心10min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
通过本实施例生产的壳聚糖酶的活力达到42u/ml。
实施例3
本发明提供了一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌wb800，包括以下步骤：
s1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌wb800接种于活化培养基平板，控制温度为39℃，置于培养箱内倒置培养13h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉20g/l，用氢氧化钠调节所述活化培养基的ph为7.4；
s2：种子培养
挑取步骤s1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为38℃，转速为180r/min于摇床震荡培养12h至种子液的od600达到0.9；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述种子培养基的ph，使其达到7.4；
s3：发酵产酶
将步骤s2中的种子液按体积百分比3%的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为210r/min于摇床震荡培养28h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖25g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的ph，使其达到7.4；
s4：离心分离
将步骤s3发酵后的产物进行离心，控制转速为5000r/min，离心12min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
通过本实施例生产的壳聚糖酶的活力达到38u/ml。
实施例4
本发明提供了一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌wb800，包括以下步骤：
s1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌wb800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养20h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨9g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠9g/l，琼脂粉18g/l，用氢氧化钠调节所述活化培养基的ph为7.3；
s2：种子培养
挑取步骤s1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为37℃，转速为200r/min于摇床震荡培养15h至种子液的od600达到0.8；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨12g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述种子培养基的ph，使其达到7.5；
s3：发酵产酶
将步骤s2中的种子液按体积百分比2%的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为200r/min于摇床震荡培养28h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖30g/l，胰蛋白胨9g/l，酵母提取物6g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的ph，使其达到7.4；
s4：离心分离
将步骤s3发酵后的产物进行离心，控制转速为3500r/min，离心15min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
通过本实施例生产的壳聚糖酶的活力达到43u/ml。
实施例5
本发明提供了一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌wb800，包括以下步骤：
s1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌wb800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养20h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨9g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠8g/l，琼脂粉17g/l，用氢氧化钠调节所述活化培养基的ph为7.5；
s2：种子培养
挑取步骤s1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为37℃，转速为200r/min于摇床震荡培养15h至种子液的od600达到0.8；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨8g/l，酵母提取物6g/l，氯化钠11g/l，用氢氧化钠调节所述种子培养基的ph，使其达到7.5；
s3：发酵产酶
将步骤s2中的种子液按体积百分比2%的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为200r/min于摇床震荡培养28h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖23g/l，胰蛋白胨11g/l，酵母提取物4g/l，氯化钠9g/l，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的ph，使其达到7.5；
s4：离心分离
将步骤s3发酵后的产物进行离心，控制转速为3500r/min，离心15min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
通过本实施例生产的壳聚糖酶的活力达到37u/ml。
实施例6
本发明提供了一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌wb800，包括以下步骤：
s1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌wb800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养20h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨12g/l，酵母提取物6g/l，氯化钠8g/l，琼脂粉17g/l，用氢氧化钠调节所述活化培养基的ph为7.3；
s2：种子培养
挑取步骤s1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为37℃，转速为200r/min于摇床震荡培养15h至种子液的od600达到0.8；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物4g/l，氯化钠10g/l，用氢氧化钠调节所述种子培养基的ph，使其达到7.5；
s3：发酵产酶
将步骤s2中的种子液按体积百分比2%的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为200r/min于摇床震荡培养28h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖24g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物4g/l，氯化钠11g/l，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的ph，使其达到7.6；
s4：离心分离
将步骤s3发酵后的产物进行离心，控制转速为3500r/min，离心15min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
通过本实施例生产的壳聚糖酶的活力达到41u/ml。
目前已经报道的摇瓶发酵生产的壳聚糖酶活力最高的是齐鲁工业大学食品与生物工程学院与济南海得贝海洋生物工程有限公司合作研究的一株解角质素微杆菌（microbacteriumkeratanolyticum），在最优条件下,该菌株以4%的接种量,发酵培养96h,产壳聚糖酶的酶活力达到124u/ml。本发明的酶活力虽然最高是45u/ml，但发酵时间缩短到25~30h，单位时间所产酶活力实际更高。而且本发明使用的是安全菌株，而且更加有利于今后的大规模发酵生产。
需要说明的是，本发明实施例所述的枯草芽孢杆菌wb800，保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，cicim编号为b0132；本发明实施例中所述的壳寡糖是聚合度为2~10的壳聚糖部分水解的产物。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。