制作普鲁兰的方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年4月14日提交的美国临时申请no.62/485,855的权益，该美国临时申请通过引用以其全部内容并入本文。

发明概述

公开了用于通过在含有磷酸钙作为主要磷酸盐来源的发酵培养基中的微生物生产普鲁兰的方法。

普鲁兰是葡萄糖的聚合物，更特别地，是由α-1,4-连接的麦芽三糖单元组成的多糖，所述麦芽三糖单元通过在三糖的末端糖苷残基之间的α-1,6-键连接。

当出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)的菌株在发酵培养基中好氧培养时，从所述菌株获得普鲁兰。据报道，如此获得的普鲁兰的聚合度落入几百至几千千道尔顿(kda)的范围内。通过控制发酵方法可以获得高产品质量一致性。

用普鲁兰形成的膜具有使这种膜适合于形成胶囊等产品的多种性能。这样得到的膜具有优异的均匀性和透明性。另外，这样的膜具有非常低的透氧性。因此，由普鲁兰制成的胶囊特别用于填充对氧气敏感的产品，例如鱼和植物油。由普鲁兰制成的这种膜和所得的胶囊还具有相对较低的水含量，并且在储存期间，例如在机械和溶解性能方面，表现出高的稳定性。

普鲁兰的天然来源及其作为成膜材料的优越性能已使普鲁兰成为制造具有所有天然来源成分的胶囊所需的聚合物。这将使用普鲁兰制成的胶囊能够满足“有机”贴标的要求。尽管商业上需要满足有机贴标要求的胶囊，但迄今尚未开发出满足有机贴标要求的令人满意的普鲁兰胶囊。这主要是由于不存在作为满足有机贴标要求而制成的原材料的普鲁兰。

在一个实施方案中，提供了一种用于制造普鲁兰的方法，该方法包括：a.制备包括水、氮源、碳源、磷酸盐源和镁源的发酵培养基；b.用产普鲁兰的微生物接种所述发酵培养基；c.在所述发酵培养基中培养所述微生物以便在所述发酵培养基中产生普鲁兰；其中所述磷酸盐源包括磷酸钙。

在一个实施方案中，磷酸盐源包括磷酸钙，基本上由磷酸钙组成或由磷酸钙组成。

在一个实施方案中，发酵培养基具有约0.25g/l至约4g/l的初始磷酸钙浓度。

在一个实施方案中，镁源是氯化镁。

在一个实施方案中，发酵培养基具有0.01g/l至1g/l的初始氯化镁浓度。

在一个实施方案中，氮源是酵母提取物、nh4oh、l-谷氨酰胺、nano3、nh4cl、精氨酸或其混合物。

在一个实施方案中，氮源是酵母提取物。

在一个实施方案中，碳源是葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果蔬糖浆、果蔬糖蜜或其混合物。

在一个实施方案中，碳源是蔗糖。

在一个实施方案中，微生物是出芽短梗霉。

在一个实施方案中，微生物是出芽短梗霉atccno.42023。

在一个实施方案中，微生物的培养通过巴氏灭菌法停止。

在一个实施方案中，普鲁兰的分子量通过由微生物产生的普鲁兰酶降低，并且该方法没有添加酸或热量以降低普鲁兰分子量的步骤。

在一个实施方案中，发酵培养基具有2.5至8的初始ph。

在一个实施方案中，微生物被培养至少3天。

在一个实施方案中，普鲁兰是由前述方法生产的。

在一个实施方案中，普鲁兰具有200至500kda的分子量。

在一个实施方案中，普鲁兰具有至少50mg/kg，或至少100mg/kg，或至少200mg/kg，或至少300mg/kg，或甚至至少500mg/kg的ca²⁺含量。

在一个实施方案中，普鲁兰具有至少10mg/kg，或20mg/kg，或30mg/kg，或至少40mg/kg，或甚至至少50mg/kg的mg²⁺含量。

在一个实施方案中，普鲁兰具有大于3，或大于5，或大于10，或甚至大于15的(mg²⁺+ca²⁺)/k⁺的比率。

应该理解，前面的一般描述和下面的详细描述仅是示例性和阐释性的，并不限制所要求保护的主题。

附图说明

图1是在实施例1中测量的普鲁兰浓度、分子量和生物量浓度的时程图。

图2显示了在实施例2中测量的普鲁兰浓度、分子量和生物量浓度。

发明详述

定义

如本文所用，不定冠词“一”或“一种”所指的要素不排除存在一个以上要素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个要素。因此，不定冠词“一”或“一种”通常是指“至少一个”。除非另有说明，否则数值范围的公开应理解为是指该范围内的每个离散点，包含端点。在数值范围的公开中使用的术语“约”表示与所述值的偏差在一定程度上是可接受的，只要该偏差是测量可变性的结果和/或产生具有相同或相似性质的乘积。

如本文所用，“w/w％”和“wt％”是指重量占总重量的百分比。

制备普鲁兰的方法

一种用于制备普鲁兰的方法，该方法包括以下步骤：

a.制备包括水、氮源、碳源、磷酸盐源和镁源的发酵培养基；

b.用产普鲁兰的微生物接种所述发酵培养基；

c.在所述发酵培养基中培养所述微生物以便在所述发酵培养基中产生普鲁兰。

发酵培养基可包含适合于生产普鲁兰的任何碳源。合适的已知碳源包括糖类，例如蔗糖、果糖和葡萄糖；改性糖，例如异构糖，以及转化糖；碳水化合物，例如淀粉；以及天然产品，例如木薯和大枣。在一优选的实施方案中，碳源被证明满足有机贴标要求。在一个实施方案中，碳源是蔗糖。碳源，例如蔗糖，最初以10g/l至200g/l，更优选60g/l至110g/l的浓度存在于发酵培养基中。

发酵培养基可以包含适合于生产普鲁兰的任何氮源。通常，铵盐、硝酸盐、蛋白胨和酵母提取物可用作氮源。在一优选的实施方案中，氮源被证明满足有机贴标要求。在一个实施方案中，氮源是酵母提取物。氮源，例如酵母提取物，最初以1g/l至6g/l(0.08g/l至0.4g/l氮当量)的浓度存在于发酵培养基中。

发酵培养基还包括包含磷酸钙的磷酸盐源。在一个实施方案中，磷酸盐源由磷酸钙组成。磷酸钙是优选的磷酸盐源，因为它能够被证明满足有机贴标要求。磷酸钙最初以0.25g/l至4g/l的浓度存在于发酵培养基中。

发酵培养基还包含适合于制造普鲁兰的镁源。在一个实施方案中，镁源由氯化镁组成。氯化镁是优选的镁源，因为它能够被证明满足有机贴标要求。镁源最初以0.01g/l至1g/l(0.1mm至10.5mmmg或0.002g/l至0.26g/lmg)的浓度存在于发酵培养基中。

发酵培养基可以包含其他任选的材料。在一个实施方案中，发酵培养基可以包含抗坏血酸。抗坏血酸可以以初始发酵培养基的0.2mg/ml至3mg/ml的量存在。

发酵培养基中可包括的其他任选材料包括盐，例如氯化钠。

发酵培养基的ph可以在2.5至8的范围内。发酵培养基的ph可以通过添加酸、碱或缓冲剂(例如氢氧化钠和盐酸)进行调节。

可以在适合于培养微生物的任何器皿(例如摇瓶或生物反应器)中制备发酵培养基。将发酵培养基成分和水加入器皿中，并进行搅拌或搅动以使成分溶解或均匀分散。然后，对发酵培养基进行灭菌，例如通过在引入微生物之前加热至至少60℃的温度至少30分钟来进行灭菌。

本发明中可采用的产普鲁兰的微生物包括出芽短梗霉、发酵茁霉(pullulariafermentans)发酵变种(varfermentans)ifo6401、发酵茁霉褐色变种(varfusca)ifo6402、出芽茁霉ahu9553、出芽茁霉ifo6353和出芽暗色孢霉ifo4464。优选的产普鲁兰的微生物是出芽短梗霉。出芽短梗霉可以从atcc获得。优选的克隆是出芽短梗霉atccno.42023。

对发酵培养基进行热灭菌并调节ph后，在培养基中于25℃-30℃，优选于27℃，通过通气和/或搅动培养微生物约3-7天。通气可以通过喷射进行。搅拌可以通过叶轮进行。发酵开始后约3天，观察到大量的普鲁兰积聚，并且培养混合物的粘度增加。

培养基中的普鲁兰浓度和分子量可以按一定间隔时间确定，并且当普鲁兰浓度的量达到大于20g/l的浓度且分子量在200kda和500kda之间时，可以中断培养。

当普鲁兰分子量在200kda和500kda之间并且普鲁兰的10wt％溶液的粘度在100cp和190cp之间时，发酵可以停止。可以通过巴氏灭菌法来停止发酵。

在发酵期间产生的普鲁兰的分子量在发酵过程中随时间变化。这部分是由于微生物产生了普鲁兰酶。在一个实施方案中，在该过程期间产生的普鲁兰的分子量主要由微生物产生的普鲁兰酶控制。这省去了向生物反应器加入材料(例如酸)或升高温度以降低普鲁兰的分子量的进一步步骤。

微生物细胞可以通过离心从液体培养基中去除，并且如果需要的话，无细胞液体培养基可以用活性炭脱色。

普鲁兰可以通过在有机溶剂中沉淀来纯化。优选地，将离心后的上清液与亲水性有机溶剂(例如甲醇或乙醇)混合，以使积聚的普鲁兰沉淀。如果需要的话，将回收的普鲁兰溶于温水，并再次通过溶剂沉淀。

干燥后获得的普鲁兰是发白的粉末，其非常容易溶于水以形成粘性溶液。所获得的普鲁兰的分子量取决于培养条件而在50,000和4,500,000da之间变化。普鲁兰的产率也取决于培养条件而从20％到75％变化。

在一个实施方案中，所得的普鲁兰具有相对高浓度的钙(ca²⁺)和镁(mg²⁺)离子。发酵培养基包含磷酸钙和氯化镁。这导致最终的普鲁兰产品包含相对大量的钙和镁。另外，沉淀法的使用，以及不存在用以除去离子的离子交换法，保留了很大一部分的起始钙和镁。在一个实施方案中，普鲁兰具有至少50mg/kg，或至少100mg/kg，或至少200mg/kg，或至少300mg/kg，或甚至至少500mg/kg的ca²⁺含量。在另一个实施方案中，普鲁兰具有至少10mg/kg，或20mg/kg，或30mg/kg，或至少40mg/kg，或甚至至少50mg/kg的mg²⁺含量。在一个实施方案中，(mg²⁺+ca²⁺)/k⁺的比率大于3，或大于5，或大于10，或甚至大于15。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种干发酵培养基，其适合用于制备用于制备有机普鲁兰的发酵培养基。在一个实施方案中，干发酵培养基包括：

(a)量为89wt％至99wt％的碳源；

(b)量为0.9wt％至9wt％的氮源；以及

(c)量为0.2wt％至0.7wt％的由磷酸钙组成的磷酸盐源。

在一个实施方案中，干发酵培养基包括量为0.009wt％到1.6wt％的氯化镁。

应当理解，本文描述的实施方案不限于此。通过考虑所公开的实施方案的说明书和实践，本公开的其他实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。以下实施例应被认为仅是示例性的，其中本公开的真实范围和精神由所附权利要求指明。

实施例1

如下制备有机普鲁兰发酵培养基。将2g/l的磷酸一钙(ca(h2po4)2)、0.2g/l硫酸镁(mgso4)和1g/l氯化钠(nacl)添加到水中，并使其在剧烈搅动下均匀分散至少15分钟。磷酸一钙不完全溶解，而是均匀分散成悬浮液。然后将3g/l的有机酵母提取物加入到混合物中并使其溶解。最后，将100g/l的有机蔗糖加入到混合物中并使其溶解。用额外的水调节至最终体积后，测量溶液ph为4.85。于121℃将培养基蒸汽灭菌40分钟。

通过用来自出芽短梗霉的平板培养物的刮屑接种包含30ml有机普鲁兰发酵培养基的灭菌的125ml摇瓶来制备接种物培养物。在马铃薯葡萄糖琼脂上培育平板培养物。然后至少每4天以1:60的稀释速率通过摇瓶，直到达到足够的生物量以在生物反应器中获得0.32mg/ml的初始生物量浓度。

将生物反应器预先填充无菌有机普鲁兰发酵培养基，并在接种之前和发酵期间将生物反应器控制至28℃的温度并用单个rushton叶轮以700w/m³的功率输入进行搅动。然后以足以收获0.32mg/ml的反应器生物量浓度的体积将接种物添加到反应器中。通过将纯氧吹入15μm的喷石器中，将溶解的氧控制为>50％的空气饱和度。反应器放气系统被设计成使得达到至少110mm/hr的氧传输速率，以便维持非缺氧条件。将废气引导通过冷凝器，其中冷凝物直接返回发酵培养基。反应器的工作体积为1.25l，而反应器总体积为2l。然后使发酵进行93小时。ph不受控制。通过在93小时将培养物加热至>60℃来停止发酵。

每天对培养物取样以测量生物量浓度、普鲁兰浓度和普鲁兰分子量。

如下确定生物量浓度。将30ml样本从生物反应器中取出并置于预先称重的50ml离心管中。然后将该样本以10000g的力离心20分钟。保留上清液以确定普鲁兰浓度和分子量。将沉淀物用10ml水冲洗，重新悬浮，并以10000g的力离心额外的20分钟。然后将沉淀物快速冷冻并冻干至干。然后称重干燥的沉淀物，并基于生物反应器样本的体积和沉淀物的重量计算生物质浓度。

通过以1:1.4的比例在90％冷乙醇中沉淀来自生物量分析的第一上清液来确定普鲁兰浓度。然后将沉淀的普鲁兰以10wt％溶解在水中。然后再次以相同比例在新鲜的冷乙醇中沉淀该溶液。然后将得到的沉淀物干燥并称重。然后基于上清液样本的体积和干燥的普鲁兰沉淀物的重量确定普鲁兰的浓度。

通过将干燥的普鲁兰沉淀物溶于水中至浓度为10mg/ml来确定普鲁兰分子量。然后将所得的溶液通过0.45um过滤器过滤，然后注入高压液相色谱(hplc)系统中。hplc系统配备有尺寸排阻柱。普鲁兰聚合物在柱上的保留时间与聚合物尺寸和构型直接相关。通过经由折射率检测器检测普鲁兰洗脱来确定保留时间。通过多角度激光散射检测器中聚合物的响应来确定聚合物尺寸。通过测量其他已知的分子量标准，对多角度激光散射检测器中的响应进行了归一化和验证。

实施例2

在该实施例中，如实施例1所述传代和维持细胞培养物，包括接种系列的传代和有机普鲁兰培养基配方。为了评估经完全认证的有机普鲁兰培养基，我们评估了经认证的有机mgcl2(mitoku；日本东京)对mgso4的替代。在该实验中，分别用0.5ml接种物将3个单独的125mlpetg摇瓶接种至30ml有机普鲁兰培养基的体积(1:60)。这些摇瓶中的一个摇瓶包含与实施例1中所述的组分相同的培养基。对于其他两个摇瓶，mgcl2分别以0.16g/l和0.32g/l的浓度替代mgso4(其余成分与实施例1中概述的相同)。将这些摇瓶培养物在28℃，200rpm摇动的轨道摇床培养箱中培养4天。在第四天，使用与实施例1中所述相同的工序分析这些摇瓶培养物的普鲁兰产率和生物量。该研究的结果示于图2中。

实施例3

在该实施例中，按照实施例2的方法生产普鲁兰。分别按照标准方案sm3111b和d(火焰原子吸收光谱法)分析了该普鲁兰(称为普鲁兰a)和由林原(hayashibara)生产代表性样本(称为普鲁兰b)的mg2+和ca2+含量。通过三个平行试验分析(analyzedintriplicate)每个普鲁兰样本。从该分析可以确定，普鲁兰a中mg2+和ca2+的浓度均高于普鲁兰b。

表1.普鲁兰的金属分析结果

以mg金属/kg普鲁兰表示的值。