寡核苷酸保存方法与流程

本发明涉及寡核苷酸贮存方法和用于扩增靶核酸的试剂盒。

背景技术：

dna合成用于研究中的各种目的。其中，排除单链dna的化学合成的大多数dna合成使用dna聚合酶或逆转录酶通过酶促方法执行。可以在体外容易地扩增所需的dna片段的聚合酶链反应（下文称为pcr）是非常有用的，并且是生物学、医学和农业领域以及其它领域中的必需工具。在通过pcr的dna扩增中，经常需要高反应特异性。为了减少非特异性扩增，已开发了新型dna聚合酶，并且已优化了反应混合物（下文称为反应溶液）的组成。然而，仍然需要改善的pcr扩增特异性。

一般地，在通过pcr的dna扩增中，反应溶液含有成分例如模板核酸、引物、脱氧核糖核苷酸和酶。在检测经扩增的dna的情况下，反应溶液可以进一步含有荧光染料或探针。为了实现稳定和准确的dna合成反应，重要的是适当地贮存这些成分，直到将它们提供给反应溶液或开始pcr。

能够将引物或探针作为固体或溶液（包括冷冻溶液）贮存。固体具有因其稳定性而可以在室温下贮存的优点，同时它具有其必须溶解以用于反应溶液中的缺点。另一方面，贮存于溶液中的引物或探针可以立即用于反应溶液中。此外，可以通过预先制备且贮存含有pcr所需的所有成分（例如引物、探针、脱氧核糖核苷酸和酶）的反应溶液来快速执行pcr。然而，在溶液中贮存具有缺乏稳定性的缺点。换言之，当将引物或探针贮存在溶液中时，使用该引物或探针的pcr的反应性趋于降低。尽管可以通过在低温或冷冻温度下贮存溶液来抑制反应性的降低，但需要更有效的贮存方法。

为了改善pcr的反应性和特异性的目的，已进行了各种改善。例如，可以将表面活性剂或某种类型的蛋白加入pcr。随着pcr的改善，报道了添加非离子表面活性剂的技术（专利文献1）。另外，已知具有核酸结合活性的蛋白，例如与单链核酸结合的蛋白，在核酸合成反应例如pcr中抑制非特异性核酸的合成（专利文献2）。与单链核酸结合的蛋白的实例包括大肠杆菌衍生的ssb和t4噬菌体衍生的ssb（也称为t4基因32蛋白）。此外，已报道了用于改善dna合成反应的反应性的方法，所述方法包括在dna合成反应溶液的制备中添加冷激蛋白（专利文献3）。

冷激蛋白从各种微生物中发现，并且被认为涉及将生长温度转换至低温的适应。其中，关于被称为主要冷激蛋白的cspa，其基因从大肠杆菌中分离，并且产生重组体（专利文献4）。cspa具有与单链dna或单链rna结合的特性。

如上所述，已知具有核酸结合活性的蛋白对dna合成反应具有有益作用。在如上所述的方法中，在合成反应马上开始之前将蛋白加入反应溶液中。然而，关于含有引物或探针的溶液的长期贮存，尚未对蛋白的作用进行研究。

引用列表

专利文献

专利文献1：美国专利号6127155

专利文献2：美国专利号5773257

专利文献3：wo2009/108949

专利文献4：wo90/09444。

发明概述

本发明要解决的问题

如上所述，存在以溶液状态贮存引物或探针缺乏稳定性的问题。此外，本发明人已发现了一个问题：即使引物或探针在低温下以溶液状态贮存或冷冻保存，它也可以缺乏稳定性（例如，实施例1）。本发明的目的是提供稳定地贮存含有寡核苷酸如引物或探针的溶液的方法。

问题的解决方案

作为解决上述问题的勤奋努力的结果，本发明人已发现，可以通过预先向含有寡核苷酸的溶液中添加核酸结合蛋白来稳定地贮存寡核苷酸。因此完成了本发明。

即，本发明涉及：

[1]一种用于贮存寡核苷酸的方法，该方法包括在低温下贮存含有核酸结合蛋白和寡核苷酸的溶液的步骤；

[2]根据[1]的方法，其中所述核酸结合蛋白是与单链核酸结合的蛋白；

[3]根据[2]的方法，其中与单链核酸结合的蛋白是选自冷激蛋白和ssb的蛋白；

[4]根据[2]的方法，其中与单链核酸结合的蛋白是选自cspa、t4噬菌体衍生的ssb和大肠杆菌衍生的ssb的蛋白；

[5]根据[1]至[4]中任一项的方法，其中所述寡核苷酸是寡脱氧核糖核苷酸；

[6]根据[1]至[5]中任一项的方法，其包括将所述溶液冷冻贮存的步骤；

[7]一种用于扩增靶核酸的试剂盒，其包含含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液；

[8]根据[7]的试剂盒，其中所述核酸结合蛋白是与单链核酸结合的蛋白；

[9]根据[8]的试剂盒，其中与单链核酸结合的蛋白是选自冷激蛋白和ssb的蛋白；

[10]根据[9]的试剂盒，其中与单链核酸结合的蛋白是选自cspa、t4噬菌体衍生的ssb和大肠杆菌衍生的ssb的蛋白；

[11]根据[7]至[10]中任一项的试剂盒，其中所述寡核苷酸是寡脱氧核糖核苷酸；

[12]根据[11]的试剂盒，其中所述寡脱氧核糖核苷酸是用于扩增靶核酸的引物；

[13]根据[7]至[12]中任一项的试剂盒，其中含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液在低温下贮存；

[14]根据[7]至[13]中任一项的试剂盒，其中含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液是冷冻溶液；

[15]根据[7]至[14]中任一项的试剂盒，其包含含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的第一溶液，以及含有选自以下的一种或多种要素的第二溶液：dna聚合酶、二价金属离子、脱氧核糖核苷三磷酸和缓冲成分；

[16]根据[7]至[14]中任一项的试剂盒，其中含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液进一步含有dna聚合酶、二价金属离子、脱氧核糖核苷三磷酸和缓冲成分。

发明效果

本发明提供了用于贮存寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸可用于核酸合成反应。本发明还提供了用于扩增靶核酸的试剂盒。

附图简述

图1是显示实施例1中的pcr的扩增曲线的实例的图。

图2是显示实施例1中的pcr解链曲线的实例的图。

图3是显示实施例1中的ct值的图。

图4是显示实施例2中的ct值的图。

图5是显示实施例3中的ct值的图。

图6是显示实施例4中的ct值的图。

图7是显示实施例5中的ct值的图。

图8是显示实施例6中的ct值的图。

用于进行本发明的方式

（定义）

如本文使用的，术语“核酸”（包括“多核苷酸”和“寡核苷酸”）意指通过连接链中的核苷形成的线性聚合物。核酸的实例包括脱氧核糖核酸、核糖核酸、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和聚酰胺核酸。天然核酸、人工核酸以及经修饰的核酸及其片段也包括在“核酸”中。

如本文使用的，术语“引物”指在dna或rna模板和聚合试剂（dna聚合酶、核苷三磷酸等）的存在下发生的核酸合成反应中充当起点的寡核苷酸。引物优选是单链的。然而，双链引物也可以如上所述起作用。当使用双链引物时，期望在用于扩增反应之前将其转换为其单链形式。引物可以使用众所周知的方法化学或酶促合成，或者可以从生物中分离。

如本文使用的，术语“探针”指用于检测或定量靶核酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸可以与靶核酸特异性杂交。探针优选是单链的。然而，双链探针也可以如上所述起作用。当使用双链探针时，期望在用于检测反应之前将其转换为其单链形式。探针可以使用众所周知的方法化学或酶促合成，或者可以从生物中分离。

（1）本发明的“寡核苷酸贮存方法”

本发明的寡核苷酸贮存方法的特征在于包括在低温下贮存含有核酸结合蛋白和寡核苷酸的溶液的步骤。

下文说明了制备含有核酸结合蛋白和寡核苷酸的溶液（下文称为“本发明的溶液”）的步骤。

<寡核苷酸>

本发明中的寡核苷酸通常包括通过连接具有选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的任何碱基的脱氧核糖核苷酸形成的dna（寡脱氧核糖核苷酸），和/或通过连接具有选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的任何碱基的核糖核苷酸形成的rna（寡核糖核苷酸），以及通过连接天然核苷酸形成的核酸，例如dna和rna的嵌合体。寡核苷酸可以通过以下进行制备：用限制性核酸内切酶等消化自然界中存在的天然核酸，然后从消化产物中分离寡核苷酸。通过酶促或化学方法人工生产的寡核苷酸也包括在本发明的寡核苷酸中。

用于本发明中的寡核苷酸进一步包括非天然核酸。如本文使用的，“非天然核酸”指具有与天然核酸的那种相似的结构和/或特性的人工构建的核酸类似物。非天然核酸的实例包括肽核酸（pna：肽核酸）、具有磷酸基的肽核酸（phona）、包含非天然碱基的核酸（肌苷、脱氮鸟苷等）、交联核酸（bna/lna：桥连核酸/锁核酸）、吗啉代核酸等等。包括化学修饰的核酸和核酸类似物如甲基膦酸酯dna/rna、硫代磷酸酯dna/rna、氨基磷酸酯dna/rna和2'-o-甲基dna/rna的寡核苷酸也可以用于本发明中。此外，寡核苷酸可以是向其中添加荧光物质、猝灭物质、染料、半抗原、生物素等的寡核苷酸。

在本发明中，寡核苷酸可以是单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或这些寡核苷酸的混合物。例如，寡核苷酸可以是与靶核酸杂交的寡核苷酸。与靶核酸杂交的寡核苷酸的实例包括充当用于检测靶核酸的探针的寡核苷酸，以及充当靶核酸扩增中的引物的寡核苷酸。

在本发明中，寡核苷酸的长度并无特别限制。当寡核苷酸为单链时，长度优选为6个核苷酸或更长，更优选为10个核苷酸或更长。当寡核苷酸是人工合成的单链寡核苷酸时，从寡核苷酸合成的观点来看，长度优选为100个核苷酸或更短，更优选为30个核苷酸或更短。寡核苷酸可以例如通过亚磷酰胺法合成。寡核苷酸可以通过其它方法合成，所述其它方法例如磷酸三酯法、h-膦酸酯法和硫代膦酸酯法。寡核苷酸也可以通过酶促或化学切割天然核酸来制备。

本发明的溶液中含有的寡核苷酸的类型数目并无特别限制。例如，本发明的溶液中含有一种或多种，优选两种或更多种，更优选三种或更多种类型的核酸。当使用两种或更多种类型的寡核苷酸时，寡核苷酸的混合比不受限制。两种或更多种类型的寡核苷酸的实例包括但不限于用于多路核酸扩增反应的具有不同核苷酸序列的引物对的混合物。除混合物之外，本发明的溶液可以含有用作用于检测靶核酸的探针的寡核苷酸。

本发明的溶液中含有的寡核苷酸的浓度并无特别限制，只要可以实现本发明的效果，并且它可以考虑寡核苷酸的类型、核酸结合蛋白的类型和浓度、其它成分的类型和浓度、贮存温度等等来适当地确定。在使用链长为10至30个核苷酸的单链寡核苷酸dna的情况下，总浓度为例如0.1至100μm，优选0.5至50μm，更优选1至20μm。

<核酸结合蛋白>

本发明中使用的核酸结合蛋白并无特别限制，只要它是能够结合核酸的蛋白。核酸结合蛋白可以是从自然界分离的蛋白或人工制备的重组蛋白。优选地，用于本发明中的核酸结合蛋白是重组蛋白。

本发明中使用的核酸结合蛋白的实例包括与单链核酸结合的蛋白。与单链核酸结合的蛋白可以是任何蛋白，其可以与单链核酸，即单链dna和/或单链rna结合。与单链核酸结合的蛋白的实例包括但不限于ssb（单链结合蛋白）和冷激蛋白。

用于本发明中的ssb的实例包括衍生自微生物（包括大肠杆菌）、果蝇（drosophila）、非洲爪蟾（xenopus）和噬菌体（t4噬菌体、t7噬菌体等）的ssb。其优选实例包括衍生自大肠杆菌的ssb和衍生自t4噬菌体的ssb。ssb具有与单链dna结合的特性。衍生自t4噬菌体的ssb也称为t4基因32蛋白（t4gp32）。

当大肠杆菌的培养温度从37℃降至15℃时，cspa以高水平瞬时表达。已知大肠杆菌具有cspb至cspi的8类蛋白作为与cspa具有氨基酸序列同一性的同源物（j.bacteriol.，1999，181，1603-1609）。此外，已知cspa同源物也存在于微生物如枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）（cspb）、bacilluscaldoliticus（cspb）、海栖热袍菌（thermotogamaritima）（cspb、cspl）和植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）（cspl）中。在本发明中，“冷激蛋白”意指具有氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列显示与大肠杆菌cspa的氨基酸序列优选80%或更多，更优选90%或更多，且再更优选95%或更多的序列同一性。

这些冷激蛋白可以用于本发明中。用于本发明中的冷激蛋白的实例优选为cspa，更优选为衍生自革兰氏阴性细菌的cspa，并且再更优选为来自大肠杆菌的cspa。cspa具有与单链dna和单链rna结合的特性。

如上所述，衍生自大肠杆菌的ssb（genbank登录号np_418483.1）、衍生自t4噬菌体的ssb（genbank登录号np_049854.1）、以及衍生自大肠杆菌的cspa（genbank登录号np_418012.1）可以用于本发明中。这些蛋白在其氨基酸序列中共享同源区。即，大肠杆菌衍生的ssb的部分氨基酸序列（vaseylrkgsqv）、t4噬菌体衍生的ssb的部分氨基酸序列（egannfvlkvkqv）、以及大肠杆菌衍生的cspa的部分氨基酸序列（dgyksldegqkv）是彼此同源的。具有这样的氨基酸序列的核酸结合蛋白可以产生与本发明中具有上述部分氨基酸序列的蛋白相同的效果，并且因此可以用于本发明中，所述氨基酸序列显示与所述部分氨基酸序列中的任一种70%或更多，优选80%或更多，更优选90%或更多，且再更优选95%或更多的序列同一性。

本发明的溶液中含有的核酸结合蛋白的类型数目并无特别限制。例如，本发明的溶液可以含有一种类型的核酸结合蛋白，或者可以含有两种或更多种类型的核酸结合蛋白。当使用两种或更多种类型的核酸结合蛋白时，它们的混合比不受限制。

本发明的溶液中含有的核酸结合蛋白的浓度并无特别限制，只要可以实现本发明的效果，并且它可以考虑寡核苷酸的类型和浓度、核酸结合蛋白的类型、其它成分的类型和浓度、贮存温度等等来适当地确定。核酸结合蛋白的（总）浓度的实例包括但不限于0.1mg/ml或更高、0.2mg/ml或更高、0.3mg/ml或更高、0.4mg/ml或更高、0.5mg/ml或更高、0.6mg/ml或更高、0.7mg/ml或更高、0.8mg/ml或更高、0.9mg/ml或更高、1.0mg/ml或更高、1.5mg/ml或更高、2.0mg/ml或更高、2.5mg/ml或更高、3.0mg/ml或更高、3.5mg/ml或更高、4.0mg/ml或更高、4.5mg/ml或更高、5.0mg/ml或更高和5.5mg/ml或更高。核酸结合蛋白的（总）浓度的上限并无特别限制，并且其实例包括10.0mg/ml或更低、9.0mg/ml或更低、8.0mg/ml或更低、7.0mg/ml或更低和6.0mg/ml或更低。

<溶液>

通过将核酸结合蛋白和寡核苷酸在溶剂中混合，来制备含有核酸结合蛋白和寡核苷酸的溶液（本发明的溶液）。在其中混合核酸结合蛋白和寡核苷酸的溶剂的实例包括但不限于水和缓冲液。

除核酸结合蛋白和寡核苷酸之外，本发明的溶液还可以含有其它成分。本发明的溶液的组成并无特别限制，只要可以实现本发明的效果，并且它可以考虑寡核苷酸的类型和浓度、核酸结合蛋白的类型和浓度、其它成分的类型和浓度、预期用途、贮存温度等等来适当地确定。

本发明的溶液优选含有缓冲成分。在本发明中，“缓冲成分”指具有减少溶液中的氢离子浓度（ph）的波动的能力的化合物或混合物。本发明的溶液中含有的缓冲成分的优选实例包括但不限于tris、n,n-二羟乙基甘氨酸(bicine)、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、hepes和磷酸盐（磷酸钠、磷酸钾等）。特别地，tris、n,n-二羟乙基甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、hepes或磷酸盐优选用作本发明中的缓冲成分。例如，te缓冲液可以用作用于混合核酸结合蛋白和寡核苷酸的溶剂。te缓冲液是用于溶解和/或贮存核酸的标准溶液，并且作用于预防核酸降解。te缓冲液的通常组成包含10mmtris-hcl（ph7.2-8.0）和1mmedta。

将本发明的溶液的ph适当地调节在例如ph6.0至ph10.0，优选ph6.5至ph9.5，且更优选ph7.0至ph9.0的范围内。当将本发明的溶液置于pcr反应溶液中时，应该考虑反应温度、dna聚合酶和所使用的其它成分来优化缓冲成分的类型、浓度和ph。

本发明的溶液可以进一步含有对于扩增靶核酸必需或有用的成分，例如脱氧核糖核苷酸、酶（dna聚合酶、逆转录酶等）、金属盐、表面活性剂等。此外，本发明的溶液可以进一步含有对于检测经扩增的靶核酸必需或有用的成分，例如嵌入染料等。

本发明的溶液中含有的脱氧核糖核苷酸可以是任何脱氧核糖核苷酸，其可以是用于酶（dna聚合酶、逆转录酶等）的底物。脱氧核糖核苷酸的实例包括在天然dna中发现的具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶碱基的核苷酸，及其混合物。一般而言，dna聚合酶使用具有三个磷酸部分的脱氧核糖核苷酸作为用于核酸合成反应的底物。因此，在一个实施方案中，本发明的溶液含有的脱氧核糖核苷酸选自脱氧核糖核苷三磷酸（例如，datp、dctp、ditp、dgtp和dttp）及其衍生物。脱氧核糖核苷酸衍生物包括[αs]datp、7-脱氮-dgtp、7-脱氮-datp和对核酸裂解性降解抗性的脱氧核苷酸衍生物。核苷酸衍生物的实例包括用例如放射性同位素诸如32p或35s、荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或酶标记用于检测的脱氧核糖核苷酸。

本发明的溶液可以含有dna聚合酶。当本发明的溶液用于pcr时，本发明的溶液中含有的dna聚合酶优选为热稳定的dna聚合酶。可以用于本发明中的dna聚合酶的实例包括衍生自以下的dna聚合酶：真细菌例如属于栖热菌属（thermus）或芽孢杆菌属（bacillus）的细菌（水生栖热菌（thermusaquaticus）、嗜热栖热菌（thermusthermophilus）、热坚芽抱杆菌（bacilluscaldotenax）等）、古细菌例如属于火球菌属（pyrococcus）或热球菌属（thermococcus）的细菌（激烈火球菌（pyrococcusfuriosus）、thermococcuslitalris、thermococcuskodakaraensis等）。此外，上述dna聚合酶的突变体也可以用于本发明中。

本发明的溶液中可以含有两种或更多种dna聚合酶。例如，在本发明中可以使用具有3'→5'核酸外切酶活性的dna聚合酶和基本上不具有3'→5'核酸外切酶活性的另一种dna聚合酶的组合。使用此类dna聚合酶组合的技术被称为lapcr（长片段精确pcr(longandaccuratepcr)）。

本发明的溶液可以含有逆转录酶。本发明的溶液中含有的逆转录酶可以是任何逆转录酶，其具有逆转录活性，即合成与模板rna互补的dna的活性。逆转录酶的实例包括衍生自病毒的逆转录酶，例如莫洛尼鼠白血病病毒（mmlv）衍生的逆转录酶、以及禽成髓细胞瘤病毒（amv）衍生的逆转录酶及其变体。逆转录酶的进一步实例包括衍生自真细菌的热稳定逆转录酶（具有逆转录酶活性的dna聚合酶），例如衍生自栖热菌属细菌（例如嗜热栖热菌）的dna聚合酶、以及衍生自嗜热芽孢杆菌细菌（热坚芽孢杆菌）的dna聚合酶。

本发明的溶液可以含有金属盐。例如，可以使用对于dna聚合酶活性必需的二价金属离子盐。二价金属离子的实例包括镁离子、锰离子和钴离子。适合于每种dna聚合酶的二价金属离子及其浓度是本领域已知的。二价金属离子可以以盐例如氯化物、硫酸盐、乙酸盐等的形式提供。本发明的溶液中含有的二价金属离子的浓度的实例包括但不限于0.1至200mm，优选0.2至100mm，且更优选0.5至50mm。盐的种类和浓度应该根据待使用的酶（dna聚合酶、逆转录酶等）的金属需求、用于制备含有该酶的反应溶液的程序等进行优化。本发明的溶液可以进一步含有其它盐（钠盐、钾盐、铵盐等）。

本发明的溶液可以含有嵌入染料。本发明的溶液中待含有的嵌入染料指其荧光通过嵌入双链核酸内得到增强的染料。本发明中使用的嵌入染料优选为可以用于pcr中的嵌入染料。嵌入染料的实例包括sybr（注册商标）greeni、tbgreen（注册商标）、syto-60、syto-62、popo-3、toto-3、bobo-3、to-pro-3、yo-pro-1和sytoxorange，并且其中sybr（注册商标）greeni和tbgreen（注册商标）是优选的。

sybr（注册商标）greeni是商购可得的不对称花菁染料，并且其结构已由zipperh等人（"nucleicacidsresearch"，2004，第32卷，第12期，e103）显示。根据zipperh等人，可从lifetechnologies获得的用dmso稀释10,000倍的sybr（注册商标）greeni溶液（1x浓度）中sybr（注册商标）greeni的摩尔浓度为约2μm。

本发明的溶液可以含有表面活性剂。本发明的溶液中待含有的表面活性剂的实例包括但不限于非离子表面活性剂，例如triton（注册商标）x-100（聚氧乙烯（10）辛基苯基醚）、tween（注册商标）20（聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯）和nonidet（注册商标）p-40（辛基苯基聚乙二醇）；阴离子表面活性剂，例如聚（乙二醇）4-壬基苯基3-磺丙基醚（pnse）；阳离子表面活性剂，例如二硬脂基二甲基氯化铵；以及两性表面活性剂，例如椰油酰胺丙基甜菜碱。

本发明的溶液中含有的表面活性剂的浓度并无特别限制。当本发明的溶液用于pcr中时，调节本发明的溶液中含有的表面活性剂的浓度，使得表面活性剂以合适的浓度包含在待制备的pcr反应溶液中。

<制备>

含有核酸结合蛋白和寡核苷酸的溶液（本发明的溶液）通过在溶剂中混合核酸结合蛋白和寡核苷酸以及需要时的其它成分来制备。制备方法并无特别限制。优选预先制备溶液，每种溶液含有以高浓度的成分之一，和将所需量的每种溶液序贯置于容器中。成分的混合次序并无特别限制，只要可以实现本发明的效果。在所有成分置于容器中之后，将它们轻轻搅拌并混合，直到所有成分变得均质。例如，通过吹吸或颠倒混合执行搅拌。

<贮存>

因此制备的本发明的溶液可以分配在容器中，然后贮存。本发明中使用的容器的材料并无特别限制，只要可以实现本发明的效果。至少，容器优选由对寡核苷酸具有低吸附性的材料制成。用于本发明中的容器的尺寸和形状并无特别限制，只要可以实现本发明的效果。分配方法和分配量并无特别限制，只要可以实现本发明的效果。

在上述步骤中制备的溶液，即“含有核酸结合蛋白和核酸的溶液（本发明的溶液）”在低温下贮存。

在本发明中，“低温”并无特别限制，只要可以实现本发明的效果。考虑到寡核苷酸的类型和浓度、核酸结合蛋白的类型和浓度、以及寡核苷酸和核酸结合蛋白的混合比、其它成分的类型和浓度、贮存时间等等，可以适当地确定低温。低温的实例包括但不限于4℃或更低、0℃或更低、-10℃或更低、-20℃或更低、-30℃或更低、-40℃或更低、-50℃或更低、-60℃或更低、−70℃或更低以及−80℃或更低。溶液在其下是冷冻的温度是优选的。

用于贮存本发明的溶液的时间并无特别限制，只要可以实现本发明的效果，并且可以考虑寡核苷酸的类型和浓度、核酸结合蛋白的类型和浓度以及寡核苷酸与核酸结合蛋白的混合比、其它成分的类型和浓度、贮存温度等等来适当地确定。贮存时间的实例包括但不限于24小时或更久、2天或更久、3天或更久、4天或更久、6天或更久、1周或更久、2周或更久、3周或更久、4周或更久、5周或更久、6周或更久、7周或更久以及8周或更久。贮存时间的上限并无特别限制，并且其实例包括10年或更短、9年或更短、8年或更短、7年或更短、6年或更短、5年或更短、4年或更短、3年或更短、2年或更短、1年或更短以及直到有效期的时间。可以在其中本发明的溶液可以实现效果的范围内适当地确定有效期。

当溶液以冷冻状态贮存时，它可以通过合适的方法融化，然后使用。融化方法并无特别限制。例如，将包含冷冻溶液的容器在室温下静置，从而可以使冷冻溶液融化。例如，将含有冷冻溶液的容器静置在冰中（或冰上）或恒温水浴中，从而可以使冷冻溶液融化。

可以使用已知的核酸分析方法来分析通过本发明的寡核苷酸贮存方法贮存的寡核苷酸。此类核酸分析方法的实例包括用于定量核酸的方法，以及使用核酸扩增反应如pcr用于分析扩增产物的方法。

在本发明的一个方面，通过本发明的寡核苷酸贮存方法贮存的寡核苷酸在已知的核酸分析方法中用作引物或探针。此类核酸分析方法的实例包括核酸模板的互补链的合成（例如，cdna的合成）、靶核酸的扩增（例如，pcr方法）、核酸通过各种杂交方法的检测和定量等等。含有引物的本发明的溶液可以含有单个引物，能够扩增靶核酸的一对引物，或其各自对应于多种靶核酸中的每一种的多对引物。类似地，含有探针的本发明的溶液可以含有一种或多种探针。此外，在本发明的另一个方面，本发明的溶液含有一种或多种引物和一种或多种探针。

本发明的一个方面提供了使用本发明的溶液中含有的寡核苷酸作为引物或探针的核酸扩增反应。通过将本发明的溶液与核酸扩增反应所需的各种成分混合以制备反应溶液，来执行核酸扩增反应。关于核酸扩增反应所需的成分是本领域技术人员众所周知的。成分的通常实例包括dna聚合酶、二价金属离子、脱氧核糖核苷三磷酸和缓冲成分。然而，适当时也可以使用其它成分。当本发明的溶液中含有的一种或多种寡核苷酸是引物或一对引物时，将合适的模板核酸或可能含有模板核酸的样品加入反应溶液中。核酸扩增反应可以用于模板核酸的定性检测和/或定量。

对于使用核酸扩增过程的监测结果的dna定量，可以使用本领域已知的方法。例如，通过以下制备校准曲线：制备具有核苷酸序列的标准dna（阳性对照dna）的稀释系列，所述核苷酸序列是用于通过待用于核酸扩增反应的引物对的核酸扩增的模板，然后使用每种稀释液物作为模板执行实时pcr以计算ct值。基于校准曲线，可以定量样品中的dna。作为标准dna，例如，可以使用质粒dna。用于计算ct值的方法的实例包括以下：包括将阈值和扩增曲线的交叉点评估为ct值的方法（交叉点方法）；以及包括找到扩增曲线的二阶导数，并且将最大点评估为ct值的方法（二阶导数最大值方法）。

该方法可以进一步包括执行解链曲线分析的步骤。在解链曲线分析中，在核酸扩增反应之后，反应溶液的温度逐渐升高，并且同时，监测来自嵌入染料的荧光信号。在低温下，核酸扩增产物形成双链并显示强荧光信号。当达到一定温度时，双链解离成单链，并且来自嵌入染料的荧光信号强度快速降低。在此时，温度是解链温度（tm值）。可以通过解链曲线分析来检查扩增产物的tm值，以确定它是否是特异性扩增产物。

使用标记探针的核酸检测/定量方法是已知的。该方法的通常实例包括使由荧光物质和猝灭物质双重标记的探针与靶核酸接触，使得当探针和靶核酸杂交时，探针被切割。可以基于在探针被切割时生成的荧光来检测和/或定量靶核酸。此类方法的实例包括taqman法，其包括通过具有5'→3'核酸外切酶活性的dna聚合酶切割探针；以及循环探针法，其包括通过核糖核酸酶h切割dna/rna嵌合探针。本发明的溶液可以含有可以用于如上所述目的的标记探针（寡核苷酸）。

作为一个实施方案，含有待用于靶核酸扩增的引物对和核酸结合蛋白的本发明的溶液可以进一步含有核酸扩增反应所需的成分（除模板核酸外）（预混合物溶液）。向此类溶液中，加入模板核酸或可能含有模板核酸的样品，并且从而可以容易地制备用于核酸扩增的反应溶液，其对于模板核酸的快速检测和定量是有用的。由于即使在溶液长时间贮存后核酸扩增反应的效率也不会降低，因此可以以良好的再现性执行检测和定量。

（2）本发明的“用于扩增靶核酸的试剂盒”

作为一个实施方案，含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的本发明的溶液可用于靶核酸的检测或扩增。当本发明的溶液在低温下贮存时，寡核苷酸的降解被进一步抑制。因此，优选通过使用在低温下贮存的本发明的溶液，可以以良好的再现性执行靶核酸的检测和定量。寡核苷酸的实例包括充当用于检测靶核酸的探针的寡核苷酸，以及充当靶核酸的扩增中的引物的寡核苷酸。因此，在本发明的一个方面，提供了用于扩增靶核酸的试剂盒（下文称为“本发明的试剂盒”），其包含含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液。

本发明的试剂盒可以进一步包含对于核酸扩增必需或有用的各种成分，例如上述酶（例如dna聚合酶、逆转录酶等）、金属盐（例如二价金属离子）、脱氧核糖核苷酸（例如脱氧核糖核苷三磷酸）、缓冲成分、表面活性剂等等。这些成分可以是例如选自dna聚合酶、二价金属离子、脱氧核糖核苷三磷酸和缓冲成分的一种或多种成分。对于核酸扩增必需或有用的每种成分可以作为分开的组分包含在试剂盒中，或者对于核酸扩增必需或有用的两种或更多种成分可以作为一种组分包含在试剂盒中。此外，含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液可以含有这些成分中的一种或多种。

作为本发明的试剂盒的一个方面，包含含有核酸结合蛋白和与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液、以及含有dna聚合酶的溶液的组合的试剂盒可用于靶核酸的扩增和检测。当与靶核酸杂交的寡核苷酸是引物时，可以将两种溶液混合以制备用于靶核酸扩增的反应溶液。当与靶核酸杂交的寡核苷酸是探针时，可以使用合适的引物以及两种溶液来制备用于靶核酸扩增的反应溶液。含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液，或者含有dna聚合酶的溶液，可以进一步含有如上所述对于核酸扩增必需或有用的一种或多种成分。例如，试剂盒可以包含含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的第一溶液，以及含有选自dna聚合酶、二价金属离子、脱氧核糖核苷三磷酸和缓冲液成分的一种或多种要素的第二溶液。如上所述的每种组分贮存在分开的容器中，或者第一溶液和第二溶液贮存在分开的容器中。

本发明的试剂盒的另一个方面的实例是包含以下作为组分的试剂盒：含有对于核酸扩增反应所需的所有成分及其它成分（除模板核酸外）、以及与靶核酸杂交的寡核苷酸和核酸结合蛋白的溶液（预混合物溶液）。预混合物溶液的实例是含有dna聚合酶、二价金属离子、脱氧核糖核苷三磷酸和缓冲成分以及核酸结合蛋白和与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液。这种试剂盒可用于模板核酸的快速检测和定量，因为可以通过将模板核酸或可能含有模板核酸的样品加入试剂盒的组分中，来容易地制备用于核酸扩增的反应溶液。由于即使在试剂盒长期贮存后核酸扩增反应的效率也不会降低，因此可以以良好的再现性执行检测和定量。

在本发明的一个优选方面，本发明的试剂盒可以含有具有靶核酸的至少部分核苷酸序列的阳性对照核酸、用于样品预处理中的试剂等等。

本发明的另一个方面提供了核酸结合蛋白用于稳定地贮存寡核苷酸的用途。根据这个方面，通过使用含有所贮存的寡核苷酸的反应溶液，预防了核酸扩增反应中的核酸扩增效率的降低。具体地，本发明的“核酸结合蛋白的使用”可以如本发明的“寡核苷酸贮存方法”中所述执行，并且可用于靶核酸扩增/检测方法，以及待用于该方法中的试剂盒的产生。

本发明的试剂盒优选在低温下贮存直至使用。特别优选地，在本发明的试剂盒中，含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液在低温下贮存。尽管本发明不受特别限制，但含有核酸结合蛋白以及与靶核酸杂交的寡核苷酸的溶液期望地以冷冻状态贮存。

实施例

通过下述实施例进一步具体说明本发明，本发明的范围并不限于所述实施例。

制备实施例1：cspa储备溶液的制备

根据s.chatterjee等人（j.biochem.，1993，114，663-669）中描述的方法，将大肠杆菌cspa蛋白表达并纯化，然后制备cspa储备溶液[10mg/mlcspa蛋白、20mmtris-hcl（ph7.8（4℃））、100mmnacl、1mmedta、1mmdtt、50%甘油]。将cspa储备溶液分配到管内，并且以冷冻状态贮存在−20℃下直至使用。

制备实施例2：引物储备溶液的制备

将inva_f-6引物（seqidno：1）、inva_r-6引物（seqidno：2）和stx1_r-2引物（seqidno：3）各自溶解于te缓冲液（ph8.0）中。制备引物储备溶液（100μm）。将引物储备溶液分配到管内，并且以冷冻状态贮存在−20℃下直至使用。

实施例1：引物混合物溶液的pcr反应性随时间的降低

将引物储备溶液和te缓冲液混合，以制备引物混合物溶液。制备的引物混合物溶液含有在te缓冲液中的inva_f-6引物（10μm，seqidno：1），inva_r-6引物（10μm，seqidno：2）和stx1_r-2引物（10μm，seqidno：3）。

将引物混合物溶液分配到管内，并且以冷冻状态贮存在−20℃下。在冷冻之前，使引物混合物溶液经受pcr，并且在开始冷冻引物混合物溶液后的3、5、7和10天，使冷冻的引物混合物溶液解冻且经受pcr。关于冷冻前的引物混合物溶液，在制备后立即使其经受pcr。关于冷冻保存的引物混合物溶液，在将其解冻后迅速使其经受pcr。在下述实施例中，以相同的方式执行pcr。

制备pcr反应溶液（n=2）。具体地，混合2.5μl引物混合物溶液、12.5μltakara肠道致病菌基因检测试剂盒（rr139a，由takarabioinc.制造）中包含的responsemixfast、0.25μl100xsybr（注册商标）greeni（由takarabioinc.制造）和无菌水，以便使最终体积为25μl。pcr和荧光检测用thermalcyclerdice（注册商标）realtimesystemiii（tp950，由takarabioinc.制造）执行。根据下述反应条件执行pcr：在94℃下预热30秒，然后是45循环反应，其中每个循环由90℃1秒和64℃10秒组成。最后，执行涉及随时间从68℃到90℃的温度升高的解离反应，以观察在每个温度点时的荧光强度。作为对照，使用含有5pg沙门氏菌（salmonella）基因组作为模板dna的反应溶液执行相同的测量。

作为实例，当如上所述使冷冻前的引物混合物溶液经受pcr时获得的扩增曲线和解链曲线分别显示于图1和图2中。如图1中所示，当使用包含模板dna的反应溶液（对照）时，与其中使用不含模板dna的反应溶液的情况相比，荧光更快地上升。在图2中，接近85℃的峰衍生自inva基因片段的扩增产物，并且接近73℃的峰衍生自非特异性扩增产物。这些结果显示，当使用不含模板dna的反应溶液时，形成非特异性扩增产物。换言之，可以通过分析扩增曲线和解链曲线来监测非特异性扩增产物的形成。

基于测量结果，计算使用不含模板dna的反应溶液获得的ct值中随时间的变化，且示于图3中。如图3中所示，当使用冷冻保存的引物混合物溶液时，尽管反应溶液不含模板dna的事实，ct值仍随时间降低。这一结果显示随着引物混合物溶液的贮存时间变得更长，非特异性扩增产物趋于形成。

实施例2：通过向引物混合物溶液中添加cspa的pcr反应性维持

制备含有三种引物和添加剂（cspa或tween20）的引物混合物溶液。具体地，以与实施例1中相同的方式制备含有cspa的引物混合物溶液，除了cspa蛋白（由takarabioinc.制造）进一步以4mg/ml的最终浓度添加之外。以与实施例1中相同的方式制备含有tween20的引物混合物溶液，除了tween（注册商标）20（由nacalaitesque制造）以0.5%的最终浓度添加之外。作为对照，制备不含添加剂的引物混合物溶液，并且用作te对照。

将这些引物混合物溶液分配到管内，并且以冷冻状态贮存在-20℃下。在冷冻之前，使引物混合物溶液经受pcr，并且在开始冷冻引物混合物溶液后的3和6天，使冷冻的引物混合物溶液解冻且经受pcr。通过与实施例1中所述相同的方法制备pcr反应溶液（n＝4），并且在实施例1中所述的条件下执行pcr。为了使pcr条件一致，当te对照和含有tween20的引物混合物溶液用于制备pcr反应溶液时，将cspa蛋白加入pcr反应溶液中。基于测量结果，计算使用不含模板dna的反应溶液获得的ct值，并且显示于图4中。

如图4中所示，通过向引物混合物溶液中添加cspa或tween20，抑制了ct值中的降低。特别地，通过添加cspa有效地抑制ct值中的降低。这一结果显示通过伴随cspa的添加贮存引物混合物溶液，可以抑制非特异性扩增产物的形成。

实施例3：cspa浓度的评估（第一次）

制备含有三种引物和以不同浓度的cspa的引物混合物溶液。具体地，以与实施例1中相同的方式制备含有以不同浓度的cspa的引物混合物溶液，除了cspa蛋白进一步以4mg/ml的最终浓度或以2mg/ml的最终浓度添加之外。作为对照，制备不含cspa的引物混合物溶液，并且用作te对照。

将这些引物混合物溶液分配到管内，并且以冷冻状态贮存在-20℃下。在冷冻之前，使引物混合物溶液经受pcr，并且在开始冷冻引物混合物溶液后的3和6天，使冷冻的引物混合物溶液解冻且经受pcr。通过与实施例1中所述相同的方法制备pcr反应溶液（n＝4），并且在实施例1中所述的条件下执行pcr。为了使pcr条件一致，当te对照和含有2mg/mlcspa的引物混合物溶液用于制备pcr反应溶液时，将cspa蛋白加入pcr反应溶液中。基于测量结果，计算使用不含模板dna的反应溶液获得的ct值，并且显示于图5中。

如图5中所示，当使用含有最终浓度为4mg/ml或2mg/ml的cspa的引物混合物溶液时，与其中使用不含cspa的引物混合物溶液（te对照）的情况相比，抑制了ct值中的降低。这一结果显示通过伴随cspa以4mg/ml的最终浓度或2mg/ml的最终浓度的添加贮存引物混合物溶液，可以抑制非特异性扩增产物的形成。

实施例4：cspa浓度的评估（第二次）

制备含有三种引物和以不同浓度的cspa的引物混合物溶液。具体地，以与实施例1中相同的方式制备含有以不同浓度的cspa的引物混合物溶液，除了cspa蛋白进一步以4mg/ml的最终浓度、以1mg/ml的最终浓度或以0.25mg/ml的最终浓度添加之外。作为对照，制备不含cspa的引物混合物溶液，并且用作te对照。

将这些引物混合物溶液分配到管内，并且以冷冻状态贮存在-20℃下。在冷冻之前，使引物混合物溶液经受pcr，并且在开始冷冻引物混合物溶液后的3和6天，使冷冻的引物混合物溶液解冻且经受pcr。通过与实施例1中所述相同的方法制备pcr反应溶液（n＝4），并且在实施例1中所述的条件下执行pcr。为了使pcr条件一致，当te对照、含有1mg/mlcspa的引物混合物溶液和含有0.25mg/mlcspa的引物混合物溶液用于制备pcr反应溶液时，将cspa蛋白加入pcr反应溶液中。基于测量结果，计算使用不含模板dna的反应溶液获得的ct值，并且显示于图6中。

如图6中所示，ct值取决于cspa的浓度而降低。这一结果显示取决于加入引物混合物溶液中的cspa的浓度，可以抑制非特异性扩增产物的形成。

实施例5：通过向引物混合物溶液中添加核酸结合蛋白的pcr反应性维持

制备包含三种引物和核酸结合蛋白（cspa、t4ssb或大肠杆菌ssb）的引物混合物溶液。具体地，当制备含有inva_f-6引物（20μm，seqidno：1）、inva_r-6引物（20μm，seqidno：2）和stx1_r-2引物（20μm，seqidno：3）的te缓冲液时，进一步添加cspa蛋白（最终浓度：4mg/ml）、t4噬菌体衍生的ssb蛋白（最终浓度：2mg/ml，由bioacademia制造）、或大肠杆菌ssb蛋白（最终浓度：2mg/ml，由bioacademia制造），以制备含有核酸结合蛋白的引物混合物溶液。作为对照，制备不含核酸结合蛋白的引物混合物溶液，并且用作te对照。

将这些引物混合物溶液分配到管内，并且以冷冻状态贮存在-20℃下。在冷冻之前，使引物混合物溶液经受pcr，并且在开始冷冻引物混合物溶液后的2、5和9天，使冷冻的引物混合物溶液解冻且经受pcr。

制备pcr反应溶液（n=4）。具体地，混合1.25μl引物混合物溶液、12.5μlresponsemixfast、0.25μl100xsybr（注册商标）greeni和无菌水，以便使最终体积为25μl。在实施例1中所述的条件下执行pcr。为了使pcr条件一致，当te对照用于制备pcr反应溶液时，将cspa蛋白加入pcr反应溶液中。基于测量结果，计算使用不含模板dna的反应溶液获得的ct值（比率），并且显示于图7中。

如图7中所示，通过向引物混合物溶液中添加核酸结合蛋白（cspa、t4ssb或大肠杆菌ssb），抑制了ct值中的降低。这一结果显示通过伴随核酸结合蛋白的添加贮存引物混合物溶液，可以抑制非特异性扩增产物的形成。

实施例6：通过向预混合物溶液中添加cspa的pcr反应性维持

制备含有除模板dna之外的对于pcr必需的成分（引物、dntp、酶、荧光染料等）和cspa的预混合物溶液。具体地，制备的预混合物溶液每14.5μl体积含有inva_f-6引物（1.7μm，seqidno：1）、inva_r-6引物（1.7μm，seqidno：2）、stx1_r-2引物（1.7μm，seqidno：3）、reactionmixfast（12.5μl）、sybr（注册商标）greeni（1.7x）和cspa（0.69mg/ml）。作为对照，制备不含cspa的预混合物溶液，并且用作te对照。

将这些预混合物溶液分配到管内，并且以冷冻状态贮存在-20℃下。在冷冻之前，使预混合物溶液经受pcr，并且在开始冷冻预混合物溶液后的3和7天，使冷冻的预混合物溶液解冻且经受pcr。具体地，将14.5μl预混合物溶液和10.5μl无菌水混合，以制备pcr反应溶液，并且在实施例1中所述的条件下执行pcr（n＝4）。基于测量结果，计算使用不含模板dna的反应溶液获得的ct值，并且显示于图8中。

如图8中所示，通过向预混合物溶液中添加cspa，抑制了ct值中的降低。这一结果显示通过伴随cspa的添加贮存预混合物溶液，可以抑制非特异性扩增产物的形成。

工业适用性

本发明可用于包括基因工程、生物学、医学和农业的广泛范围的领域中。

序列表自由文本

seqidno:1；pcr引物"inva_f-6"

seqidno:2；pcr引物"inva_r-6"

seqidno:3；pcr引物"stx1_r-2"。

序列表

<110>takarabioinc.

<120>用于保存寡核苷酸的方法

<130>674197

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<213>人工序列

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