经改造的T-细胞调节分子及其使用方法与流程

在先申请的交叉引用

本申请根据《巴黎公约》要求2017年3月29日提交的第62/478,198号美国临时专利申请和2017年11月27日提交的第62/590,848号美国临时专利申请的优先权，每一项申请以引文的方式全文纳入本说明书。

本公开一般涉及经改造的t-细胞调节分子。具体地，本公开涉及经改造的t-细胞活化的v-结构域免疫球蛋白抑制剂(vista)、抑制t细胞的程序性死亡-配体1(pd-l1)和b7同系物4(b7-h4)分子，以及刺激t细胞的经改造的可诱导共刺激配体(icos-l)分子。

背景技术：

t-细胞活性受到由于t-细胞和抗原呈递细胞(apc)/癌细胞上存在的免疫检查点(ic)细胞表面分子的结合而产生的共刺激和共抑制信号调控。这些信号有助于在保持自我耐受时抵御入侵的病原体和/或恶性细胞。通过以cd28：cd80/cd86、icos：icos-l、ox-40：ox-40l和4-1bb：4-1bbl为示例的共刺激检查点对上调t-细胞反应，和/或通过包含ctla-4：cd80/cd86、pd-1：pd-l1的共抑制检查点分子下调t-细胞反应(参考文献1-4)。然而仍有一些t-细胞共抑制对没有被完全表征，包括被vista和b7-h4识别的受体。到目前为止，已经鉴定了几种抑制t-细胞活性的负检查点受体，包括pd-1和ctla-4。已表明，这些通路的抗体介导的阻断可以促进抗肿瘤免疫应答(参考文献1-3)，而激活这些免疫抑制通路的配体可能抑制与自身免疫性和/或炎症性疾病相关的失控免疫应答(参考文献4-6)。与此相反，激活t-细胞中的共刺激通路，如icos：icos-l和ox40：ox40l可导致t-细胞活化、增殖和细胞因子的产生；可促进抗肿瘤免疫应答的结果。

许多已知的免疫检查点对是b7-cd28家族表面蛋白的成员，部分通过含有ig-v/lg-c的细胞外结构域来对它们进行定义。这些对包含icos：icos-l、ctla-4：cd80/cd86、pd-1：pd-l1以及vista和b7-h4(参考文献7)。

t-细胞活化的v结构域免疫球蛋白抑制剂(″vista″，也可称为pd-1h、dd1α、sisp1、dies1、c10orf54和/或gi24)是这样的检查点配体：其主要在cd11b高骨髓细胞上表达并且在与假定的细胞表面受体(vista-受体)结合后负调控t-细胞应答(参考文献8-9)。vista也在初始cd4+和cd8+t细胞上表达，此时认为它负调控t-细胞应答，这表明vista作为检查点配体和受体发挥双重作用(参考文献10)。在结构上，vista与pd-1和pd-l1具有显著的同源性，具有n-末端igv结构域，接着是一个单次跨膜结构域和胞质尾区。与pd-1：pd-l1通路类似，在小鼠模型中已证实使用单克隆抗体的vista阻断可引起抗肿瘤免疫应答，这表明vista：vista-受体信号通路在促进肿瘤免疫逃避中的作用(参考文献11-12)。vista也可能在调节自身免疫性疾病的进展中发挥作用。例如，在易患狼疮的背景情况下繁殖的vista缺陷(vista-/-)小鼠发生加速且严重的系统性红斑狼疮(sle)(参考文献13)。vista-/-2d2t细胞受体转基因小鼠表现出外周致脑炎性t-细胞水平升高，并发展为一种恶化形式的实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)(参考文献14)。在c57bi/6背景情况下繁殖的vista-/-小鼠表现出轻度的促炎症表型，例如树突状细胞增多和t-细胞活化标记物增多，但未见发生炎症性疾病的报道(参考文献14)。略微不同的，另一项研究记载了一种更严重的表型，即vista-/-c57bi/6小鼠在10个月龄时就出现了血管球性肾炎(参考文献15)。总之，这些研究表明，促进vista介导的免疫抑制可能适用于治疗自身免疫性疾病和/或炎症性疾病。

已报道了激动性抗vista抗体(参考文献16)，并且报道了当vista.fc固定在固体表面时，vista的二聚体(vista.fc)在体外抑制t-细胞的活化(参考文献8，11)。

被称为程序性死亡-1(pd-1)的抑制性共刺激分子在活化的t-细胞、b细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达，并与pd-l1(在造血细胞和非造血细胞上)和pd-l2(在dc和巨噬细胞上)结合(文献6，17-20)。pd-l1与淋巴细胞上的pd-1的结合，会发送抑制信号给t-细胞，以阻断tcr信号、t细胞和b细胞增殖、细胞因子的产生和cd8+t细胞的细胞毒性(参考文献4，17)。pdl-2是pd-1的第二配体，其抑制t-细胞活化(参考文献20)。已表明，pd-1激动剂pd-l1.fc可以改善两种cia小鼠模型的疾病结果(文献5，21)。

b7-h4是另一个b7家族成员，它是一个含有igv结构域的抑制配体。其受体最初被推测为btla-4，但目前仍不清楚(参考文献22)。已表明，b7-h4.fc在体内可以抑制免疫反应，例如通过它能够减轻cona诱导的小鼠肝损伤(参考文献23)并且限制在小鼠中cia的发展(参考文献24)来证明。

可诱导t-细胞共刺激因子(icos，也可称为cd278、h4或ailim)是b7结合蛋白cd28家族中的一种受体(参考文献25-27)，可被诱导在活化的t-细胞上表达(参考文献25、28、29)。当icos与apc上表达的其配体icos-l(b7-h2)结合后(文献30，31)，icos共刺激t-细胞，以增强由效应细胞因子(il-4、il-5、il-10、il-21、ifnγ、tnfα)的产生所反映的th1和th2功能(参考文献32-34)。

临床前的肿瘤研究表明，在抗ctla-4治疗的情况下，植入表达icos-l(以促进icos信号转导)的肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长减缓并且小鼠的生存率提高(文献35)。此外，对于使用抗ctla-4药剂治疗的患者的临床试验表明，icos-hit细胞的存在与对这些免疫检查点抑制剂的治疗响应增加有关(文献36，37)。这些结果表明使用icos激动剂作为增强抗肿瘤免疫应答的一项策略。第wo2016us23524号pct申请记载了靶向icos的激动性单克隆抗体。这些抗体被认为既能刺激免疫细胞以杀死肿瘤细胞，又能限制与抑制抗肿瘤免疫有关的treg的数量。

目前，仍然需要改进化合物和方法，以调节(regulating)或调节(modulating)t细胞活性，诱导免疫抑制和/或改善抗肿瘤免疫应答。

技术实现要素：

本发明提供了经改造的核酸、经改造的mrna、经改造的多肽和经改造的五聚体多肽(人和小鼠)，其中各自都包含一个可操作地连接到comp的五聚体化结构域上的vista、b7-h4、pd-l1和icos-l胞外结构域的序列。可溶形式的五聚体多肽在体外和体内都具有调节t细胞的活性。还提供了使用其治疗需要调节t细胞活性的受试者的方法。

在一个方面，提供了重组核酸。所述重组核酸包含：与序列为seqidno：1或2的编码t-细胞活化的v结构域ig抑制剂(vista)的胞外igv-结构域的核酸具有实质相似性的核酸；和与序列为seqidno：3或4的编码软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域的核酸具有实质相似性的核酸，编码含有胞外igv-结构域的vista多肽的核酸可操作地连接至编码comp的五聚体化结构域的核酸。

在实施方案中，重组核酸包含可操作地连接到seqidno：3上的seqidno：1。在实施方案中，重组核酸包含可操作地连接到seqidno：4上的seqidno：2。

在另一方面，提供了重组核酸。所述重组核酸包含：与序列为seqidno：26的编码b7-h4胞外结构域的核酸具有实质相似性的核酸；和与序列为seqidno：3的编码软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域的核酸具有实质相似性的核酸，编码b7-h4多肽的胞外结构域的核酸可操作地连接至编码comp的五聚体化结构域的核酸。

在另一方面，提供了重组核酸。所述重组核酸包含：与序列为seqidno：37的编码pd-l1的胞外结构域的核酸具有实质相似性的核酸；和与序列为seqidno：3的编码软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域的核酸具有实质相似性的核酸，编码pd-l1多肽的胞外结构域的核酸可操作地连接至编码comp的五聚体化结构域的核酸。

在另一方面，提供了重组核酸。所述重组核酸包含：与序列为seqidno：48的编码icos-l的胞外结构域的核酸具有实质相似性的核酸；和与序列为seqidno：3的编码软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域的核酸具有实质相似性的核酸，编码icos-l多肽胞外结构域的核酸可操作地连接至编码comp的五聚体化结构域的核酸。

在实施方案中，提供了包含本公开的重组核酸的表达载体。在实施方案中，表达载体还包含至少一个调控序列。在实施方案中，提供了包含表达载体的宿主细胞。

在一个方面，提供了重组信使核糖核酸(mrna)。mrna包含：与序列为seqidno：5或6的编码t细胞活化的v-结构域ig抑制剂(vista)的胞外结构域的mrna具有实质相似性的mrna；以及与序列为seqidno：7或8的编码软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域的mrna具有实质相似性的mrna，编码vistamrna的胞外结构域的mrna可操作地连接至编码comp的五聚体化结构域的mrna。

在实施方案中，重组mrna包含可操作地连接至seqidno：7上的seqidno：5。在实施方案中，重组mrna包含可操作地连接至seqidno：8上的seqidno：6。

在一个方面，提供了重组信使核糖核酸(mrna)。该mrna包含：与序列为seqidno：27的编码b7-h4胞外结构域的mrna具有实质相似性的mrna；和与序列为seqidno：7的编码软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域的mrna具有实质相似性的mrna，编码b7-h4mrna的胞外结构域的mrna可操作地连接至编码comp的五聚体化结构域的mrna。

在一个方面，提供了重组信使核糖核酸(mrna)。该mrna包含：与序列为seqidno：62的编码pd-l1胞外结构域的mrna具有实质相似性的mrna；和与序列为seqidno：7的编码软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域的mrna具有实质相似性的mrna，编码pd-l1mrna胞外结构域的mrna可操作地连接至编码comp的五聚体化结构域的mrna。

在一个方面，提供了重组信使核糖核酸(mrna)。该mrna包含：与序列为seqidno：61的编码icos-l的胞外结构域的mrna具有实质相似性的mrna；和与序列为seqidno：7的编码软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域的mrna具有实质相似性的mrna，编码icos-lmrna的胞外结构域的mrna可操作地连接至编码comp的五聚体化结构域的mrna。

在一个方面，提供了重组多肽。所述重组多肽包含：一种与t细胞活化的v-结构域ig抑制剂(vista)的胞外结构域(seqidno：9或10)具有实质相似性的多肽，其连接到与软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域(seqidno：11或12)具有实质相似性的多肽。

在实施方案中，重组多肽包含可操作地连接到seqidno：11上的seqidno：9。在实施方案中，重组多肽包含可操作地连接到seqidno：12上的seqidno：10。

在另一方面，提供了重组多肽。所述重组多肽包含：一种与b7-h4的胞外结构域(seqidno：25)具有实质相似性的多肽，其连接到与软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域(seqidno：11)具有实质相似性的多肽上。

在另一方面，提供了重组多肽。所述重组多肽包含：一种与pd-l1细胞外结构域(seqidno：36)具有实质相似性的多肽，其连接到与软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域(seqidno：11)具有实质相似性的多肽上。

在另一方面，提供了重组多肽。所述重组多肽包含：一种与icos-l的细胞外结构域(seqidno：49)具有实质相似性的多肽，其连接到与软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域(seqidno：11)具有实质相似性的多肽上。

在实施方案中，本发明提供的重组多肽为可溶形式。

在一个方面，提供了具有t细胞抑制活性的五聚体多肽。所述具有t细胞抑制活性的五聚体多肽包含：五个单体，每个单体包含：与t细胞活化的v-结构域ig抑制剂(vista)的胞外结构域(seqidno：9或10)具有实质相似性的多肽，其连接到与软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域(seqidno：11或12)具有实质相似性的多肽上。

在实施方案中，重组多肽包含与seqidno：11可操作地连接的seqidno：9。在实施方案中，五聚体多肽包含与seqidno：12可操作地连接的seqidno：10。在实施方案中，五聚体多肽为可溶形式。在实施方案中，可溶形式的五聚体多肽相比于包含vista的胞外结构域(seqidno：9或10)的可溶性二聚体多肽，具有增加的t细胞抑制活性。在实施方案中，增加的t细胞抑制活性包括针对t细胞活化和t细胞增殖的一种或多种增加的抑制作用。在实施方案中，可溶形式的五聚体多肽相比于包含vista胞外结构域(seqidno：9或10)的可溶性二聚体多肽，具有增加的体内免疫抑制活性。在实施方案中，增加的免疫抑制活性包括针对细胞因子分泌和细胞毒性淋巴细胞(ctl)产生的一种或多种增加的抑制作用。

在另一方面，提供了具有t细胞抑制活性的五聚体多肽。所述具有t细胞抑制活性的五聚体多肽包含：五个单体，每个单体包含：与b7-h4胞外结构域(seqidno：25)具有实质相似性的多肽，其连接到与软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域(seqidno：11)具有实质相似性的多肽上。

在实施方案中，五聚体多肽是可溶形式的。在实施方案中，所述可溶形式的五聚体多肽相比于包含b7-h4的胞外结构域(seqidno：25)的可溶性二聚体多肽，具有增加的t细胞抑制活性。在实施方案中，增加的t细胞抑制活性包括针对t细胞活化和t细胞增殖的一种或多种增加的抑制作用。在实施方案中，可溶形式的五聚体多肽相比于包含b7-h4的胞外结构域(seqidno：25)的可溶性二聚体多肽，具有增加的体内免疫抑制活性。在实施方案中，增加的免疫抑制活性包括针对细胞因子分泌和细胞毒性淋巴细胞(ctl)产生的一种或多种增加的抑制作用。

在另一方面，提供了具有t细胞抑制活性的五聚体多肽。所述具有t细胞抑制活性的五聚体多肽包括：五个单体，每个单体包括：与pd-l1的胞外结构域(seqidno：36)具有实质相似性的多肽，其连接到与软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域(seqidno：11)具有实质相似性的多肽上。

在实施方案中，所述五聚体多肽为可溶形式。在实施方案中，可溶形式的五聚体多肽相比于包含pd-l1的胞外结构域(seqidno：36)的可溶性二聚体多肽，具有增加的t细胞抑制活性。在实施方案中，增加的t细胞抑制活性包括针对t细胞活化和t细胞增殖的一种或多种增加的抑制作用。在实施方案中，可溶形式五聚体多肽相比于含有pd-l1的胞外结构域(seqidno：36)的可溶性二聚体多肽，具有增加的体内免疫抑制活性。在实施方案中，增加的免疫抑制活性包含针对细胞因子分泌和细胞毒性淋巴细胞(ctl)产生的一种或多种增加的抑制作用。

在另一方面，提供了具有t细胞刺激活性的五聚体多肽。具有t细胞刺激活性的五聚体多肽包括：五个单体，每个单体包括：与icos-l的胞外结构域(seqidno：49)具有实质相似性的多肽，其连接到与软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域(seqidno：11)具有实质相似性的多肽上。

在实施方案中，所述五聚体多肽是可溶形式的。在实施方案中，可溶形式的五聚体多肽相比于包含icos-l的胞外结构域(seqidno：49)的可溶性二聚体多肽，具有增加的t细胞刺激活性。在实施方案中，增加的t细胞刺激活性包括针对t细胞活化和t细胞增殖的一种或多种增加的刺激作用。在实施方案中，可溶形式的五聚体多肽相比于包含icos-l的胞外结构域(seqidno：49)的可溶性二聚体多肽，具有增加的体内免疫刺激活性。在实施方案中，增加的免疫刺激活性包括针对细胞因子分泌和细胞毒性淋巴细胞(ctl)产生的一种或多种增加的刺激作用。在实施方案中，可溶形式的五聚体多肽使效应t细胞：调节性t细胞的比例增加。

在一个方面，提供了药物组合物。所述药物组合物包括：本文提供的多肽、本文提供的宿主细胞和本文提供的五聚体多肽中的一种或多种；以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一个方面，提供了一种在有此需要的个体中诱发生物反应的方法。该方法包括：向个体给予治疗有效量的t细胞活化的v结构域ig抑制剂(vista)-软骨寡聚基质蛋白(comp)融合多肽(vista.comp)，所述vista.comp多肽具有seqidno：9并且与seqidno：11连接，或者具有seqidno：10并与seqidno：12连接，其中所述生物反应为下述的一种或多种：抑制t细胞活化；抑制t细胞增殖；减少t细胞分泌的一种或多种炎性细胞因子；抑制细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导；以及具有调节表型的t细胞的增多。在实施方案中，炎性细胞因子包括il-2和ifnγ中的一种或多种。

在一个方面，提供了一种在有此需要的个体中诱发生物反应的方法。所述方法包括向个体给予治疗有效量的b7-h4-软骨寡聚基质蛋白(comp)融合多肽(b7-h4.comp)，所述的b7-h4.comp多肽具有seqidno：25并与seqidno：11连接，其中所述生物反应为下述的一种或多种：抑制t细胞活化；抑制t细胞增殖；减少t细胞分泌的一种或多种炎性细胞因子；抑制细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导；以及具有调节表型的t细胞的增多。

在一个方面，提供了一种在有此需要的个体中诱发生物反应的方法。该方法包括向个体给予治疗有效量的pd-l1-软骨寡聚基质蛋白(comp)融合多肽(pd-l1.comp)，所述pd-l1.comp多肽具有seqidno：36并与seqidno：11连接，其中所述生物反应为下述的一种或多种：抑制t细胞活化；抑制t细胞增殖；减少t细胞分泌的一种或多种炎性细胞因子；抑制细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导；以及具有调节表型的t细胞的增多。

在一个方面，提供了一种在有此需要的个体中诱发生物反应的方法。所述方法包括向个体给予治疗有效量的icos-l-软骨寡聚基质蛋白(comp)融合多肽(icos-l.comp)，所述icos-l.comp多肽具有seqidno：49并与seqidno：11连接，其中所述生物反应为下述的一种或多种：刺激t细胞活化；刺激t细胞增殖；增加t细胞分泌的一种或多种炎性细胞因子；增加细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导；以及增加肿瘤微环境内效应t-细胞：调节t细胞的比率。在实施方案中，将icos-l.comp多肽与检查点阻断分子结合给予。在实施方案中，在给予检查点阻断分子的同时或之前或之后给予icos-l.comp多肽。在实施方案中，检查点阻断分子是抗pd-1抗体或抗ctla-4抗体。

附图说明

本发明的特点将在以下参考附图的详细说明中更为明显，在这些附图中：

图1a-g示出五聚体vista.comp，而不是二聚体vista-fc，在体外作为可溶性配体抑制t细胞的活化和增殖。

图1a显示，在存在(深灰色)或不存在(淡灰色)固定化(左图)或可溶性(右图)vista.fc(10μg/ml)的情况下，通过平板结合的抗-cd3抗体(2.5μg/ml)活化48小时的cfse标记的纯化的鼠cd4+t-细胞。vista.fc固定化后可抑制cd4+t细胞的增殖，而在培养基中以可溶性配体加入时则不能抑制cd4+t细胞的增殖。

图1b示出如方法所述，表达重组vista.comp，并且示出在存在或不存在还原剂(dtt)的情况下，通过sds-page和蛋白免疫印迹法检测纯度和五聚体状态。还原的vista.comp作为单一条带约50kda迁移，二硫化物稳定的五聚体的表观质量为250kda。

图1c显示在被包被(9μg/ml，左图)或可溶性(12μg/ml，右图)的vista.comp(深灰色)或comp(浅灰色)存在下，经历活化的cd4+t细胞的增殖试验结果。可溶性vista.comp抑制t-细胞扩张(上图，fsc和ssc散射图)和增殖(下图，cfse稀释)。

图1d和1e显示在comp或vista.comp(10μg/ml)存在下，在抗-cd3活化后48和72小时从cd4+t细胞收集的培养基的分析，其中通过elisa定量测定分泌的il-2(图1d)和ifnγ(图1e)。除增殖以外，发现vista.comp显著抑制体外t细胞分泌il-2和ifnγ(＊＊＊p＜0.005，相对于comp对照，n＝3)。

图1f显示在comp(浅灰色)或vista.comp(深灰色)存在的情况下，cfse标记的cd4+t细胞在所示浓度的固定化抗-cd3抗体作用下被活化。vista.comp对t细胞增殖的抑制被较强水平的tcr刺激所克服。

图1g显示同种异体的mlc试验结果，其中添加的vista.comp对于在野生型或cd200r1-/-小鼠的应答细胞中的ctl诱导具有显著的抑制作用(n＝3，＊p＜0.05，相对于cd200fc)。

图1h示出表达的人vista(hvista-comp)和mvista-comp的五聚体形式的sds-page。

图1i示出在可溶性comp或hvista.comp.存在下体外用concanclavina刺激的人t细胞的扩张(上)和cfse的增殖(下)。vista-comp抑制了在这些t-细胞中诱导的增殖。

图1j示出，与comp或vista-fc相比，在vista.comp存在下，在cona中培养时cd3+cd4+和cd8+t细胞中的t细胞活化标记物cd25的上调减少。

图2a-h说明vista.comp(图2c，深灰色)与克隆的t细胞系结合(白色未染色对照)，并抑制其活化(图2a-2b)。

图2a显示这样的2.10克隆t-细胞：其在固定化或可溶性vista.fc或vista.comp(10μg/ml)的存在下，在培养基中被固定的抗-cd3抗体(3μg/ml)活化，并且在培育24小时的最后6小时中通过用3h-胸苷脉冲细胞来测量增殖。如在原代cd4+t细胞中观察的，五聚体vista.comp在固定化或可溶性加入到培养基时都可以抑制增殖，而vista.fc仅在固定化时表现出抑制活性。(n＝3，＊＊p＜0.01，相对于抗-cd3刺激对照)。

图2b显示对如图a所示被活化的2.10细胞进行的可溶性vista.comp(深灰色)或vista.fc(淡灰色)的滴定。数据显示，高浓度可溶性vista.fc处理的细胞缺乏抗增殖功能(n＝3，＊p＜0.01)。

图2c显示与未染色对照(空直方图)相比，生物素化的comp、生物素化的vista.comp和vista.fc(阴影直方图)结合2.10克隆t细胞的facs分析。

图2d显示用可溶性vista.fc或vista.comp处理4小时的抗-cd3活化的2.10t细胞和通过icfc测定产生的il-2。只有vista.comp显著抑制分泌il-2的细胞的数量(n＝3，＊p＜0.05，相对于vista.fc或未处理的)。

图2e显示在6孔板上，在存在或不存在vista.comp的情况下，用固定化抗-cd3抗体培养1×10⁶2.10克隆t细胞10分钟。通过裂解各孔中的细胞并回收各孔的附着的蛋白(见方法中固相免疫沉淀(spip))，来回收与t-细胞受体(tcr)复合的蛋白质。然后用抗磷酸酪氨酸抗体(py：克隆4g10)对回收的蛋白质进行免疫印迹。vista.comp显著降低了tcr信号诱导的tcr复合蛋白的磷酸化。

图2f-h显示vista-fc或vista.comp与t细胞克隆结合的稳定性。

图2f显示在用facs染色缓冲液一步清洗后，vista-fc或对照-fc(同型对照)与2.10t细胞的结合。

图2g显示facs分析前两步清洗后vista-fc的结合。与a相关的结合信号的丢失表明vista-fc与细胞系之间存在微弱的瞬态相互作用。

图2h显示在两步清洗后，生物素化的vista.comp与2.10细胞和jurkat细胞的结合仍然保留，表明vista.comp与这些细胞的相互作用更加稳定。

图3a-e说明vista.comp抑制体内免疫应答。

图3a显示皮肤同种异体移植排斥反应模型的示意图。第0天，balb/c动物移植了c57bl/6小鼠的皮肤，然后在15天期间用vista.comp(15μg，静脉内(i.v.))或pbs(箭头)处理。移植存活率每天由一名不知情的调查员进行监测。

图3b显示用vista.comp处理显著延长了皮肤同种异体移植的存活时间(n＝6，通过mann-whitneyu-检验＊p＜0.05)。

图3c显示在注射con-a前1小时使用vista.comp处理，在24小时时挽救c57bl/6小鼠免于致死性肝损伤(n＝4)。

图3d和e显示注射con-a后3小时，存活率与血清中tnfα(n＝5，＊p＜0.05)(图3d)和il6(n＝5，＊p＜0.05)(图3e)的显著下降相关。

图4a-b说明两种不同的标签对vista.comp活性的影响。

图5a是b7-h4.comp和pd-l1.comp五聚体的示意图。

图5b是在expi293f细胞中表达的ni.nta纯化的还原型和氧化型b7-h4.comp、pd-l1.comp、vista.comp(+对照)和comp构建体的sds-page凝胶。

图6示出cfse-标记的纯化的鼠cd4+t细胞在所示的可溶性配体存在的情况下被平板结合的抗-cd3抗体(2c11)活化72小时。cfse稀释的facs分析表明相对于单独的comp或没有配体(-)，pd-l1.comp、b7-h4.comp和vista.comp都能抑制t细胞的扩张(上)和增殖(下)。

图6还示出t细胞不同于可溶性二聚体vista.fc，可溶性vista.comp可响应cd3-tcr信号转导而抑制t细胞增殖。

图7a示出静脉注射vista.comp，但不注射vista.fc(每3天一次)阻断小鼠皮肤异体移植排斥反应，直到停止处理(用星号标出)。

图7b示出在con-a前1小时，通过腹膜内注射vista.comp处理c57bl/6小鼠，在24小时挽救50％的小鼠免于致死性肝损伤(n＝13，p＜0.05)。vista.fc是无效的。垂死的动物被归类为无响应动物。数据由三个独立的试验合并。vista.comp处理的小鼠在注射con-a3小时后血清tnfa(n＝5，＊p＜0.05)和il6(n＝5，＊p＜0.05)明显降低。

图8a是人icos-l.comp五聚体的示意图。

图8b是表明icos-l.comp五聚体的纯度和分子量的蛋白免疫印迹和sds-page。

图9a示出如biacoret200表面等离子体共振实验测量的，hicos-l.comp与人和小鼠icos结合，而不与cd28结合。

图9b示出用表面等离子体共振技术测量的icos.fc与人icos-l.comp、hicos-fc和comp结合的特性。人icos-l.comp对icos的强亲和力通过测定的较慢解离速率(off-rate)(kd)和较低的解离常数(0.9nm)反映出来，与之相比icos-fc的解离常数则为2.9nm。

图9c示出facs分析，证明fitc标记的icos-l.comp与人cd3+cd4+和cd3+cd4-t细胞结合。

图9d示出facs分析，证明与活化的人cd3+t细胞结合的hicos-l.fc被人icos-l.comp竞争性置换。

图9e示出facs分析，证明与活化的小鼠cd4+t细胞结合的micos-fc被hicos-l.comp竞争性置换。

图10a示出基于cfse的t细胞增殖试验，证明使用可溶性icos-l.comp对人cd4+和cd8+t细胞进行强共刺激作用。

图10b示出facs分析，证明t细胞被人icos-l.comp活化会导致t细胞上cd25的表达增加(灰色轮廓)。

图10c显示基于cfse的t细胞增殖，证明可溶性hicos-l.comp而不是icos-fc共刺激从脐带血分离的cd3+cd4+人t细胞。

图10d示出facs分析，证明在不存在抗-cd3诱导的t细胞受体信号转导的情况下，icos-comp不会诱导从脐带血分离的人t细胞的增殖。

图10e示出cfset细胞增殖试验，证明与抗-cd3或抗-cd3/抗-cd28诱导的信号转导结合，可溶性hicosl-comp，而不是icosl-fc，共刺激cd3+cd4+和cd3+cd4-t细胞的增殖。从成人供体pbmc中分离t细胞。

图10f显示在可溶性comp、icosl-comp或icosl-fc存在的情况下，用抗-cd3刺激cd3+t细胞(来自成人pbmc)72小时后的细胞因子分泌(il2、il6、ifnγ、tnfα、il10)。

图11a是详细说明体内mc38肿瘤模型实验中给予化合物的示意图。

图11b示出在携带已确定的皮下鼠结直肠mc38肿瘤的c57bi/6小鼠(治疗模型)中，icos-l.comp与抗-pd-1mab协同作用，从而诱导保护性抗肿瘤免疫。

图11c示出个体小鼠肿瘤体积作为时间的函数的变化情况。

图12a示出在mc38肿瘤模型中，icos-l.comp单一疗法并没有减少肿瘤的生长。

图12b示出对于mc38荷瘤动物的抗-pd-1治疗导致在瘤内的cd45+cd4+和cd45+cd8+t细胞中icos表达的增加。

图12c示出处理的mc38荷瘤动物中的til分布。抗-pd-1和icos-l.comp的结合导致til群体中cd45+cd4+foxp3-细胞的丰度显著增加。

图12d示出了处理的mc38荷瘤动物中的til分布。抗-pd-1和icos-l.comp的结合不会改变til群体中cd45+cd4+foxp3+t-调节细胞的丰度。

图13示出了与pd-l1或b7-h4.comp相比，使用生物素化的pd-l1.comp、b7-h4.comp或comp.comp对抗-cd3活化的或初始2.10t细胞进行的24小时染色显示出与该t细胞系的可忽略的非特异性结合。

图14示出固定化和可溶性b7-h4.comp对于经历固定化抗-cd3抗体活化的2.10t-细胞增殖具有抑制作用。

图15示出可溶性b7-h4.comp(10μg/ml)对于在体外经历抗-cd3诱导活化72h的原代鼠cd4+t细胞的扩张(上)和分裂(下)具有显著的抑制作用。

图16示出可溶性b7-h4.comp(10μg/ml)抑制在体外经历抗-cd3诱导活化48h的原代鼠cd4+t细胞分泌il-2细胞因子。

非限制示例性实施方案的详细描述

除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语的含义一般与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

t细胞活化的v结构域免疫球蛋白抑制剂(vista)是近年来发现的一种具有抑制t细胞活性功能的免疫检查点配体。其他免疫检查点配体包括b7-h4和pd-l1。这种在受试者中的免疫检查点通路的激活具有治疗潜力，这至少是因为它可能通过抑制t细胞活性来减少受试者的炎症反应。相反，刺激t细胞活性的配体，如icos-l，具有增强免疫的治疗潜力，如在癌症免疫治疗中。

已表明，vista(vista-fc)的igv结构域的二聚体结构抑制了体外t细胞的活化。然而，这种效应需要将vista-fc固定在固体基质上。固定化依赖活性表明vista-fc作为体内vista-受体激动剂的功效可能是有限的。

本发明提供了一种五聚体多肽和组成它的单体，每个单体都含有在基因上融合或连接至软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域上的vista、b7-h4、pd-l1或icos-l的胞外结构域。

comp是含有五个亚基的524kda的同型五聚体，其中所述亚基由n-末端七重复(heptadrepeat)区域(cc)、其后的四个表皮生长因子(egf)样结构域(ef)、七个钙结合结构域(t3)和c-末端球型结构域(tc)组成。本发明使用的comp五聚体化结构域是一条长度为45个氨基酸的序列，该序列自发地组装成在平行方向上排列并且通过二硫桥来稳定的5个α-螺旋束。在此之前，一种与comp五聚体化结构域融合的促血管生成因子血管生成素1(comp-ang1)相比于天然的ang1具有增加的稳定性，从而增加体内血管生成诱导。

本发明人已经制出了人和鼠的经改造的核酸、经改造的多肽和经改造的五聚体多肽，每个都包含可操作地连接至comp的五聚体化结构域上的vista、b7-h4、pd-l1或icos-l胞外结构域的序列。“胞外结构域”(或“ecd”)，我们是指多肽的胞外区域，或编码它的核酸，其含有一个或多个在配体与受体的有效结合中发挥作用的ig-型结构域。vista、b7-h4、pd-l1和icos-l的ecd包含igv结构域。b7-h4、pd-l1和icos-l的ecd包含igc结构域。本发明还考虑了与本文提供的经改造的核酸和/或多肽相对应的经改造的mrna。

附录1提供了核酸序列和多肽序列，其用于制备可操作地连接到comp五聚体化结构域上的vista、b7-h4、pd-l1或icos-l胞外结构域。

在实施方案中，提供了一种重组核酸，其具有编码连接至comp的五聚体化结构域上的vista、b7-h4、pd-l1或icos-l的胞外结构域的核酸序列。在一些实施方案中，编码vista胞外含igv的结构域的核酸与seqidno：1(人vista的含igv的结构域)或seqidno：2(小鼠vista的含igv结构域)具有实质相似性。在一些实施方案中，编码b7-h4的胞外结构域的核酸与seqidno：26具有实质相似性。在一些实施方案中，编码pd-l1的胞外结构域的核酸与seqidno：37具有实质相似性。在一些实施方案中，编码icos-l的胞外结构域的核酸与seqidno：48具有实质相似性。在一些实施方案中，编码comp的五聚体化结构域的核酸与seqidno：3(人comp的五聚体化结构域)或seqidno：4(小鼠comp的五聚体化结构域)具有实质相似性。

对于序列中的“实质相似性”，我们是指与本文提供的序列相同的序列或其变体，包括或编码涵盖所述的生物活性的多肽。

例如，对于核酸序列，实质相似的序列包括保守的变体，由于遗传密码的简并，这些变体编码本发明提供的一种多肽的氨基酸序列。变体核苷酸序列包括合成衍生的核苷酸序列。通常，本发明的特定核苷酸序列的变体和本文提供的一种核酸序列将具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，如通过本领域已知的序列比对程序并且使用默认参数而确定。在一些优选实施方案中，实质相似的序列与所述序列相同。在一些优选实施方案中，对核酸序列进行了密码子优化，以用于遗传构建体(例如，用于质粒中)。

本发明所包含的变体多肽具有生物活性，也就是说，它们继续具有本文所述的五聚体多肽的生物活性。例如，这些变体可能是遗传多态性或人为操纵造成的。本发明的多肽的生物活性变体和本文提供的一种氨基酸序列将具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，如通过本领域已知的序列比对程序并且使用默认参数而确定。

在实施方案中，重组核酸包括可操作地连接到seqidno：3上的seqidno：1(即连接到人comp的五聚体化结构域上的人vista的含igv结构域)。在实施方案中，重组核酸包括可操作地连接到seqidno：4上的seqidno：2(即连接到小鼠comp的五聚体化结构域上的小鼠vista的含igv结构域)。

当一个核酸分子与另一个核酸分子处于功能关系时，它与另一个核酸分子可操作地连接。例如，当两个核酸分子连接从而使由这两个核酸分子编码的氨基酸序列提供适当的翻译，则这两个核酸分子是可操作地连接。这种核酸可以通过接头序列进行可操作连接。适于与本文公开的重组核酸一起使用的接头序列可以由本领域技术人员确定。在一些优选的实施方案中，将改造接头序列以编码某种柔性肽或多肽(例如，它可能富含甘氨酸)。

在一个方面，提供了一种重组信使核糖核酸(mrna)，其具有编码连接到comp的五聚体化结构域上的vista的胞外结构域的mrna序列。在一些实施方案中，编码vista的胞外结构域的mrna与seqidno：5(人vista的含igv结构域)或seqidno：6(小鼠vista的含igv结构域)具有实质相似性。在一些实施方案中，编码comp的五聚体化结构域的mrna与seqidno：7(人comp的五聚体化结构域)或seqidno：8(小鼠comp的五聚体化结构域)具有实质相似性。

在实施方案中，重组mrna包括可操作地连接到seqidno：7上的seqidno：5(即连接到人comp的五聚体化结构域上的人vista的含igv结构域)。在实施方案中，重组核酸包括可操作地连接到seqidno：8上的seqidno：6(即连接到小鼠comp的五聚体化结构域的小鼠vista的含igv结构域)。适于与本文公开的重组核酸一起使用的接头序列可由本领域技术人员确定。在一些优选的实施方案中，将改造接头序列以编码某种柔性肽或多肽(例如，它可能富含甘氨酸)。

在一个方面，提供了一种具有mrna序列的重组信使核糖核酸(mrna)，其中所述mrna序列编码与comp的五聚体化结构域连接的b7-h4的胞外结构域。在一些实施方案中，编码b7-h4胞外结构域的mrna与seqidno：27(人的b7-h4的ecd)具有实质相似性。在一些实施方案中，编码comp的五聚体化结构域的mrna与seqidno：7(人的comp的五聚体化结构域)具有实质相似性。

在一个方面，提供了一种具有mrna序列的重组信使核糖核酸(mrna)，其中所述mrna序列编码与comp的五聚体化结构域连接的pd-l1的胞外结构域。在一些实施方案中，编码vista胞外结构域的mrna与seqidno：62(人的pd-l1的ecd)具有实质相似性。在一些实施方案中，编码comp的五聚体化结构域的mrna与seqidno：7(人的comp的五聚体化结构域)具有实质相似性。

在一个方面，提供了一种具有mrna序列的重组信使核糖核酸(mrna)，其中所述mrna序列编码与comp的五聚体化结构域连接的icos-l的胞外结构域。在一些实施方案中，编码vista胞外结构域的mrna与seqidno：61(人的icos-l的ecd)具有实质相似性。在一些实施方案中，编码comp的五聚体化结构域的mrna与seqidno：7(人的comp的五聚体化结构域)具有实质相似性。

在一个方面，提供了一种具有氨基酸序列的重组多肽，其中所述氨基酸序列编码与comp的五聚体化结构域连接的vista、b7-h4、pd-l1或icos-l的胞外结构域。在一些实施方案中，编码vista的胞外含igv结构域的氨基酸序列与seqidno：9(人vista的含igv结构域)或seqidno：10(小鼠vista的含igv结构域)具有实质相似性。在一些实施方案中，编码b7-h4的胞外结构域的氨基酸序列与seqidno：25具有实质相似性。在一些实施方案中，编码pd-l1胞外结构域的氨基酸序列与seqidno：36具有实质相似性。在一些实施方案中，编码icos-l胞外结构域的氨基酸序列与seqidno：49具有实质相似性。在一些实施方案中，编码comp的五聚体化结构域的氨基酸序列与seqidno：11(人comp的五聚体化结构域)或seqidno：12(小鼠comp的五聚体化结构域)具有实质相似性。

如本发明所用，“连接”意指的是以共价或非共价方式将一种多肽与另一种多肽相连，而不论其连接方法如何。在一个实施方案中，所述连接是共价连接，例如肽键。例如，具有编码本发明的vista、b7-h4、pd-l1或icos-l的胞外结构域的氨基酸序列的肽可以连接到本发明的comp的五聚体化结构域。这种连接的实例在本领域是已知的，例如记载于chenet.al(参考文献38)。在实施方案中，可以通过在vista、b7-h4、pd-l1或icos-l的胞外结构域与comp的五聚体化结构域之间形成融合蛋白，将本发明的vista、b7-h4、pd-l1或icos-l的胞外结构域与comp的五聚体化结构域连接。这类融合蛋白可以按照本领域中已知的且如本文所述的标准方法，使用编码vista、b7-h4、pd-l1或icos-l的ecd和comp的五聚体化结构域的表达载体在宿主细胞中产生。

在实施方案中，重组多肽包括可操作地连接到seqidno：11上的seqidno：9(即与人comp的五聚体化结构域连接的人vista的胞外含igv结构域)。在实施方案中，重组核酸包括可操作地连接到seqidno：12上的seqidno：10(即与小鼠comp的五聚体化结构域连接的小鼠vista的胞外含igv结构域)。适于与本文公开的重组核酸一起使用的接头序列可由本领域技术人员确定。在一些优选的实施方案中，将改造接头序列以编码某种柔性肽或多肽(例如，它可能富含甘氨酸)。

在本文的一些实施方案中，重组多肽也可称为重组蛋白、经改造的蛋白或融合蛋白。所谓“融合蛋白”，我们指通过连接两种或多种本来编码单独的多肽的基因而产生的蛋白质。这种融合基因的翻译产生了具有从各原始多肽获得的功能特性的单一多肽。

在一些实施方案中，本发明的核酸或多肽可能包括使得能够分泌重组蛋白的n-末端前导序列，和/或用于纯化目的的组氨酸或其它亲和标签。用于引入n-末端前导序列和/或组氨酸或其它亲和标签的方法在本领域中是已知的。

在实施方案中，提供的重组多肽是可溶形式的。如本文所用，“可溶”是指并不固定在固体基质或固体表面上。在实施方案中，重组多肽的活性是与基质固定化无关的(即活性并不取决于重组多肽固定在固体基质或固体表面上)。

在实施方案中，提供了包含本文公开的重组多肽的表达载体。在一些实施方案中，表达载体还包括至少一个调控序列。所谓“调控序列”，我们指对于在特定宿主生物中可操作地连接的编码序列的表达所必需的一个或多个序列。合适的调控序列包括如启动子、聚腺苷酸化信号和/或增强子。用于生成包含重组多肽的表达载体的方法和工具是本领域中已知的，并且可能适合于生成本发明提供的表达载体。

在一个方面，提供了包含本发明公开的表达载体的宿主细胞。例如，宿主细胞可能是hek-293或hek-293衍生物，cho或cho衍生物，或ns01或ns01衍生物。用于生成包含表达载体的宿主细胞的方法和工具是本领域中已知的，并且可能适合于生成本发明提供的宿主细胞。在实施方案中，提供了经改造的细胞系，其包含整合到其基因组中的vista和comp、b7-h4和comp、pd-l1和comp、或icos-l和comp遗传物质(如本文所述)。

在一个方面，提供了一种具有t细胞调节活性的五聚体多肽。所述五聚体多肽包括五个单体，每一个单体包括：与t细胞活化的v结构域ig抑制剂(vista)的胞外结构域(seqidno：9或10)具有实质相似性的多肽；与b7-h4的胞外结构域(seqidno：25)具有实质相似性的多肽；与pd-l1的胞外结构域(seqidno：36)具有实质相似性的多肽；或与icos-l的胞外结构域(seqidno：49)具有实质相似性的多肽；上述多肽连接到与软骨寡聚基质蛋白(comp)的五聚体化结构域(seqidno：11或12)具有实质相似性的多肽。

在实施方案中，所述五聚体多肽包括可操作地连接到seqidno：11上的seqidno：9。

在实施方案中，所述五聚体多肽包括可操作地连接到seqidno：12上的seqidno：10。

在一些实施方案中，五聚体多肽为可溶形式。与二聚体vista-fc相比，本文提供的可溶形式的五聚体vista.comp、b7-h4.comp和pd-l1.comp具有生物活性。本领域技术人员将会认识到，相对于仅固定形式时才具有活性的试剂而言，具有生物活性的可溶形式的试剂可能显示出的优势。例如，相对于可能需要结合且聚集在附属细胞上来诱导免疫抑制的二聚体(vista-fc、b7-h4-fc或pd-l1-fc)而言，可溶性vista-受体激动剂、b7-h4-受体激动剂或pd-1受体激动剂在体内可能表现出增加的活性。

在一些实施方案中，相对于包含vista的含igv结构域(seqidno：9或10)的可溶性二聚体多肽(例如相对于vista-fc)或相对于包含b7-h4的ecd的可溶性二聚体多肽(例如相对于b7-h4-fc)、或相对于包含pd-l1的ecd的可溶性二聚体多肽(例如相对于pd-l1-fc)而言，可溶形式的五聚体多肽具有增加的t细胞抑制活性。相对于包含vista的含igv结构域(seqidno：9或10)的可溶性二聚体多肽(例如相对于vista-fc)或相对于包含b7-h4的ecd的可溶性二聚体多肽(例如相对于b7-h4-fc)、或相对于包含pd-l1的ecd的可溶性二聚体多肽(例如相对于pd-l1-fc)的t细胞抑制活性而言，可溶形式的五聚体多肽的t细胞抑制活性可增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，增加的t细胞抑制活性包括针对t细胞活化和t细胞增殖的一种或多种增强的抑制作用。测定t细胞抑制活性、t细胞活化和t细胞增殖的方法是本领域中已知的，并且例如记载于本文中。

在一些实施方案中，相对于包含vista的胞外结构域(seqidno：9或10)的可溶性二聚体多肽(例如相对于vista-fc)或相对于包含b7-h4的ecd的可溶性二聚体多肽(例如相对于b7-h4-fc)、或相对于包含pd-l1的ecd的可溶性二聚体多肽(即相对于pd-l1-fc)而言，可溶形式的vista.comp、b7-h4.comp或pd-l1.comp五聚体多肽具有增加的体内免疫抑制活性。相对于包含vista的含igv结构域(seqidno：9或10)的可溶性二聚体多肽(例如相对于vista-fc)或相对于包含b7-h4的ecd的可溶性二聚体多肽(例如相对于b7-h4-fc)、或相对于包含pd-l1的ecd的可溶性二聚体多肽(例如相对于pd-l1-fc)的免疫抑制活性而言，可溶形式的五聚体多肽的免疫抑制活性可增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。例如，增加的免疫抑制活性可以包括针对细胞因子(如il-2和/或ifnγ)分泌的一种或多种增强的抑制作用，以及针对细胞毒性淋巴细胞(ctl)产生的一种或多种增强的抑制作用。测定免疫抑制活性、细胞因子分泌和细胞毒性淋巴细胞(ctl)产生抑制的方法是本领域中已知的，并且例如记载于本文中。例如，增加的免疫抑制活性可包括抑制体内炎症反应(正如在实施例部分中通过表明鼠皮肤同种异体移植的存活时间延长的数据来证实)，以及保护小鼠免于致命的急性肝炎。

在一些实施方案中，相对于包含icos-l的ecd(seqidno：49)的可溶性二聚体多肽(例如相对于icos-l-fc)而言，可溶形式的icos-l.comp五聚体多肽具有增加的t-细胞刺激活性。相对于包含icos-l的ecd(seqidno：49)的可溶性二聚体多肽(例如相对于icos-l-fc)的t细胞刺激活性，可溶形式的五聚体多肽的t细胞刺激活性可增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多倍。在一些实施方案中，增加的t细胞刺激活性包括针对t细胞活化和t细胞增殖刺激的一种或多种增强的刺激作用。测定t细胞刺激活性、t细胞活化和t细胞增殖的方法是本领域中已知的，并且例如记载于本文中。

在一些实施方案中，相对于包含icos-l的胞外结构域(seqidno：49)的可溶性二聚体多肽(例如相对于icos-l-fc)而言，可溶形式的icos-l.comp五聚体多肽具有增加的体内免疫刺激活性。相对于包含icos-l的ecd(seqidno：49)的可溶性二聚体多肽(例如相对于icos-l-fc)的免疫刺激活性，可溶形式的五聚体多肽的免疫刺激活性可增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多倍。例如，增加的免疫刺激活性可能包括增加的细胞因子分泌和增加的细胞毒性淋巴细胞(ctl)产生的一种或多种。测定免疫刺激活性、细胞因子分泌和细胞毒性淋巴细胞(ctl)产生的方法是本领域中已知的，并且例如记载于本文中。

在一些实施方案中，相对于包含icos-l的胞外结构域(seqidno：49)的可溶性二聚体多肽(例如相对于icos-l-fc)而言，可溶形式的icos-l.comp五聚体多肽使效应t细胞：调节t细胞的比率增加。相对于适当的对照而言，可溶形式的五聚体多肽的效应t细胞：调节t细胞的比率可增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者增加1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。测定效应t细胞：调节t细胞比率的方法是本领域中已知的，并且例如记载于本文中。

在一些实施方案中，本发明提供的可溶形式的vista.comp、b7-h4.comp或pd-l1.comp五聚体多肽具有在体外和体内分别作为假定的vista受体、假定的b7-h4受体或pd-1受体的激动剂的活性。所谓“激动剂”，我们指一种与受体结合并激活受体从而产生生物反应的试剂。

在实施方案中，本文提供了药物组合物，包括本文公开的一种或多种多肽、宿主细胞或五聚体多肽，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的多肽或vista.comp、b7-h4.comp或pd-l1.comp五聚体多肽可以以不同的方式使用本领域公认的技术来配制。在一些实施方案中，本发明的治疗组合物可以以不包含或包含最小量的额外组分的形式进行给药，而其他组合物可以任选地配制成包含适当的可药用的载体。如本文使用的，“可药用的载体”包括赋形剂、载体、佐剂和稀释剂，它们是本领域中公知的并且可以从用于药物制备的商业渠道获得(参见，例如，gennaro(2003)remington：thescienceandpracticeofpharmacywithfactsandcomparisons：drugfactsplus，20thed.，mackpublishing；anseletal.(2004)pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems，7thed.，lippencottwilliamsandwilkins；kibbeetal.(2000)handbookofpharmaceuticalexcipients，3rded.，pharmaceuticalpress.)。

适合的可药用的载体包括相对惰性的物质，并且可以促进多肽、宿主细胞或五聚体多肽的给药，或者能够帮助将多肽、宿主细胞或五聚体多肽加工成药学上优化以便将递送到作用位点的制剂。

这种可药用的载体包括可改变制剂的剂型、稠度、粘度、ph值、张力、稳定性、渗透压、药动学、蛋白质聚集或溶解度的试剂，包括缓冲剂、润湿剂、乳化剂、稀释剂、包封剂和皮肤渗透促进剂。载体的某些非限制性实例包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖、精氨酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、葡聚糖、羧甲基纤维素钠及其组合。用于全身给药的多肽、宿主细胞或五聚体多肽可配制成用于肠内、肠外或局部给药。在一些实施方案中，公开的组合物将配制成用于静脉内给药，并且优选地使用iv容器(例如，iv滴灌袋)注入。事实上，这三种制剂都可以同时使用以实现有效成分的全身给药。remington：thescienceandpracticeofpharmacy(2000)20thed.mackpublishing列出了用于肠外和非肠外药物递送的赋形剂以及制剂。

在一个方面，提供了在有此需要的个体中诱发生物反应的方法。所述方法包括向个体给予治疗有效剂量的以下药物：vista-comp融合多肽(vista.comp)，包含a)与seqidno：11可操作地连接的seqidno：9，或b)与seqidno：12可操作地连接的seqidno：10；b7-h4-comp融合多肽(b7-h4.comp)，包含与seqidno：11可操作地连接的seqidno：25；或pd-l1-comp融合多肽(pd-l1.comp)，包含与seqidno：11可操作地连接的seqidno：36。在此方法中，生物反应为以下的一种或多种：抑制t细胞活化；抑制t细胞增殖；减少t细胞分泌的一种或多种炎性细胞因子；抑制细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导；以及具有调节表型的t细胞的增多。

相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽的受试者)而言，在给予可溶形式的vista.comp、b7-h4.comp或pd-l1.comp五聚体多肽的个体中t细胞活化的抑制可以是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽的受试者)而言，在给予可溶形式的五聚体多肽的个体中t细胞增殖的抑制可以是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽的受试者)而言，在给予可溶形式的五聚体多肽的个体中由t细胞分泌的一种或多种炎性细胞因子可以降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％o相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽的受试者)而言，在给予可溶形式的五聚体多肽的个体中细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导可被抑制5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽的受试者)而言，在给予可溶形式的五聚体多肽的个体中具有调节表型的t细胞的增加可以增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者增加1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。

测定t细胞活化抑制、t细胞增殖抑制、由t细胞分泌的一种或多种炎性细胞因子的减少、细胞毒性t淋巴细胞(ctls)的诱导的抑制、以及具有调节表型的t细胞的增多的方法是本领域中已知的，并且例如记载于本文中。

在实施方案中，提供了在有此需要的个体中诱发生物反应的方法。该方法包括向个体给予治疗有效量的icos-l-comp融合多肽(icos-l.comp)，其包含与seqidno：11可操作地连接的seqidno：49。在此方法中，生物反应为以下的一种或多种：t细胞活化的增强；t细胞增殖的增强；由t细胞分泌的一种或多种炎症细胞因子的增加；对细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导增强，以及效应t细胞：调节t细胞的比率增大。

相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽(例如icos-l-fc)的受试者)而言，在给予可溶形式的icos-l.comp五聚体多肽的个体中t细胞活化可增加或增强5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者可增加或增强1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多倍。相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽的受试者)而言，在给予可溶形式的五聚体多肽的个体中t细胞增殖可增加或增强5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者增加或增强1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多倍。相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽的受试者)而言，在给予可溶形式的五聚体多肽的个体中由t细胞分泌的一种或多种炎症细胞因子可增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多倍。相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽的受试者)而言，在给予可溶形式的五聚体多肽的个体中细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导可增加或增强5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者增加或增强1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。相对于适当的对照(例如，不接受多肽的个体或接受可溶性二聚体多肽的受试者)而言，在给予可溶形式的五聚体多肽的个体中效应t细胞：调节t细胞比率的增大可增大5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者增大1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。

测定t细胞活化的增强、t细胞增殖的增强、由t细胞分泌的一种或多种炎性细胞因子的增加、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导的增强、以及效应t细胞：调节t细胞比率增大的方法是本领域中已知的，并且例如记载于本文中。

所谓“治疗有效剂量”，是指为达到预期目而用的有效量(即足以在有此需要的个体中诱发生物反应的量)。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

icos-l.comp多肽可与检查点阻断分子联合给药。本发明所用的检查点阻断分子是能够阻断免疫抑制信号以改善抗肿瘤免疫应答的试剂。可以在给予检查点阻断分子的同时，或在其之前或之后给予icos-l.comp多肽。在实施方案中，检查点阻断分子是抑制剂，例如针对pd-1、pd-l1、ctla-4、lag3、vista或tim3的拮抗抗体。

公开的组合的预期结果通过与对照或基线测量比较进行量化。如本文使用的，例如“改善”、“增加”或“减少”等相对术语表示相对于对照的值，例如在本文记载的治疗开始之前在同一个体中的测量结果，或者在缺少本文记载的可溶形式五聚体多肽但存在其他治疗部分(多个治疗部分)(例如护理治疗标准)的情况下，对照个体(或多个对照个体)中的测量结果。代表性的对照个体是指患有与所治疗的个体相同病况的个体。

可以证明，响应于治疗(无论是加合性的还是协同的)的变化或改善具有统计学意义。如本问所用，术语“显著性”或“显著的”涉及对两个或多个测量的反应之间存在非随机关联的概率的统计分析。为了确定一种关系是否是“显著的”或具有“显著性”，可以计算“p值”。低于用户定义的截止点的p值被认为是显著的。为了本发明的目的，小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.001的p值可视为显著的。

协同治疗效果可以是这样的效果，即其比单个治疗部分引起的治疗效果，或者比给定组合的单个治疗部分引起的治疗效果的总和，至少大约两倍或者至少大约五倍，或者至少大约十倍，或者至少大约二十倍，或者至少大约五十倍，或者至少大约一百倍。观察到的协同治疗效果还可以是，与单个治疗部分引起的治疗效果，或者与给定组合的单个治疗部分引起的治疗效果的总和相比，疗效增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少90％、或至少100％或更多。协同效果也是这样的效果，即其允许当联合使用治疗剂时减少其剂量。

特定剂量方案，即剂量、定时和重复，将取决于个体，以及例如药物动力学(如半衰期、清除率等)的经验性考虑因素。本领域普通技术人员，如主治医生，可基于考虑正在治疗的病况和病况的严重程度、正在治疗的受试者的年龄和一般健康状况等，确定给药频率。给药频率可根据选择的组合物和给药方案的疗效评估在治疗过程中进行调整。这种评估可以根据具体的疾病、病症或病况的标志或个人健康评估(如使用生活质量评估、日常生活活动能力等来衡量)来进行。

实施例

实施例1：vista.comp方法

重组蛋白的表达和纯化

通过将编码人igg-1fc区上游的鼠vista(geneart；thermofisherscientific)的胞外结构域(ecd；seqidno：10的16-194位残基)的合成dsdna克隆到pcdna-3.4表达质粒(thermofisherscientific)中，产生vista.fc。通过插入合成dsdna(其两侧为5’和3’ecori限制性酶切位点)，类似地得到编码鼠vista.comp(seqidno：14)基因的质粒，所述合成dsdna编码vista的ecd，其位于软骨寡聚基质蛋白五聚体化结构域(comp；seqidno：12的28-72位残基)(其后为c-末端六组氨酸标签)的上游。利用ecori限制性酶切将vistaecd区从vista.comp质粒中切下，构建了一个单独编码comp结构域的表达质粒(对照)。所有质粒都能够编码5’ig-kappa先导序列，用于哺乳动物细胞的高蛋白分泌。用expi-293tm瞬时表达系统(thermofisherscientific)表达重组蛋白。如上所述产生人vista.comp(hvista.comp，seqidno：24)，不同的是编码代替小鼠vistaecd的hvistaecd(seqidno：9)和代替小鼠comp结构域的人comp序列(seqidno：11)的dna。用hitrap蛋白ahp柱(gehealthcare)从培养基中纯化分泌的vista.fc，用ni-nta树脂(qiagen)纯化组氨酸标记的vista.comp和comp，用pd-10柱(gehealthcare)将其脱盐至ph7.4的pbs中。用sds-page法检测蛋白质纯度，通过bca测定(pierce)或a280测量法定量蛋白质浓度。

动物

将本研究整个过程中使用的c57bl/6小鼠安置在sunnybrookresearchinstitutecomparativeresearch(scrir)设备的无病原体环境中，而cd200r1^-/-小鼠则是在多伦多动物研究所(torontoresearchinstituteanimal)设备中繁殖。所有的方案都得到了sricr动物保护委员会的批准，并得到了加拿大动物保护协会(canadiancouncilofanimalcare)的认可。

细胞培养

通过使用easysep小鼠cd4+t细胞分离试剂盒(干细胞)，将cd4+t细胞从c57bl/6小鼠的脾脏中分离，并在补入10％fbs、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)和0.05mm2-巯基乙醇的rpmi-1640培养基中培养。在补入il-2(3.5μg/ml)、卵磷脂(20μg/ml)和bsa(0.5mg/ml)的完全imdm中培养小鼠2.10t细胞克隆。

2.10t细胞克隆活化

在4℃下，将96孔微量滴定板用抗-cd3抗体(在pbs中3μg/ml，克隆145-2c11，bioxcell)涂覆，过夜。为监测固定化检查点配体对于2.10细胞活化的影响，清洗涂覆抗-cd3的孔并且在37℃下于pbs中用vista.comp或其它重组蛋白涂覆1小时。然后将孔用pbs(3x)洗涤，以除去残留的未结合蛋白。回收在培养物中生长的鼠2.10t细胞，在imdm(x3)中清洗，放入涂覆蛋白的孔(1×10⁴细胞/孔)。为了测量细胞增殖，培养18小时后，用1μci[³h]-胸苷脉冲细胞6小时，并使用topcountnxt闪烁计数器(perkinelmer)定量摄入(uptake)。为检测2.10t细胞对于可溶性检查点配体的敏感性，将所示重组蛋白稀释于培养基中，并且与2.10细胞同时加入到涂覆抗-cd3抗体的孔中。

cd4+t细胞增殖和细胞因子分泌(小鼠)

按照制造商方案(thermofisherscientific)用cfse标记分离的鼠cd4+t细胞，然后在鼠vista.fc、vista.comp或单独的comp存在(涂覆的或可溶的)的情况下，在预先涂覆抗-cd3抗体的96孔微量滴定板中刺激它们。48或72小时后收集细胞，用流式细胞仪(facscalibur，bectondickinson)来定量cfse稀释图谱(profile)。在48或72小时从受刺激的cd4+t细胞中收集培养基，并用酶联免疫吸附试验(elisa，r&dsystem)进行分析，来定量测定vista.comp介导的对il2和ifnγ分泌的抑制作用。

人t细胞活化和增殖试验

将从健康供体(stemcelltechnologies)分离的外周血单核细胞(pbmc)用5μg/ml的cona培养48或72h，或在ista.fc、vista.comp或comp存在下用固定化抗-cd3抗体(okt3，1μg/ml)培养。在某些情况下，在培养前用cfse标记细胞以追踪增殖。培养后获取细胞，用指定的抗体(抗-cd3、抗-cd4、抗-cd8和/或抗-cd25)染色，并用流式细胞仪分析。

流式细胞术结合试验

使用流式细胞仪评估vista.comp、vista.fc或对照蛋白与t-细胞的结合。按照制造商的指导，首先利用ez连接硫代-nhs-lc-生物素试剂(thermoscientific)使蛋白质生物素化。在反应完成后，使用pd-10(gehealthcare)脱盐柱除去过量生物素。为了确认各蛋白的等效生物素化水平，使用haba/抗生物素蛋白试剂(sigma)测定与每一种配体缀合的生物素的量。在facs染色缓冲液(补入1％fbs和0.09％nan3的pbs)中，将2.10t细胞与指定的生物素化蛋白(10μg/100μl)或vista.fc一起在4℃下孵育0.5小时。除去未结合的蛋白后，将细胞与链霉亲和素-pe(1：300，biolegend)或pe-抗-人igg(1：100，biolegend)一起在facs染色缓冲液中孵育15分钟，并使用facscalibur细胞分析仪分析pe-荧光信号。

异基因小鼠混合白细胞培养试验(allo-mlc)

将vista.comp或cd200fc(阳性对照)添加到异基因鼠混合白细胞中培育5天后，按上述方法测定细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导(参考文献39)。简言之，在所示浓度的每种重组蛋白存在下将c57bl/6应答脾细胞与相同数量的经辐射的balb/c刺激细胞一起孵育。通过监测5小时内负载性p815肥大细胞瘤靶细胞释放的⁵¹cr来检测诱导的ctl(25∶1效靶比)。

同种异体皮肤移植

如前面所述，通过使用小鼠皮肤同种异体移植模型检测体内vista.comp的免疫抑制作用(参考文献39)。balb/c小鼠接受c57bl/6皮肤移植(第0天)，然后每3天用vista.comp(15μgiv)处理一次，共处理5次，同时结合小剂量雷帕霉素(rapamycin)(0.5mg/kg，每48小时腹膜内注射一次)。一位不知情的调查员每天监控移植存活情况。

伴刀豆球蛋白(concanavalin)-a诱发的急性肝炎

使用急性肝炎con-a模型，评估vista.comp挽救小鼠免于致死性急性炎症的能力。雄性c57bl/6小鼠在静脉注射致死剂量(15mg/kg)的con-a(sigma-aldrich)的前两小时，经腹膜内用vista.comp(200μg)或pbs处理。在3小时后处死一组动物，通过elisa(r&dsystems)定量测定血清il-6和tnfα水平，并且对其余动物进行24小时的存活监测。

固相免疫沉淀试验

进行固相免疫沉淀试验以评估vista.comp对tcr磷酸化信号转导级联的抑制作用。使2.10t细胞暴露于涂覆抗-cd3抗体的平板(包含或不包含vista.comp)15分钟。去除残余培养基，并且在4℃下，用裂解缓冲液(50mmtrisph7.4、150mmnacl、1％np40、5mmna4o7p2、5mmnaf、2mmna3vo4和1xsigma蛋白酶抑制剂混合液)孵育30min而使细胞在原位裂解。用裂解缓冲液剧烈地洗涤小孔3次，并用3.5％nh4oh洗脱附着的蛋白。将洗脱的蛋白冻干，然后再次悬浮于sds-样品缓冲液中，使用抗磷酸酪氨酸抗体(克隆4g10；sunnybrookantibodycorefacility)，通过蛋白免疫印迹对总磷酸化蛋白质进行可视化。

统计

使用graphpadprism软件(v6.0.2)，在所示之处使用学生t-检验或mannwhitneyu-检验进行统计分析。使用graphpadprism软件创建图表和视觉资料。

实施例2：vista.comp结果

二聚体vista只有在固定化时才能抑制t细胞的增殖

在某些情况下，t细胞上免疫检查点受体的激活是通过蛋白配体(如在apc和肿瘤细胞上表达的pd-l1)呈现的igv结构域与t细胞上其同源免疫检查点受体pd-1的互补igv结构域的结合而启动的。过去的研究表明，这些单体形式的igv结构域(包括pd1：pd-l1和cd28：cd80/cd86)以适度的亲和力相互作用，这通过通常在低微摩尔(μm)范围的kd值反映出来(参考文献40，41)。为了在体外激活t细胞上的检查点受体，这些免疫检查点配体已被表达为寡聚体，例如fc融合蛋白，其被固定在表面上。固定化呈现模拟当这种免疫检查点结构域呈现在apc和t-细胞表面时发生的亲和力事件。

与以前的报告一致(参考文献8，9)，通过vistaigv结构域与igg1的fc区融合而构建的二聚体形式的vista(vista-fc)，仅在其被固定在培养皿上的时候，才能够针对抗-cd3刺激的cd4+t细胞的增殖具有抑制作用(图1a)。在cd4+t细胞刺激期间添加到培养基中的可溶性vista-fc对细胞增殖的作用可忽略，这表明在体内为抑制t细胞活性而使用的vista-fc可能由于其不能完全使假定的vista-受体激动而受到限制。

在不受理论束缚的情况下，可溶性vista-fc在体外缺乏活性可能是由于与其受体的亲合力不足和/或缺乏使vista-受体在细胞表面上聚集的能力所造成的。

为了产生一种能够有效抑制体外和体内t细胞刺激的激动剂，改造了一种更高级别的vista寡聚体。通过将vistaigv结构域与comp五聚体化结构域进行基因融合，构建了一种重组vista五聚体(vista.comp；序列参阅附录1的seqidno：14)。重组vista.comp是在哺乳动物表达系统中产生，得到了一种在comp五聚体化结构域内由分子内二硫键稳定的约250kda的五聚体蛋白(图1b)。

vista.comp作为一种可溶性配体在体外抑制t细胞的活化和增殖

与vista-fc相比，可溶性vista.comp显著抑制经分离的抗-cd3刺激的cd4+t细胞的扩散和增殖(图1c)。只有重组的comp结构域对于t细胞的扩散和增殖的影响可以忽略不计，说明vista.comp的活性是由于vista信号转导，而不是与comp结构域相关的脱靶事件。此外，可溶性vista.comp显著减少(p＜0.01)由受刺激的cd4+t细胞分泌的炎症细胞因子il-2(图1d)和ifnγ(图1e)。vista.comp的抑制功效与t细胞受体(tcr)刺激强度负相关，因为在vista.comp的存在下，增加的抗-cd3刺激导致t细胞分裂增加(图1f)。vista.comp除了响应于多克隆刺激而抑制t细胞增殖的能力以外，还容易以剂量依赖方式，在同种异体混合的白细胞培养物中抑制细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的诱导(图1g)。这些结果表明vista.comp是一种有效的激动剂，能够激活t细胞上的vista受体来调节其活性。与vista-fc不同的是，vista.comp不需要固定在固体表面就能表现出激动活性。

hvista.comp抑制人t细胞的活化和增殖

如所述的mvista.comp，用hvista.comp的ecd代替小鼠vistaecd，用人comp五聚体化结构域代替小鼠comp五聚体化结构域，来构建人的vista.comp(seqidno：24)。该蛋白hvista.comp(seqidno：24)可被expi293f细胞轻易表达并纯化至同质性(图1h)。与以前在小鼠t细胞实验中观察到的相似，发现hvista.comp，而不是comp，可以很容易地抑制由cona诱导的从成人pbmc中分离的人t细胞的增殖(图11)。此外，在经受抗-cd3诱导活化的人cd4+和cd8+t细胞中，hvista.comp抑制cd25t细胞活化标记物的上调(图1j)。这些结果共同表明，与以前使用mvista.comp所观察到的类似，人vista.comp可以诱导vista介导的免疫抑制信号转导，来抑制人t细胞的激活。

vista.comp与克隆t细胞系结合并抑制其激活

除了原代cd4+t细胞外，还发现依赖cd4-阴性鼠il-2的t-细胞克隆(2.10)(参考文献42)对vista抑制信号转导敏感，这提供了一种控制系统来检测vista受体激动剂的作用。与在原代cd4+t细胞中观察到的一致，vista-fc仅在固定于固体表面时才抑制抗-cd3诱导的增殖，而vista.comp在固定时或在培养基中以可溶形式提供时都能抑制活性(p＜0.01)(图2a)。可溶的vista.comp和vista-fc的滴定表明，vista.comp在低至1μg/ml的浓度下抑制抗-cd3诱导的2.10细胞增殖(p＜0.01)，而vista-fc在高达30μg/ml的浓度下也没有检测到活性(图2b)。除了抑制增殖，细胞内流式细胞术表明，可溶的vista.comp而不是vista-fc在暴露的4h内抑制受刺激的2.10细胞的il-2分泌(p＜0.05)，这表明vista.comp具有即时且快速的作用(图2d)。vista.comp抑制2.10细胞的抗-cd3刺激所诱导的tcr复合信号转导蛋白中酪氨酸残基的快速磷酸化(图2e)。在机理方面，这些结果与先前的发现一致，即将初始cd4+t细胞暴露于固定化的vista-fc导致t细胞在转移到涂覆抗-cd3的孔(在另外的vista-fc不存在的情况下)后，t细胞的长期抑制，表明vista信号转导作为t细胞激活的早期调节剂的作用⁹。然后用vista-fc、comp或vista.comp对2.10细胞系进行流式细胞术，以确定可溶性vista-fc不能与t细胞上的vista-受体结合是否会导致抑制活性的缺乏。将vista.comp和comp用同等数量的生物素基团标记，用pe-链霉亲和素检测细胞结合的生物素化蛋白质，同时用pe-抗-igg检测结合的vista-fc。发现vista-fc和vista.comp均与初始2.10t细胞结合，而在comp观察到的基线信号证实不存在单独的五聚体化结构域产生的非特异性结合(图2c)。与vista.comp不同，vista-fc信号易于被额外的清洗步骤所代替，这表明其与假定的vista受体的相互作用是低亲和力的(图2f-h)。总之，这些发现表明，可溶的低亲和力vista配体(如vista-fc)不足以在体外通过该途径激活免疫抑制信号转导。只有高亲和力的vista.comp配体能够刺激vista-受体。

vista.comp抑制体内的免疫应答

鉴于vista.comp作为可溶性配体在体外抑制t细胞活性的数据，其可能是一种在体内抑制促炎反应有用的激动剂。vista.comp首次在鼠同种异体皮肤移植模型中被试验。balb/c小鼠在接受非组织相容皮肤同种异体移植(来自c57bi/6供体)之后，接受与小剂量雷帕霉素结合的vista.comp或生理盐水对照处理(图3a)。以前曾证明，这种剂量的雷帕霉素作为一种单一疗法对移植存活没有作用(参考文献39)。vista.comp显著延长了皮肤同种异体移植的存活时间。在vista.comp处理组中，在处理的最后一天(第15天)时仅1/6同种异体移植被排斥，相比之下，在生理盐水对照组中，6/6同种异体移植被排斥(p＜0.05，mann-whitneyu-检验)(图3b)。还在称为伴刀豆球蛋白-a(cona)诱发肝炎的急性炎症性肝模型中评估了vista.comp的免疫抑制作用。在此模型中，cona的给药诱导了由cd4+t和nkt细胞的多克隆激活介导的急性肝脏炎症(参考文献43)。本模型用于评估vista.comp在体内对t细胞的抑制活性。以往的该模型的研究表明，针对t细胞上的vista的激动性抗vista抗体可以挽救小鼠免于致死性肝损伤(参考文献10)。然而，vista-受体激动剂的治疗效果尚不清楚。已发现，用vista.comp进行的小鼠预防性治疗挽救了3/4的雄性c57b1/6小鼠，使其不再面临致死剂量的cona的危险(图3c)。一致地，发现注射cona后3hr时间点的血清tnfα和il-6水平在使用vista.comp处理后明显降低(p＜0.05)(图3d)。这两种急性炎症性疾病模型的结果表明vista.comp可以用作抑制体内炎症反应的强激动剂。

标签对于vista.comp活性的影响

在涂覆的或可溶的vista构建体的存在下，抗-cd3刺激的cfse标记的脾cd4+t细胞的增殖(图4a)。可溶性vista.fc对cd4+t细胞无抑制作用，而vista.comp无需固定即对cd4+t细胞具有免疫抑制活性。此外，组氨酸标记的vista.comp(vista.comp.his；附录1中的seqidno：14)相对于strepii标记的vista.comp(vista.comp.ss；seqidno：60)而言，具有增加的活性，这表明标签对蛋白质稳定性的影响。使用spr结合试验，市售的抗-vista抗体(克隆730802)rnd系统能识别vista.comp.his，但不能识别vista.comp.ss(图4b)，这表明了表位暴露的根本性改变(+表示可检测到的spr结合，-表示完全没有结合)。

vista.comp是一种高亲和力的检查点受体激动剂

本发明提供的数据表明，vista.comp是一种能在体外抑制t细胞活性并能在体内抑制炎症反应的高亲和力检查点受体激动剂。固定化和可溶性vista-fc和vista.comp之间的比较表明，作为vista-受体激动剂的活性取决于低聚化的水平，在溶液中(即在没有固定到基质的情况下)的活性需要使用comp五聚体化结构域产生的较高亲合力的多聚体。本发明人发现，comp结构域是表达稳定的vista五聚体的有用的支架。本文提供的数据与在小鼠中vista遗传缺失时自身免疫性疾病加重的观察相结合，表明靶向vista介导的免疫抑制途径用于临床上抑制不需要的免疫应答的潜在效用。

实施例3：icos-l.comp方法

重组icos-l.comp的表达与纯化

合成了一种dsdna构建体(geneart；thermofisherscientific)，并将其插入pcdna3.4表达质粒(geneart；thermofisherscientific)中，所述dsdna构建体包含编码人icos-l胞外结构域(ecd)(seqidno：49)的dsdna，其位于编码具有c-末端组氨酸标签的人comp五聚体化结构域(seqidno：11)的dsdna的上游。该序列还包含icos-lecd5′末端的ig-kappa先导序列，并且对核苷酸序列进行了密码子优化，使其能够从人源性细胞系(icos-l.comp；序列见附录1的seqidno：57)中获得高产分泌。根据制造商的建议，将编码icos-l.comp的质粒转染到expi293f细胞中(geneart；thermofisherscientific)，并通过将被转染的细胞暴露于遗传霉素(geneart；thermofisherscientific)两周来选择分泌icos-l.comp的稳定细胞系。使用histraphp柱(gehealthcare)，将分泌的组氨酸标记的icos-l.comp从细胞培养上清液中纯化出来。纯化后，使用pd10柱(gehealthcare)，将蛋白质样品脱盐到ph7.4的pbs中。用sds-page法检测蛋白质纯度，用bca分析(pierce)或a280测量法定量蛋白质浓度。

动物

将整个研究中使用的c57bl/6小鼠安置在sunnybrookresearchinstitutecomparativeresearch(scrir)设备的无病原体环境中。所有方案都得到了sricr动物保护委员会的批准，并得到了加拿大动物保护协会的认可。

人t细胞增殖和活化

检测了作为可溶性配体的icos-l.comp或icos-fc(r&dsystems)在体外共刺激人t细胞的能力。采用easysep人t细胞分离试剂盒(stemcelltechnologies)，从ficoll-paque分离的人脐带血细胞或成年pbmc细胞中分离出人t细胞。按照制造商的方案(thermofisher)，将分离t细胞用cfse标记，并在涂覆抗-cd3抗体的96孔板中刺激细胞(克隆okt3，bioxcell)。每个孔中的细胞在补入10％fbs、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)和0.05mm2-巯基乙醇的rpmi-1640培养基中培育。所选的孔用滴定浓度的可溶性comp或icos-l.comp孵育。48-72小时后收集细胞，用适当的抗体(抗-cd4、抗-cd8和/或抗-cd25)染色，然后通过流式细胞术(facscalibur，bectondickinson)分析增殖(cfse)和活化标记物(即cd25)的上调。在72hr时从这些孔中收集细胞培养物上清液，进行细胞因子分析，并用人legendplexth1炎症板(biolegend)定量测定ifnγ、tnfα、il10、il2和il6的分泌。

icos-l.comp与hicos、micos和cd28结合

用biacoret-200表面等离子体共振(spr)实验评估icos-l.comp与hicos、micos和cd28的直接结合。hicos-fc、micos-fc和hcd28-fc(全部来自r&dsystems)是通过预先胺偶联到cm5芯片(gehealthcare)上的蛋白质a(sigmaaldrich)亲和捕获的(350-400ru)。在hbs-ep运行缓冲液(gehealthcare)中，以25nm的浓度在每种亲和捕获蛋白上注射hicos-l.comp。

icos-l.comp结合动力学

使用biacoret200通过spr单循环动力学分析方法，测定hicos-comp、hicos-fc和comp与固定化hicos-fc的结合动力学。简言之，将滴定浓度的icos-l.comp、icos-fc(r&dsystems)或comp(阴性对照)注射预先固定在cm5传感器芯片(gehealthcare)上的hicos-fc(r&dsystems)。导出的传感图以1∶1结合模型拟合，确定结合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(kd)。

icos-l.comp与人t细胞结合

通过流式细胞术证明icos-comp与人t细胞的结合能力。根据制造商的指示(thermofisher)，利用fitc使icos-comp衍生化。将预先从人供体pbmc分离(stemcelltechnologies人cd3+分离试剂盒)的1×10⁵cd3+t细胞在facs缓冲液(pbs+2％fbs+0.09％nan3)中用100nmicos-l.comp.fitc和pe-cy7-抗-cd4(biolegend)孵育20min。随后对细胞进行洗涤并且通过流式细胞术使用bdlsr细胞计数器分析细胞。用dapi排除死亡细胞。

icos-l.comp竞争实验(人)

通过流式细胞术评估hicos-l.comp与hicos-fc竞争结合在抗-cd3/cd28刺激1天的人cd3+t细胞上的icos的能力。简言之，在加入100nm的hicos-l.fc之前，将200nm的icos-l.comp.fitc或相同体积的pbs(无icos-l.comp)与受刺激的cd3+t细胞预先在冰上孵育15分钟。对细胞进行洗涤并且用pe标记的抗人igg-fc第二抗体(biolegend)孵育，通过流式细胞术使用bdlsr细胞计数器分析。

icos-l.comp竞争实验(小鼠)

通过流式细胞术评估hicos-l.comp与micos-ig竞争结合原代小鼠cd4+上的icos的能力。用easysep小鼠cd4+t细胞分离试剂盒(stemcelltechnologies)分离鼠脾cd4+t细胞，通过使其暴露于固定化抗-cd3抗体(克隆145-2c11，bioxcell)活化48h后以上调icos表达。将活化的t细胞用micos-ig或用结合icos-l.comp的micos-ig的孵育，用pe缀合抗人igg-fc抗体(biolegend)检测micos-ig的结合。

mc38结肠癌小鼠模型

使用mc38结肠癌模型，证明icos-l.comp协同抗pd-1检查点阻断以恢复抗肿瘤免疫应答以及延缓已建立的肿瘤的进展的能力。给雄性c57bl/6小鼠注射2×10⁵mc38肿瘤细胞，在7-10天中，肿瘤在处理前可达50-150mm³。随后每2-3天，分别给动物注射pbs、抗-pd-1(200μg、克隆rmpi-14)、icos-l.comp(100μg)或结合icos-l.comp的抗-pd-1，共注射5次。每隔一天用卡钳测量肿瘤大小，使用下式计算：大直径×小直径2×π/6。在一些情况下，在开始处理后第10-12天切除肿瘤，酶解成单细胞悬液，用抗-cd45、抗-cd4、抗-cd8、抗-foxp3和抗-icos染色以分析处理后的til群。

实施例4：icos-l.comp结果

五聚体icos-l融合蛋白的原理与设计

t细胞需要两个信号以实现体外和体内活化，其中第一个信号是由t细胞受体(tcr)在识别出主要组织相容性复合体(mhc)上呈现的抗原时递送的。第二个共刺激信号是由许多配体：受体相互作用(例如b7-1/2：cd28)递送的，以增加t细胞活性。b7/cd28家族的成员icos是在激活时通过t细胞上调的共刺激受体。icos与抗原呈递细胞(apc)上表达的其配体icos-l的结合导致t细胞增殖和细胞因子产生的增加。既往研究证实了在接受抗ctla-4(伊匹木单抗(ipilimumab))治疗的癌症患者中t细胞上的icos表达增加，该上调与改善的临床结果相关。临床前实验已经确定了激动icos信号转导以促进有益的抗肿瘤免疫应答的治疗用途。具体地，已表明使用全细胞疫苗(在b16黑素瘤肿瘤细胞上的icos-l表达)结合抗ctla-4来激动icos可以使b16黑素瘤模型中肿瘤生长延迟。这些结果共同证实了icos激动剂作为已确定的检查点阻断治疗剂(抗pd-1和抗ctla-4单克隆抗体)的协同治疗的作用。

为此，假设一种可溶性的icos激动剂可以通过icos-l胞外结合结构域的五聚体化得到。由于亲和力和聚集增加，假设与激动剂icos单克隆抗体或二聚体的icos-lecd(即icos-fc)比较，这种icos的天然配体(icos-l)的五聚体形式可以使icos信号转导的激动程度更大。

通过将icos-lecd(igv+lgc结构域)基因融合到comp五聚体化结构域上，构建了五聚体icos-l(icos-l.comp，序列参见附录1的seqidno：57)。icos-l.comp在哺乳动物细胞表达系统中表达，在非还原条件下产生mw约300kda的稳定的同五聚体(homopentamer)(图8b)。

icosl.comp与人和小鼠的icos而不是cd28结合

通过spr表征了hicos-l.comp与icos和密切相关的家族成员cd28的结合。如预期的，25nm的hicosl-comp容易与小鼠和人icos结合(图9a)。已观察到其与hcd28的结合非常弱，甚至可以忽略不计，这证明了这种相互作用的特异性。

icos-l.comp与icos的结合比icosl-fc具有更高的亲和力

用表面等离子共振(spr)试验来表征hicos-l.comp和icosl-fc与hicos的结合亲和力。hicos-l.comp结合的表观kd为0.9nm，比hicosl-fc(2.9nm)强约3倍。comp没有表现出与icos结合，这表明这种相互作用是由icosl-icos特异性结合所致(图9b)。

hicos-l.comp直接与人t细胞结合并与icosl-fc竞争

还表征了hicosl-comp结合表达icos的人cd3+t细胞的能力。为此，hicosl-comp用fitc衍生，得到约13-15fitc/分子。已发现，hicosl.comp.fitc易于与从人pbmc分离的cd3+cd4+和cd3+cd4-t细胞结合(图9c)。此外，icos-l.comp的结合完全抑制了icosl-fc与受刺激的人t细胞的结合，这证实icos-l.comp和icos-fc竞争结合细胞表达的icos(图9d)。

icos-l竞争实验(小鼠)

通过流式细胞术评估了hicos-l.comp竞争超过micos-ig而结合至原代鼠cd4+上呈现的icos的能力。五聚体hicos-l.comp足以竞争超过micos-l-ig而结合至活化的t细胞表达的icos(图9e)。

icos-l.comp共刺激人t细胞

已确定icos-l.comp在激动icos信号转导以共刺激人t细胞中的功能。用抗-cd3抗体在体外刺激cfse标记的从新鲜的人体脐带血中分离的cd3+t细胞，在培养基中加入可溶的icos-l.comp或comp(阴性对照)。通过流式细胞术(facs)在72小时后追踪细胞的扩张和增殖，证明icos-l.comp而不是comp显著刺激cd4+和cd8+t细胞的增殖(图10a)。此外，icos-l.comp诱导t细胞活化标记物cd25的上调(图10b)。与hicosl-comp形成鲜明对比，icosl-fc作为可溶性配体不能诱导cd3+cd4+t细胞的扩张和增殖(图10c)。最后，在没有抗-cd3诱导的t细胞受体信号转导的情况下，icosl-comp不刺激t-细胞，从而证实了icos-comp作为共刺激配体的功能(图10d)。从成人pbmc中分离出的t细胞在共刺激中也有类似的结果(图10e)。此外，可溶性icosl-comp共刺激而不是icosl-fc导致分泌的th1细胞因子ifnγ、tnfα和il10显著增加，而il2和il6则有适度的但不是显著的增加(图10f)。这些实验共同表明，可溶性icos-l.comp很容易使icos信号转导通路激动，以刺激人t细胞的增殖和活化。

icos-l.comp与检查点阻断协同促进小鼠中保护性抗肿瘤免疫

为了确定icos-l.comp与检查点阻断结合的抗肿瘤功效，采用mc38结肠癌模型。此处，具有免疫能力的c57bl/6小鼠皮下注射mc38细胞和肿瘤，确立肿瘤体积为50-150mm³，然后用pbs(对照)、抗-pd-1单一疗法、icos-l.comp单一疗法或icos-l.comp联合抗pd-1(联合)处理(图11a)。与抗pd-1单一疗法相比，icos-l.comp和抗pd-1联合处理导致肿瘤生长明显延迟(＊＊p＜0.01)(图11b)。每个动物肿瘤的个体追踪表明，在末次处理时，在联合组中的3/12只动物中观察到完全响应(图11c)，任何其他组中完全消退的实例为零。与pbs对照相比，icos-l.comp单一疗法组中的动物没有表现出结果的改善，这表明在此模型中需要与检查点阻断联合使用(图12a)。支持联合方法的作用的是，肿瘤浸润cd4+和cd8+t细胞具有明显更高的icos表达，并且在肿瘤内的icos+细胞总体增加(图12b)。这些共同表明，通过与可溶性icos激动剂联合处理，可使上调icos表达和增加til丰度的检查点阻断抗体的功效增强。支持性地，与单独抗pd-1单一疗法比较，抗pd-1和icos-l.comp联合处理可使til区(cd45+)内的cd4+foxp3-(cd4效应物)细胞适度但显著地增加(＊p＜0.05)(图12c)。treg细胞(cd4+foxp3+)的丰度没有变化(图12d)。

这些数据共同表明，icos-lecd五聚体(icos-l.comp)能容易地以高亲和力与icos结合，以共刺激人t细胞。重要的是，这种体内共刺激当与检查点阻断(抗pd-1抗体)结合时可导致抗肿瘤活性增加，减轻肿瘤负担。

实施例5：pd-l1.comp方法

pd-l1五聚体(pd-l1.comp)表达载体的设计

合成经密码子优化的dsdna构建体(idt)，其携带ecori(5′)和kpnl(3′)限制性位点，编码小鼠pd-l1ecd。消化该构建体，并将其连接到ecori/kpnl双消化质粒(comp.his8-pcdna3.4)中，从而pd-l1ecd(seqidno：42)位于ig-kappa前导序列的下游和comp五聚体化结构域(seqidno：12)的上游(pd-l1.comp；序列见附录1的seqidno：46)。

嵌合pd-l1.comp的表达与纯化

按照制造商的方案(geneart；thermofisherscientific)，将编码pd-l1.comp的质粒转染到expi293f细胞中，并通过将转染后的细胞暴露于遗传霉素(geneart；thermofisherscientific)两周，从而挑选出分泌pd-l1.comp的稳定的细胞系。用histraphp柱(gehealthcare)从细胞培养物的上清液中纯化分泌的组氨酸标记的pd-l1.comp。纯化后，用pd10柱(gehealthcare)将蛋白质样品脱盐至ph7.4的pbs中。用sds-page法验证蛋白质纯度，通过bca分析(pierce)或a280测量法定量测定蛋白质浓度。

t细胞系活化和增殖试验

鼠2.10t细胞克隆在补入il-2(3.5μg/ml)、卵磷脂(20μg/ml)和bsa(0.5mg/ml)的完全imdm中培养。为了活化试验，收集细胞，洗涤3次，以2×10⁴细胞/孔接种到涂覆抗-cd3(3μg/ml，bioxcell)的96孔板中。将pd-l1.comp和comp(阴性对照)在涂覆抗-cd3的孔中于37℃、ph7.4的pbs中涂覆1小时，或将它们以10μg/ml构建体浓度加入到溶解2.10细胞的孔中。培养细胞18小时，然后用1uci[3h]-胸苷脉冲，再培养6小时。用topcountnxt闪烁计数器(perkinelmer)定量测定[3h]-胸苷摄入和增殖。

与pd-1表达t-细胞克隆结合

使用2.10t细胞系通过流式细胞术研究pd-l1.comp与细胞表达pd-1的结合。按照制造商的指示(thermoscientific)使用ex-link硫代-nhs-lc-生物素试剂进行pd-l1.comp生物素化，然后用pd10柱脱盐到pbs中以去除过量的生物素试剂。在4℃下，将静息或抗-cd3活化的2.10细胞用生物素化的comp或pd-l1.comp孵育30分钟。随后在pbs中洗涤细胞，在4℃下用链霉亲和素-pe(1：100，biolegend)染色30分钟。将这些细胞用pbs洗涤，再悬浮在pbs+dapi中(用于活/死细胞排除)，并使用facscalibur细胞分析仪(bectondickinson)读数。

原代cd4+t细胞系的活化和增殖

用小鼠cd4+t细胞分离试剂盒(stemcelltechnologies)从小鼠脾细胞中分离cd4+t细胞。使用制造商方案(thermofischerscientific)对cd4+t细胞进行cfse标记，并接种于涂覆抗-cd3(3μg/ml)的96孔板上，在培养基中添加可溶的10μg/ml的pd-l1.comp、hb7-h4.comp、mvista.comp或comp。72小时后收集细胞，通过facs(facscalibur，bectondickinson)分析cfse图谱。在某些情况下，在48小时和72小时收集cfse标记的细胞的培养基，通过elisa(r&dsystems)定量测定il-2和ifnγ分泌。

实施例6：pd-l1.comp结果

对负检查点受体的刺激是通过apc和肿瘤细胞上表达的蛋白配体(如pd-l1)所呈现的igv结构域与t细胞上的其同源免疫检查点受体(如pd-1)的互补igv结构域的结合而发生的。过去的研究表明，这些单体形式的igv结构域(包括pd1：pd-l1和cd28：cd80/cd86)以适度的亲和力相互作用，这通过通常在低微摩尔(μm)范围内的kd值反映(参考文献40，41)。为了在体外激活t细胞上的检查点受体，这些免疫检查点配体已被表达为二聚体，例如被固定在表面上的fc融合蛋白。固定化呈现模拟在这种免疫检查点结构域出现在apc和t细胞表面时发生的亲和力事件。先前报告表明，pd-l1-fc需要固定在平板或珠子上，以成功地激动pd-1免疫抑制信号转导，这表明在体内使用pd-l1-fc以抑制t细胞活性可能受到限制，因为它不能完全激动pd-1。

在不受理论约束的情况下，可溶性pd-l1在体外缺乏活性可能是由于对其受体的亲和力不足和/或缺乏使pd-1聚集的能力所致。这一假说得到了以下发现的进一步支持：可溶性vistaigv五聚物(vista.comp)在体外能够轻易地抑制t细胞增殖，而二聚体vista-fc则不能抑制t细胞增殖。

pd-l1同五聚体：pd-l1.comp的设计、表达及纯化

为了产生一种可在体外和体内有效抑制t细胞刺激的pd-1激动剂，我们改造了一种更高级别的pd-l1ecd多聚体。将小鼠pd-l1ecd结构域与comp五聚体化结构域进行基因融合，构建了一种重组pd-l1五聚体(pd-l1.comp；序列见附录1中的seqidno：46)。重组pd-l1.comp是在哺乳动物的表达系统中产生的，得到了一种通过comp五聚体化结构域内的分子内二硫键稳定的约250-300kda的五聚体蛋白(图5a)。

pd-l1.comp与t细胞系表达的pd-1结合

用生物素化的pd-l1.comp或comp对2.10t细胞系进行流式细胞术分析，以确定pd-l1.comp与在细胞背景中表达的pd-1结合。用相同数量的生物素基团标记pd-l1.comp和comp，并将它们用来染色初始或抗-cd3激活的2.10细胞。pd-l1.comp而不是comp，容易与初始2.10t细胞结合，在整个t细胞活化过程中结合量增加，这与确立的在t细胞活化过程中pd-1上调的动力学一致(图13)。

原代cd4+t细胞系活化和增殖

与pd-l1-fc需要固定化来激动pd-1和抑制t细胞活性相比，可溶性pd-l1.comp完全抑制了经历抗-cd3抗体介导刺激的cfse标记的原代鼠cd4+t细胞的扩张和增殖。重要的是，仅重组comp结构域并不能显著抑制t细胞增殖，由此证实所观察到的pd-l1.comp的免疫抑制作用并不是由于comp五聚体化结构域或组氨酸标签而产生的脱靶事件(图6a)。

实施例7：b7-h4.comp方法

五聚体b7-h4结构的设计

合成了经密码子优化的基因片段(geneart，thermofisherscientific)，其编码融合到comp五聚体化结构域的人b7-h4，并将所述基因片段克隆到具有5′ig-kappa先导序列的pcdna3.4表达质粒中。最后的构建体由编码以下序列的dsdna组成：人b7-h4ecd(seqidno：25)、其后的间隔序列、comp五聚体化结构域(seqidno：11)、其后的另一个间隔序列、和his8标签(b7-h4.comp；序列见于附录1的seqidno：30)。

五聚体b7-h4.comp的表达和纯化

使用制造商的方案(thermofisherscience)，使用expi293瞬时哺乳动物表达系统来表达hb7-h4.comp。对分泌的hb7-h4.comp进行pbs透析，用histraphp柱进行ni-nta纯化。用pd-10柱(gehealthcare)将该蛋白脱盐到ph7.4的pbs中，用sds-page验证纯度并用a280测量法测定浓度。

2.10t细胞活化试验

将克隆的il-2依赖性的2.10t细胞在补入il-2(3.5μg/ml)、卵磷脂(20μg/ml)和bsa(0.5mg/ml)的完全imdm中培育。收集细胞，将细胞冲洗3次，再悬浮于不合il-2和卵磷脂的完全imdm中，以2×10⁴细胞/孔接种于涂覆抗-cd3(3μg/ml，bioxcell)的96孔板上。将hb7-h4.comp、vista.comp(阳性对照)和comp(阴性对照)在37℃于pbs中涂覆于抗cd3涂覆的孔中1小时，随后充分清洗，或者直接添加到孔中，与2.10细胞相溶解。细胞培养18小时，然后用1uci[3h]-胸苷冲击，再培养6小时。用topcountnxt闪烁计数器(perkinelmer)定量测定[3h]-胸苷的摄入和增殖。

原代cd4+t细胞系的活化和增殖

用小鼠cd4+t细胞分离试剂盒(stemcelltechnologies)从小鼠脾细胞中分离cd4+t细胞。使用制造商方案(thermofischerscientific)对cd4+t细胞进行cfse标记，并接种于涂覆抗-cd3(3μg/ml)的96孔板上，添加pd-l1.comp、hb7-h4.comp、mvista.comp或comp，其以10μg/ml溶解于培养基。72h后收集细胞，facs(facscalibur，bectondickinson)分析cfse图谱。在某些情况下，在48小时和72小时收集cfse标记细胞的培养基，通过elisa(r&dsystems)定量测定il-2和ifnγ分泌。

与t细胞克隆结合

使用2.10t细胞系通过流式细胞术检测b7-h4.comp与t细胞上表达的其假定受体(b7-h4r)的结合。按照制造商的方案(thermoscientific)使用ex-link硫代-nhs-lc-生物素试剂使b7-h4.comp生物素化，然后用pd10柱使其脱盐到pbs中以去除过量的生物素试剂。在4℃下，将静息的或抗-cd3活化的2.10细胞用生物素化的comp或b7-h4.comp孵育30min。随后将细胞在pbs中洗涤，在4℃下用链霉亲和素-pe(1：100，biolegend)染色30分钟。将这些细胞用pbs洗涤，再悬浮在pbs+dapi中(用于活/死细胞排除)，并使用facscalibur细胞分析仪(bectondickinson)读数。

实施例8：b7-h4.comp结果

先前的报道表明b7-h4-fc需要固定在平板或珠子上，以成功地激动t细胞中的免疫抑制信号转导，这表明b7-h4-fc在体内抑制t细胞活性的用途可能由于其在缺少fcr介导的交联的情况下不能充分地激动假定受体而受到限制。

在不受理论约束的情况下，可溶性b7-h4-fc在体外缺乏活性可能是由于对其受体的亲和力不足和/或缺乏使假定受体聚集的能力所致。这一假说得到了以下发现的进一步支持：可溶性vistaigv五聚体(vista.comp)在体外能够轻易地抑制t细胞增殖，而二聚体vista-fc则不能抑制t细胞增殖。

b7-h4五聚体的设计和表达

为了解决不充分的亲合力或缺乏聚集的问题，通过将b7-h4ecd与comp五聚体化结构域融合，生成了人b7-h4的五聚体(b7-h4.comp，序列参见附录1的seqidno：30)。b7-h4.comp在哺乳动物细胞中很容易产生，并纯化至均质，得到mw为250-300kda的稳定五聚体(图5a)。

hb7-h4.comp与克隆的t细胞系结合并抑制其活化

用生物素化的b7-h4.comp或comp对2.10t细胞系进行流式细胞术分析，以确定b7-h4.comp与在t细胞上表达的假定b7-h4r结合。用相同数量的生物素基团标记b7-h4.comp和comp，并用它们染色初始或抗-cd3活化的2.10细胞。b7-h4.comp而不是comp容易与初始的和活化的2.10t细胞结合(图13)。

使用il-2依赖性2.10t细胞作为报告系统，检测b7-h4.comp是否能抑制t细胞的活化。与之前的观察一致，使用五聚体vista.comp、b7-h4.comp抑制抗-cd3诱导的增殖，无论其是以固定化配体的形式存在还是以培养基中的可溶形式提供(p＜0.01)(图14)。comp五聚体化结构域在以可溶性配体的形式加入时，不会显著改变细胞增殖，这证实了vista.comp和b7-h4.comp的靶向效应。

b7-h4.comp抑制原代cd4+t细胞系的活化和增殖

与b7-h4-fc需要固定化来激动b7-h4r并抑制t细胞活性相比，可溶性b7-h4-comp完全抑制经历抗-cd3抗体介导的刺激的cfse标记的原代小鼠cd4+t细胞的扩张和增殖(图15)。重要的是，仅重组comp结构域并不能明显地抑制t细胞增殖，这证实所观察到的b7-h4.comp的免疫抑制作用并不是由于comp五聚体化结构域或组氨酸标签而导致的脱靶事件。此外，可溶性b7-h4.comp使受激的cd4+t细胞分泌的炎症细胞因子il-2显著减少(p＜0.01)(图16)。

检查点配体的五聚体化作为设计高亲和力检查点受体激动剂的策略

本文提供的数据表明，三个检查点配体(即pd-l1、b7-h4和vista)的五聚体化可用于设计能够抑制体外t细胞活性并能够抑制体内炎症反应的高亲和力检查点受体激动剂。固定和可溶的vista-fc和vista.comp之间的比较表明，作为检查点受体激动剂的活性取决于低聚化水平，而利用comp五聚体化结构域产生具有更高亲和力的多聚体是在溶液中(即在没有固定到基质的情况下)具有活性的必要条件。本发明人已经发现，comp结构域是检查点配体的ecd融合时表达稳定的五聚体的有用的支架。本文所提供的数据，结合在小鼠中的检查点配体和受体遗传缺失时观察到的自身免疫性疾病恶化的观察结果，表明用五聚体激动剂激动这些检查点受体以在临床上抑制不希望的免疫应答的潜在效用。

虽然已参照某些具体实施方案对本发明进行了描述，但在不偏离如所附的权利要求书中列出的本发明的目的和范围条件下，本发明的各种修改对本领域的技术人员来说是显而易见的。本文提供的任何实施例仅用于说明本发明，并不意欲以任何方式限制本发明。本文提供的任何附图仅用于说明本发明的各个方面，并不意欲以任何方式缩小或限制本发明。本文所述的所有现有技术的公开内容以引文的方式全部纳入本说明书。

附录1：序列

vista胞外结构域cdna序列(人)(seqidno：1)

vista胞外结构域cdna序列(小鼠)(seqidno：2)

comp五聚体化结构域cdna序列(人)(seqidno：3)

comp五聚体化结构域cdna序列(小鼠)(seqidno：4)

vista胞外结构域mrna序列(人)(seqidno：5)

vista胞外结构域mrna序列(小鼠)(seqidno：6)

comp五聚体化结构域mrna序列(人)(seqidno：7)

comp五聚体化结构域mrna序列(小鼠)(seqidno：8)

vista胞外结构域氨基酸序列(人)(seqidno：9)

vista胞外结构域氨基酸序列(小鼠)(seqidno：10)

comp五聚体化结构域氨基酸序列(人)(seqidno：11)

comp五聚体化结构域氨基酸序列(小鼠)(seqidno：12)

密码子优化的mvista.compdna序列(小鼠)(seqidno：13)

非粗体＝未翻译的核苷酸

波浪下划线＝编码igkappa分泌信号的dna序列

大写，无下划线(黑色)＝vista细胞外结构域

实线下划线(灰色)＝间隔序列

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝编码his-标签的dna序列

双下划线＝终止密码子

粗体＝翻译的核苷酸

mvista.comp氨基酸序列(小鼠)(seqidno：14)

波浪下划线＝igkappa分泌信号

粗体(黑色)＝包含igv结构域的vista胞外结构域

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝组氨酸标签

下划线(灰色)＝间隔序列

全长vista氨基酸序列(人)(seqidno：15)

登录号q9h7m9

粗体＝含有igv结构域的vista胞外结构域(氨基酸31-193)

全长vista氨基酸序列(小鼠)(seqidno：16)

登录号q9d659

粗体＝含有igv结构域的vista胞外结构域(氨基酸31-193)

全长comp氨基酸序列(人)(seqidno：17)

登录号np_000086

粗体＝五聚体化结构域(氨基酸28-73)

全长comp氨基酸序列(小鼠)(seqidno：18)

登录号np_057894

粗体＝五聚体化结构域(氨基酸28-72)

vistacdna核苷酸序列(人)(seqidno：19)

登录号nm_022153

粗体＝含有igv结构域的vista胞外结构域(235-720)

vistacdna核苷酸序列(小鼠)(seqidno：20)

登录号xr_380449

粗体＝含有igv结构域的vista胞外结构域(101-574)

全长compcdna核苷酸序列(人)(seqidno：21)

登录号nm_000095

粗体＝五聚体化结构域(121-255)

compcdna核苷酸序列(小鼠)(seqidno：22)

登录号nm_016685

粗体＝五聚体化结构域(105-240)

密码子优化的vista.compdna序列(人)(seqidno：23)

波浪下划线＝编码igkappa分泌信号的dna序列

下划线(灰色)＝间隔序列

大写，无下划线(黑色)＝vista胞外结构域

小写斜体＝comp五聚体化结构域

双下划线＝终止密码子

点下划线＝编码his标签的dna序列

vista.comp氨基酸序列(人)(seqidno：24)

波浪下划线＝igkappa分泌信号

小写粗体(黑色)＝包含igv结构域的vista胞外结构域

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝组氨酸标签

下划线(灰色)＝间隔序列

b7-h4胞外结构域氨基酸序列(人)(seqidno：25)

b7-h4胞外结构域cdna序列(人)(seqidno：26)

b7-h4胞外结构域mrna序列(人)(seqidno：27)

b7-h4全长氨基酸序列(人)(seqidno：28)

登录号q7z7d3

b7-h4全长cdna核苷酸序列(人)(seqidno：29)

登录号ay280972

b7-h4.comp氨基酸序列(人b7-h4.comp)(seqidno：30)

波浪下划线＝igkappa分泌信号

粗体(黑色)＝含有b7-h4胞外结构域

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝组氨酸标签

下划线(灰色)＝间隔序列

b7-h4.comp密码子优化的dna序列(人b7-h4)(seqidno：31)

b7-h4.comp氨基酸序列(小鼠)(seqidno：32)

波浪下划线＝igkappa分泌信号

粗体(黑色)＝含有b7-h4胞外结构域

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝组氨酸标签

下划线(灰色)＝间隔序列

密码子优化的b7-h4.compdna序列(小鼠)(seqidno：33)

波浪下划线＝编码igkappa分泌信号的dna序列

大写，无下划线(黑色)＝pd-l1胞外结构域

下划线(灰色)＝间隔序列

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝编码his标签的dna序列

双下划线＝终止密码子

b7-h4全长氨基酸序列(小鼠)(seqidno：34)

登录号q7tsp5

b7-h4全长cdna核苷酸序列(小鼠)(seqidno：35)

登录号ay280973

pd-l1胞外结构域氨基酸序列(人)(seqidno：36)

pd-l1胞外结构域cdna核苷酸序列(人)(seqidno：37)

pd-l1全长氨基酸序列(人)(seqidno：38)

登录号q9nzq7

pd-l1全长核苷酸序列(人)(seqidno：39)

登录号af177937

pd-l1.comp氨基酸序列(人)(seqidno：40)

波浪下划线＝igkappa分泌信号

粗体(黑色)＝含有igv结构域的pd-l1胞外结构域

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝组氨酸标签

下划线(灰色)＝间隔序列

密码子优化的pd-l1.comp编码核苷酸序列(人)(seqidno：41)

波浪下划线＝编码igkappa分泌信号的dna序列

大写，无下划线(黑色)＝pd-l1胞外结构域

下划线(灰色)＝间隔序列

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝编码his标签的dna序列

双下划线＝终止密码子

pd-l1胞外结构域氨基酸序列(小鼠)(seqidno：42)

pd-l1胞外结构域cdna核苷酸序列(小鼠)(seqidno：43)

pd-l1全长氨基酸序列(小鼠)(seqidno：44)

登录号q9ep73

pd-l1全长cdna核苷酸序列(小鼠)(seqidno：45)

登录号af317088

pd-l1.comp氨基酸序列(小鼠)(seqidno：46)

波浪下划线＝igkappa分泌信号

粗体(黑色)＝含有igv结构域的pd-l1胞外结构域

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝组氨酸标签

下划线(灰色)＝间隔序列

pd-l1.comp编码核苷酸序列(小鼠)(seqidno：47)

波浪下划线＝编码igkappa分泌信号的dna序列

大写，无下划线(黑色)＝pd-l1细胞外结构域

下划线(灰色)＝间隔序列

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝编码his标签的dna序列

双下划线＝终止密码子

icos-l胞外结构域cdna核苷酸序列(人)(seqidno：48)

icos-l胞外结构域氨基酸序列(人)(seqidno：49)

icos-l全长cdna核苷酸序列(人)(seqidno：50)

登录号af289028

icos-l全长氨基酸序列(人)(seqidno：51)

登录号o75144

icos-l胞外结构域cdna核苷酸序列(小鼠)(seqidno：52)

icos-l胞外结构域氨基酸序列(小鼠)(seqidno：53)

icos-l全长氨基酸序列(小鼠)(seqidno：54)

登录号q9jhj8

icos-l全长cdna核苷酸序列(小鼠)(seqidno：55)

登录号af199027

密码子优化的icos-l.comp编码核苷酸序列(人)(seqidno：56)

波浪下划线＝编码igkappa分泌信号的dna序列

大写，无下划线(黑色)＝icos-l胞外结构域

下划线(灰色)＝间隔序列

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝编码his-标签的dna序列

双下划线＝终止密码子

icos-l.comp氨基酸序列(人)(seqidno：57)

波浪下划线＝igkappa分泌信号

粗体(黑色)＝包含igv结构域的icos-l胞外结构域

小写斜体＝comp五聚体化的结构域

点下划线＝组氨酸标签

下划线(灰色)＝间隔序列

密码子优化的icos-l.comp核苷酸序列(小鼠)(seqidno：58)

波浪下划线＝编码igkappa分泌信号的dna序列

大写，无下划线(黑色)＝icos-l胞外结构域

下划线(灰色)＝间隔序列

小写斜体＝comp五聚体化的结构域

点下划线＝编码his标签的dna序列

双下划线＝终止密码子

密码子优化的icos-l.comp氨基酸序列(小鼠)(seqidno：59)

波浪下划线＝igkappa分泌信号

粗体(黑色)＝包含igv结构域的icos-l胞外结构域

小写斜体＝comp五聚体化结构域

点下划线＝组氨酸标签

下划线(灰色)＝间隔序列

strep-标签-iivista.comp氨基酸序列(小鼠)(seqidno：60)

人icos-l胞外结构域mrna序列(seqidno：61)

人pd-l1胞外结构域mrna序列(seqidno：62)

引用文献：

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