生物分子-聚合物缀合物的高通量合成的制作方法

交叉引用本申请要求于2017年6月9日提交的美国临时申请号62/517,570的权益，其通过引用以其全文并入本文。发明背景近年来，研究人员试图利用蛋白质的独特性质，特别是生物识别和结构特异性，来用于新的应用。天然蛋白可能能够执行广泛的功能，但由于缺乏化学或热稳定性或者在最佳条件之外活性降低，其应用可能受到限制。研究集中在通过蛋白质-聚合物缀合物的合成来生成更稳定的蛋白质的方法上。例如，相对于未修饰的蛋白质，peg化的蛋白质可以表现出改善的水溶性。蛋白质的修饰可以增强其功能性。聚合物缀合可以为在诸如工业催化和治疗学等领域中使用某些蛋白质开辟扩展的可能性。技术实现要素：因此，迫切需要快速合成和筛选具有增强的性质的新的生物分子-聚合物缀合物，以用于工业催化和治疗学。本公开内容通过用于生物分子-聚合物缀合物的合成、筛选和优化的高通量系统满足了本领域的这一需求。该系统允许快速且自动化地筛选生物分子-聚合物缀合物。迄今为止，仅有低通量合成和表征方法被应用于生物分子-聚合物缀合物的制备，从而将开发限制于每种蛋白质只有几种类型的聚合物修饰，并且依靠随机猜测来选择测试的变体。本公开内容利用了组合式且高通量的生物缀合物系统，该生物缀合物系统允许在一周内快速地筛选大量的变体(例如，大约10,000种/周)。传统的方法需要数位科学家历经一年或更长的时间来创造和分析如此大量的生物缀合物。因此，本公开内容的方法的主要益处之一是能够生成具有不同聚合物覆盖密度、聚合物类型、尺寸、组成和架构的生物分子-聚合物缀合物的大库，并且能够使该库的成员与生物分子性能匹配以便鉴别何种聚合物修饰影响各种生物分子性质。另外，以迭代的方式应用本发明方法提供了将发现的性质合并(例如，生成温度和ph稳定的生物缀合物)以获得对于所选应用的最佳性能的机会。本发明方法的应用允许发展对聚合物与生物分子之间的结构-性质关系的更彻底理解，从而开发新的和性能更好的生物分子-聚合物缀合物。在某些方面，本公开内容提供了同时合成多个生物分子-引发剂缀合物的方法。所述方法可以包括(a)向多个反应室中的每个反应室提供生物分子和可控自由基聚合引发剂，其中为每个反应室独立地选择所述生物分子的身份、所述生物分子的浓度、所述可控自由基聚合引发剂的身份和所述可控自由基聚合引发剂的浓度；以及(b)将所述多个反应室维持在适合于形成多个生物分子-引发剂缀合物的条件下。所述方法还可以包括同时纯化每个生物分子-引发剂缀合物，以及任选地，在纯化前或纯化后，评价所述多个生物分子-引发剂缀合物中的每个缀合物的一个或多个性质。任选地，所述方法还可以包括在所述多个反应室中的至少一个所述反应室中将所述生物分子与所述可控自由基聚合引发剂混合，从而形成均匀混合物。所述生物分子可以是肽或蛋白质，如酶或抗体。在一些实施方案中，每个反应室包含相同的生物分子。在实施任何本发明方法中，所述可控自由基聚合引发剂可以包括活化酯、卤代烷或链转移剂。任选地，所述可控自由基聚合引发剂是式(i)化合物：其中x是卤素或链转移剂；r1是氢或烷基；r2是活性酯部分；并且n是从1至6的整数。对于式(i)化合物，x可以是cl、br或f。任选地，所述可控自由基聚合引发剂是式(ii)化合物：其中x1是卤素或链转移剂；x2是烷基、芳基、卤素或链转移剂；x3是氢、卤素或烷基；r2是活性酯部分；并且n是从1至6的整数。对于式(ii)化合物，x1可以是cl、br或f。在一些实施方案中，x2是c1-6烷基、苯基、卤素或链转移剂，例如x2是甲基、苯基、卤素或链转移剂。在一些实施方案中，x2是cl、br或f。在一些实施方案中，x3是氢、卤素或c1-6烷基。在实施任何本发明方法中，所述可控自由基聚合引发剂的浓度在所述多个反应室之间可以是可变的。任选地，所述多个反应室包含至少两种不同的自由基聚合引发剂。每个反应室可以包含相同的可控自由基聚合引发剂。任选地，所述生物分子固定在所述反应室中。在某些方面，本公开内容提供了筛选多个生物分子-聚合物缀合物的方法，其中所述方法包括(a)向多个反应室中的每个反应室提供生物分子-引发剂缀合物、单体和催化剂；(b)将所述多个反应室维持在适合于形成多个生物分子-聚合物缀合物的可控自由基聚合条件下；(c)同时纯化所述多个生物分子-聚合物缀合物中的每个生物分子-聚合物缀合物；以及(d)评价纯化的生物分子-聚合物缀合物的一个或多个性质。所述可控自由基聚合条件可以包括用于原子转移自由基聚合(atrp)过程或者可逆加成-断裂链转移(raft)过程的条件。任选地，通过光照射来诱导聚合。每个反应室可以单独照射，其中所述光照射的持续时间和强度在所述多个反应室之间是可变的。(a)的所述提供还可以包括从所述多个反应室除去氧气。(a)的所述提供还可以包括(i)在缓冲剂中将所述生物分子-引发剂缀合物与所述单体合并，从而形成混合物；(ii)从所述混合物除去氧气；以及(iii)在脱氧的混合物中生成活性催化剂物类。在一些实施方案中，所述催化剂在氧气存在下保持催化活性。可以通过酶催化反应除去氧气，该酶催化反应任选地包含选自葡萄糖氧化酶、胆红素氧化酶、邻苯二酚双加氧酶和萤光素酶的一种或多种酶。在一些实施方案中，本文公开的方法还可以包括在所述多个反应室中的至少一个所述反应室中将所述生物分子-引发剂缀合物、所述单体与所述催化剂混合，从而形成均匀混合物。在一些实施方案中，通过所述单体的聚合而形成的所述生物分子-聚合物缀合物的聚合物对刺激，如ph、温度或光有响应。单体的浓度、所述催化剂的浓度和/或所述催化剂的身份在所述多个反应室之间可以是可变的。所述生物分子-引发剂缀合物可以固定在所述反应室中。所述单体可以选自(甲基)丙烯酸酯和(甲基)丙烯酰胺。在一些实施方案中，所述单体包括选自(甲基)丙烯酸酯和(甲基)丙烯酰胺的至少两种单体的混合物。在(c)的所述纯化之前，所述方法还可以包括向所述多个生物分子-聚合物缀合物提供第二单体。所述第二单体可以选自(甲基)丙烯酸酯和(甲基)丙烯酰胺。本文所述的(甲基)丙烯酸酯和(甲基)丙烯酰胺可以包含羧基甜菜碱、磺酸盐/酯、季铵、二烷基氨基、氨基、羧酸盐/酯、羟基、硫氧基或低聚(乙二醇)部分中的一种或多种。在一些实施方案中，所述单体包括甲基(丙烯酸酯)或(甲基)丙烯酰胺，其中所述(甲基)丙烯酸酯或所述(甲基)丙烯酰胺包含磺酸根阴离子和铵根阳离子中的至少一种。本文所述的任何生物分子-引发剂缀合物可以包含肽或蛋白质。任选地，所述生物分子-引发剂缀合物是式(iii)化合物：其中z是所述生物分子；y是从1至100的整数；x1是卤素或链转移剂；x2是甲基、芳基、卤素或链转移剂；x3是氢、卤素或烷基；r2是活性酯部分；并且n是从1至6的整数。在一些实施方案中，x2是甲基、苯基、卤素或链转移剂。在实施任何本发明方法中，所述多个反应室中的每个反应室可以由自动化液体处理装置独立地寻址。任选地，所述多个反应室在单个板上。在一些实施方案中，所述多个反应室在一个或多个板上。所述板上的每个反应室可以包含在所述反应室底部的膜，任选地其中所述膜是超滤膜。所述膜可以被配置成允许通过所述膜的连续流体输送。在实施任何本发明方法中，所述多个反应室，任选单个板，可以包括至少24个反应室，如至少96个反应室。在实施任何本发明方法中，所述纯化可以包括超滤，任选地其中所述超滤是真空辅助的。在一些实施方案中，每个反应室用少于1ml的液体完成所述纯化。所述多个反应室可以被配置成使得可以通过分光光度计准确地测量纯化的缀合物的吸光度或荧光。在某些实施方案中，所述评价包括紫外可见光谱法、荧光光谱法或近红外光谱法。所述评价可以包括任选地通过尺寸排阻色谱法、质谱法和动态光散射中的一种或多种来评估纯化的缀合物的尺寸。所述评价可以包括评估纯化的缀合物的活性，如酶活性。可以在所述生物分子的正常工作条件下或者在应激条件下评估所述酶活性。所述应激条件可以包括，相对于所述正常工作条件而言，升高或降低的温度、升高或降低的ph或者在缓冲溶液中升高或降低的水浓度。可以根据本文所公开的方法制备生物分子-引发剂缀合物的库。可以根据本文所公开的方法制备生物分子-聚合物缀合物的库。可以通过光诱导原子转移自由基聚合来制备生物分子-聚合物缀合物的库。可以通过耐氧的光诱导原子转移自由基聚合来制备生物分子-聚合物缀合物的库。在某些方面，本公开内容提供了同时从多个反应混合物分离多个生物缀合物的方法，其中所述方法包括使包含多个生物缀合物的多个反应混合物同时穿过多个超滤膜，其中所述生物缀合物保留在所述膜上，所述生物缀合物包括缀合至可控自由基聚合引发剂的生物分子或者缀合至合成聚合物的生物分子，并且其中所述多个反应混合物中的每个反应混合物被独立地纯化。在某些方面，本公开内容提供了用于同时合成多个生物分子-聚合物缀合物的系统，其中所述系统包含(a)多个反应室，该反应室被配置用于容纳1至1000μl的流体并且配置成允许通过分光光度计测量所述多个反应室中的每个反应室中包含的生物分子-聚合物缀合物的吸光度或荧光；(b)自动化装置，该自动化装置被配置用于向所述多个反应室中的每个反应室输送反应物、溶剂或催化剂中的一种或多种；(c)任选地，搅拌模块，该搅拌模块被配置用于将所述多个反应室中的每个反应室的内容物混合；(d)监测模块，该监测模块被配置用于监测所述多个反应室中的反应室中发生的反应的进程，其中所述监测模块与分光光度计连通，该分光光度计被配置用于测量所述多个反应室中的至少一个反应室的内容物的吸光度和荧光中的至少一种；(e)纯化模块，该纯化模块与所述多个反应室流体连通，其中所述纯化模块被配置用于将生物分子-聚合物缀合物与其他反应混合物组分分离，并且其中所述其他反应混合物组分包括缓冲剂、单体和催化剂；以及(f)评价模块，该评价模块与所述多个反应室视觉连通，其中所述评价模块被配置用于评估所述多个反应室中的每个反应室中包含的生物分子-聚合物缀合物的一个或多个物理性质。所述系统还可以包含光照射模块，该光照射模块与所述多个反应室视觉连通，其中所述光照射模块被配置用于在所述多个反应室中的反应室中通过光照射引发聚合反应。所述光照射模块可以被配置用于单独控制所述多个反应室中的每个反应室的光照射持续时间。任选地，所述光照射模块被配置用于单独控制所述多个反应室中的每个反应室的光照射强度。所述系统还可以包含温度控制模块，该温度控制模块被配置用于将所述多个反应室维持在特定的温度范围内。任选地，所述温度控制模块包含冷却剂。援引并入本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。附图说明在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：图1图示了生物分子-聚合物缀合物的合成，包括(a)引发剂附接至生物分子以形成生物分子-引发剂缀合物以及(b)单体聚合至生物分子-引发剂缀合物以形成生物分子-聚合物缀合物。图2a图示了酶-引发剂缀合物的组合合成，并且图2b图示了缀合物的高通量纯化和表征。图3a图示了酶-聚合物缀合物的组合合成、高通量纯化和表征，并且图3b图示了示例性的缀合物库。图4图示了光介导的atrp设置，其中将96孔板放置在光源的顶部，并通过风扇提供任选的冷却。图5描绘了在96孔板光atrp转化中的聚合反应的反应进程(上)，以及相同聚合反应的平均分子量(实心圆)和多分散性(空心圆)随转化百分比的演变(下)。图6提供了反应a(上)和反应c(下)的gpc轨迹。图7示出了通过耐氧的光atrp而制备的胰凝乳蛋白酶-聚合物缀合物的类型。图8描述了nhs-atrp引发剂的形成，其向酶表面的附接以及随后的分析。图9描绘了附接至酶的atrp引发剂的数量如何随不同反应条件(缓冲剂类型、ph、试剂比例)变化以及如何影响酶活性。图10示出了用atrp引发剂修饰脂肪酶的反应工作流程和示例性的产物分析测定。图11示出了附接至脂肪酶的atrp引发剂的数量，其取决于反应介质的ph和nhs-atrp引发剂相对酶上可用氨基基团数量的当量。图12示出了在改变反应介质的ph和atrp引发剂相对酶上可用氨基基团数量的当量的情况下制备的附接有atrp引发剂的酶的残余酶活性。图13图示了脂肪酶上附接的atrp引发剂的数量，其取决于酶的浓度和nhs-atrp引发剂相对酶上可用氨基基团数量的当量。图14描绘了在不同酶浓度的溶液和atrp引发剂相对酶上可用氨基基团数量的当量的情况下制备的附接有atrp引发剂的脂肪酶的残余酶活性。图15示出了96孔板中用于制备脂肪酶-pnipaam缀合物的反应条件的筛选(左)以及每个孔中聚合的最终视图(右)。图16描绘了在不同反应条件下制备的脂肪酶-pnipaam缀合物的凝胶电泳结果。图17图示了在不同反应条件下制备的脂肪酶-pnipaam的生物缀合物的残余酶活性。图18描绘了用于在高通量组合式合成和筛选中制备脂肪酶-聚合物缀合物的不同单体的结构。图19示出了脂肪酶-聚合物缀合物的凝胶电泳结果与仅用atrp引发部分修饰的脂肪酶的凝胶电泳结果的比较。图20图示了脂肪酶和脂肪酶-聚合物生物缀合物在催化大豆油与甲醇的酯交换反应中的活性(ffa——游离脂肪酸，fame——脂肪酸甲酯)。具体实施方式定义术语“生物分子”是指蛋白质、肽、酶或抗体。术语“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用，指氨基酸聚合物。术语“链转移剂”是指用于聚合的试剂，该试剂具有通过在生长链末端向活性自由基产生原子来阻止分子链生长的能力。如本文所用的术语“多个”可以指大于1的任何数量，如大于或等于2、6、12、24、48、96、192、384、768或1536的数量。术语“可控自由基聚合引发剂”是指这样的分子，其生成自由基物类以开始通过连续加入自由基构建单元来合成聚合物链。术语“可控自由基聚合引发剂”和“引发剂”在本文中可互换使用，指开始自由基聚合过程的分子。术语“生物分子-引发剂缀合物”是指同时包含生物分子和一个或多个可控自由基聚合引发剂，例如5个或更多、10个或更多、25个或更多、50个或更多或者100个或更多可控自由基聚合引发剂的复合物。优选地，一个或多个可控自由基聚合引发剂共价附接至生物分子。术语“生物分子-聚合物缀合物”是指同时包含生物分子和一个或多个聚合物链，例如包括5个或更多、10个或更多、25个或更多、50个或更多或者100个或更多聚合物链的任何复合物。优选地，一个或多个聚合物链共价附接至生物分子。术语“原子转移自由基聚合”(atrp)是指通过过渡金属催化剂形成碳-碳键的聚合技术。“可逆加成-断裂链转移”(raft)是指使用链转移剂以控制生成的聚合物重量的聚合技术。术语傅立叶变换红外光谱、近红外光谱、高效液相色谱、气相色谱、核磁共振、质谱和凝胶渗透色谱分别称为ftir、nir、hplc、gc、nmr、ms和gpc。单体的2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯称为dmaema，并且聚(2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯)称为pdmaema。最低临界溶解温度称为lcst，并且最高临界溶解温度称为ucst。胰凝乳蛋白酶称为ct，聚(季铵)称为pqa，并且1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺称为hmteta。聚(n-异丙基丙烯酰胺)称为pnipam，并且聚[n,n’-二甲基(甲基丙烯酰氧乙基)丙烷磺酸铵]称为pdmaps。n-羟基琥珀酰亚胺称为nhs，并且三-[2-(二甲氨基)乙基]胺称为me6tren。低聚(乙二醇)单甲基醚甲基丙烯酸酯称为oeoma，2-羟基乙基2-溴代异丁酸酯称为hoebib，并且三(2-吡啶基甲基)胺称为tpma。n-[3-(二甲氨基)丙基]丙烯酰胺称为dmapaam，并且(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵称为qnaam。高通量系统本公开内容提供了能够改变反应条件、监测反应进程和评价合成的生物分子-聚合物缀合物性质的高通量系统。通过将具有特定功能性的聚合物与生物分子缀合以形成理想地结合聚合物和生物分子两者的优点并同时消除各自缺点的复合物，从而合成生物分子-聚合物缀合物。大量可用的不同聚合物类型，加上大范围的缀合物功能性，使得难以针对特定功能或应用快速合成和优化生物分子-聚合物缀合物。另外，多种类型的聚合物可能接枝到相同生物分子上，这进一步扩大了待优化的可能反应条件的数量。这些聚合物影响生物分子-聚合物的最终功能性，包括化学和热稳定性、尺寸、催化活性、溶解度和药代动力学。虽然生物分子的修饰可以通过随机突变或通过克隆/表达、表达系统、生物多样性挖掘、定向诱变或定向进化而在生物学上实现，但是这些方法通常仅产生逐步的改进，规模化困难且昂贵，需要长的开发时间，并且通常仅提供情境解决方案。当前的合成方法涉及改变和尝试依次优化每个反应参数的缓慢过程。这可能包括优化聚合物和生物分子的类型和浓度、反应时间、温度和纯化步骤。反应参数的这种逐步变化会导致长周期的综合试验和错误，进而导致条件优化更加费力。本公开内容通过使用基于聚合物的生物分子工程和高通量合成提供了解决方案，用以快速筛选反应条件并评估最终生物分子-聚合物缀合物的功能性。具有这种性质的自动化系统可以解决改变多个参数的艰巨过程，并允许平行探索生物分子-引发剂和生物分子-聚合物缀合物的合成空间，从而允许快速生成最终缀合物以及大量关于反应条件对最终组成和功能性影响的数据。此外，可以使用自学习算法对高通量系统进行编程，以从第一轮合成中获取数据和结果，并在对缀合物合成进行帕累托(pareto)优化的尝试中充当生成新条件的反馈回路。用于同时合成多个生物分子-聚合物缀合物的具有这种性质的系统可以包含：(a)多个反应室，该反应室被配置用于容纳1至1000μl的流体并且配置成允许通过分光光度计测量所述多个反应室中的每个反应室中包含的生物分子-聚合物缀合物的吸光度或荧光；(b)自动化装置，该自动化装置被配置用于向所述多个反应室中的每个反应室输送反应物、溶剂或催化剂中的一种或多种；(c)任选地，搅拌模块，该搅拌模块被配置用于将所述多个反应室中的每个反应室的内容物混合；(d)监测模块，该监测模块被配置用于监测所述多个反应室中的反应室中发生的反应的进程，其中所述监测模块与分光光度计连通，该分光光度计被配置用于测量所述多个反应室中的至少一个反应室的内容物的吸光度和荧光中的至少一种；(e)纯化模块，该纯化模块与所述多个反应室流体连通，其中所述纯化模块被配置用于将生物分子-聚合物缀合物与其他反应混合物组分分离，并且其中所述其他反应混合物组分包括缓冲剂、单体和催化剂；以及(f)评价模块，该评价模块与所述多个反应室视觉连通，其中所述评价模块被配置用于评估所述多个反应室中的每个反应室中包含的生物分子-聚合物缀合物的一个或多个物理性质。所述系统还可以包含光照射模块，该光照射模块与所述多个反应室视觉连通，其中所述光照射模块被配置用于在所述多个反应室中的反应室中通过光照射引发聚合反应。所述光照射模块可以被配置用于单独控制所述多个反应室中的每个反应室的光照射持续时间。任选地，所述光照射模块被配置用于单独控制所述多个反应室中的每个反应室的光照射强度。包含光照射模块的系统还可以包括温度控制模块，如冷却模块。所述温度控制模块可以被配置用于将多个反应室维持在特定的温度下，或者在特定的温度范围内。任选地，所述温度控制模块包括风扇。所述风扇可以放置在所述光照射模块下方以向所述多个反应室提供冷却。如果需要额外的冷却，所述温度控制模块还可以包含冷却剂。例如，风扇可以放置在冷却剂的上方以产生指向多个反应室的较冷气流。具有这种性质的高通量系统的核心是探索生物分子-引发剂缀合物和生物分子-聚合物缀合物两者的合成空间和变化的能力(图1)。生物分子-聚合物缀合物的合成涉及首先将引发剂附接至感兴趣的生物分子以形成生物分子-引发剂缀合物。生物分子-聚合物缀合物可以随后通过一种或多种感兴趣的单体的聚合而形成。确定然后优化最终生物分子-聚合物缀合物的有利性质涉及改变将引发剂附接至生物分子以及通过聚合反应将聚合物接枝到生物分子上以形成生物分子-聚合物缀合物两者的合成条件。两个合成步骤都可以改变所得生物分子-聚合物缀合物的功能性。生物分子生物分子-聚合物缀合物的合成中的第一步涉及选择感兴趣的生物分子，如蛋白质或酶。蛋白质可以由数千至少于一百个氨基酸残基组成，该氨基酸残基通过肽键线性和/或树枝状连接，并且折叠成三维构型。蛋白质的构型决定功能。示例性的蛋白质包括胰凝乳蛋白酶、磷脂酶a、脂肪酶、腈水解酶、酰基转移酶和转氨酶。在一些实施方案中，生物分子是酶。酶起生物催化剂的作用，可以增加生物反应的速率，例如增加106至1014倍。大多数酶在温和的生理条件下具有反应性。酶的构型以及由此决定的可用结合位点的位置影响酶的特异性和选择性。酶具有活性结合位点，用于接收和结合底物如另一蛋白质，以形成酶-底物复合物。结合后，酶催化相关反应以产生催化反应的终产物。酶与它的底物和靶标相互作用是通过将其从溶剂中除去、结合、反应然后将产物返回到溶液。示例性的酶的类型包括酯酶、脂肪酶和蛋白酶。在自然界中，存在复杂的相互作用，其决定具有其特定功能的最终蛋白质结构。生物分子特别是酶的性质的可控操纵可以扩大能够使用生物分子的应用例如治疗应用的范围。例如，生物分子-聚合物缀合物可以保留天然生物分子的酶活性，同时在特定溶剂中、在给定的ph下和或/在特定的温度下具有改进的稳定性。聚合方法用于生成特定生物分子的生物分子-聚合物缀合物的整体合成方法对于实现缀合物的所需功能性很重要。聚合物缀合最初是使用“接枝到”技术建立的，其中将预合成的末端官能化聚合物与蛋白质表面上可接近的氨基酸侧链或末端缀合。通过偶联反应将官能化的合成聚合物接枝到生物分子表面的接枝位点通常是随机过程，其中不能控制接枝聚合物的密度和位点。一旦第一条聚合物链“接枝到”生物分子表面，空间位阻通常将阻止其他聚合物与表面附近的位点结合，导致接枝聚合物的密度低。尽管“接枝到”技术提供了大范围可供选择的聚合反应和单体，但是通常需要大量过量的聚合物才能克服由偶联聚合物引起的空间限制。另外，可以证明将生物分子-聚合物缀合物与未反应的聚合物分离是困难的。因此，针对生物分子-聚合物缀合物的合成开发了替代方法，该方法允许更高的聚合物密度和更好的位点控制。这种“从……接枝”方法开始于将蛋白质修饰有聚合物引发剂官能度，其可以通过聚合进一步延伸。这种技术导致高产量的明确限定的生物分子-聚合物缀合物和更简单的纯化，因为该缀合物只需要从小分子单体中分离。因此，通过“从……接枝”方法制备的生物分子-聚合物缀合物能够以降低的成本和更一致的逐批组成生成。生物分子-引发剂缀合物在将任何类型的聚合物接枝到生物分子之前，必须合成生物分子-引发剂缀合物。这需要将可控自由基聚合引发剂附接至生物分子的表面，通常通过使用表面反应性氨基酸。这些表面反应性氨基酸的侧链可以与引发剂共价偶联以合成生物分子-引发剂缀合物。本公开内容的一方面描述了同时合成多个生物分子-引发剂缀合物的方法，该方法包括(a)向多个反应室中的每个反应室提供生物分子和可控自由基聚合引发剂，其中为每个反应室独立地选择所述生物分子的身份、所述生物分子的浓度、所述可控自由基聚合引发剂的身份和所述可控自由基聚合引发剂的浓度；以及(b)将所述多个反应室维持在适合于形成多个生物分子-引发剂缀合物的条件下。可以在反应室内将这些生物分子与引发剂混合以形成均匀溶液，这可以改善产物产率或反应动力学。这种均匀混合还确保了在生物分子表面上可以实现引发剂的特定所需密度。生物分子可以溶解在缓冲溶液中或者可逆地固定在反应室中，例如，可逆地固定在珠上。同时合成多个生物分子-引发剂缀合物的方法还可以包括(c)同时纯化多个生物分子-引发剂缀合物中的每个生物分子-引发剂缀合物；以及任选地(d)评价纯化的生物分子-引发剂缀合物的一个或多个性质。纯化步骤可以在评价一个或多个性质之前或之后进行。在一些实例中，在评价之前纯化生物分子-引发剂缀合物。可以不纯化而评价生物分子-引发剂缀合物的一个或多个性质。生物分子的不同程度的修饰可以通过改变反应条件实现，包括，例如，反应ph、反应温度、缓冲剂类型、添加剂(例如，甘油或丙二醇)、反应时间、生物分子的身份、生物分子的浓度、生物分子的当量、可控自由基聚合引发剂的身份、可控自由基聚合引发剂的浓度和可控自由基聚合引发剂的当量。可以针对多个反应室中的每个反应室独立地控制这些反应条件。在此阶段由引发剂修饰生物分子的程度控制在合成生物分子-聚合物缀合物的第二阶段中生物分子表面的最终聚合物覆盖率。可以用分光光度法监测反应进程。生物分子-引发剂缀合物反应的效率可以使用荧光胺测定来评估，其允许对生物分子上修饰的氨基基团进行定量。可以在利用生物分子-引发剂缀合物的模型反应中评估生物分子的活性，如酶活性。可以在将聚合物接枝到缀合物之前丢弃掉表现出显著降低活性的生物分子-引发剂缀合物。任选地，可以评估生物分子-引发剂缀合物的活性，并且仅将保留至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％原始生物分子活性的生物分子-引发剂缀合物在适合于形成多个生物分子-聚合物缀合物的可控自由基聚合条件下与单体进行反应。虽然有不同类型的可控自由基聚合引发剂可供选择，引发剂优选地包含用于与生物分子上的表面反应性氨基酸结合的官能团，如活性酯。示例性的活化酯包括n-羟基琥珀酰亚胺酯、羟基苯并三唑酯或1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑酯。在水溶液中，引发剂可以固定至生物分子表面上的一个或多个胺。这些引发剂可以包含在聚合反应中与单体反应的官能团，如卤代烷或链转移剂。链转移剂可以用于在聚合反应中降低分子量。链转移剂可表示为一般结构：其中z是芳基、烷基、取代的硫、取代的氧或取代的氮。任选地，z是芳基、杂芳基、烷基、取代的硫、取代的氧或取代的氮。链转移剂可以是在raft聚合过程中使用的任何适合的已知链转移剂。示例性的链转移剂包括硫代羰基硫醇化合物，如二硫酯、三硫代碳酸酯、二硫代碳酸酯和二硫代氨基甲酸酯。在一实例中，链转移剂是二硫代苯甲酸异丙苯酯。在另一实例中，链转移剂是1h-吡咯-1-二硫代甲酸氰甲基酯。在一些实施方案中，可控自由基聚合引发剂是式(i)化合物：其中：x是卤素或链转移剂；r1是h或烷基；r2是活性酯部分；以及n是从1至6的整数。任选地，x选自cl、br和f。r1可以选自h和c1-6烷基，如甲基、乙基、丙基和丁基。在一些实例中，r2连同其附接至的羰基形成活性酯部分，该活性酯部分选自n-羟基琥珀酰亚胺酯、羟基苯并三唑酯或1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑酯。在一些实例中，可控自由基聚合引发剂是式(ii)化合物：其中：x1是卤素或链转移剂；x2是烷基、芳基、卤素或链转移剂；x3是氢、卤素或烷基；r2是活性酯部分；以及n是从1至6的整数。任选地，x1和x2独立地选自cl、br和f。在一些实施方案中，x1选自cl、br和f，并且x2选自c1-6烷基、苯基、卤素和链转移剂。在一些实施方案中，x2选自甲基、苯基、卤素和链转移剂。x3可以选自氢、cl、br和f。在一些实施方案中，x3选自氢、卤素和c1-6烷基。在一些实例中，r2连同其附接至的羰基形成活性酯部分，该活性酯部分选自n-羟基琥珀酰亚胺酯、羟基苯并三唑酯或1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑酯。在一些实施方案中，x1是卤素或链转移剂；x2是甲基、苯基、卤素或链转移剂；x3是氢、卤素或c1-6烷基；r2是活性酯部分；并且n是从1至6的整数。在一实例中，可控自由基聚合引发剂是含atrp引发剂的nhs官能化酰胺，如n-2-溴-2-甲基丙酰基-β-丙氨酸n'-氧基琥珀酰亚胺酯：在另一实例中，可控自由基聚合引发剂是n-2-氯-丙酰基-β-丙氨酸n'-氧基琥珀酰亚胺酯：在一些实例中，r2选自：(n-氧基琥珀酰亚胺酯)；(硝基苯基酯)；(1-氧基苯并三唑酯)；(2-氧基-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪酯)；以及(五卤代苯基酯，其中x是f或cl)。生物分子-引发剂合成期间，引发剂与生物分子的量的比例在生物分子-聚合物缀合物的性质中起着重要作用。在利用“从……接枝”缀合技术时，使用较大量的引发剂可以导致生物分子表面的引发剂密度更高并且更好地控制合成缀合物的最终尺寸。在本文所述的一方面，生物分子-引发剂缀合物是式(iii)化合物：其中：z是生物分子；y是从1至100的整数；x1是卤素或链转移剂；x2是烷基、芳基、卤素或链转移剂；x3是氢、卤素或烷基；并且n是从1至6的整数。任选地，x1选自cl、br和f。x2和x3可以选自氢、甲基、cl、br和f。在一些实施方案中，x1选自cl、br和f并且x2和x3选自氢和甲基。在一些实施方案中，n是从2至3的整数，例如n是2。在一些实施方案中，x1选自cl和br，x2和x3选自氢和甲基，并且n是2。在一些实施方案中，z是蛋白质，如酶。在一些实施方案中，z是生物分子；y是从1至100的整数；x1卤素或链转移剂；x2是甲基、苯基、卤素或链转移剂；x3是氢、卤素或c1-6烷基；并且n是从1至6的整数。高通量系统可以用于快速筛选不同的反应条件和引发剂与生物分子比例，以优化不同生物分子-引发剂缀合物的合成。如不使用自动化系统，在系统地改变一个或多个变量的同时复制精确的反应条件既费时又困难。生物分子-聚合物缀合物高通量系统有效筛选生物分子-引发剂缀合物合成条件的能力还允许在聚合反应期间选择不同的单体，并“从”生物分子-引发剂缀合物“接枝”。使用不同单体类型的能力有利于预测聚合物缀合在合成功能性生物分子-聚合物缀合物中的功效。在一方面，本公开内容提供了筛选多个生物分子-聚合物缀合物的方法，该方法包括(a)向多个反应室中的每个反应室提供生物分子-引发剂缀合物、单体和催化剂；(b)将所述多个反应室维持在适合于形成多个生物分子-聚合物缀合物的可控自由基聚合条件下；(c)同时纯化所述多个生物分子-聚合物缀合物中的每个生物分子-聚合物缀合物；以及(d)评价纯化的生物分子-聚合物缀合物的一个或多个性质。纯化步骤可以在评价一个或多个性质之前或之后进行。优选地，在评价之前纯化生物分子-引发剂缀合物。单体聚合到生物分子-引发剂缀合物是赋予最终生物分子-聚合物缀合物新的独特性质的重要步骤。生物分子的不同程度的修饰可以通过改变反应条件实现，包括，例如，反应ph、反应温度、缓冲剂类型、添加剂(例如，甘油或丙二醇)、反应时间、生物分子的身份、生物分子的浓度、生物分子的当量、单体的身份、单体的浓度、单体的当量、催化剂的身份、催化剂的浓度、催化剂的当量、光照射强度和光照射持续时间。可以针对多个反应室中的每个反应室独立地控制这些反应条件。如以上所讨论的，利用“从……接枝”聚合技术用于将聚合物附接至生物分子允许更好地控制最终生物分子-聚合物缀合物的性质。使用此技术，生物分子-引发剂缀合物与选择的单体在可控自由基聚合反应，如原子转移自由基聚合(atrp)或可逆加成-断裂链转移(raft)中进行反应，以在固定有引发剂的每个活性位点上生长聚合物链。在实施任何本文所述的方法中，可控自由基聚合条件可以包括atrp或raft聚合过程。如果atrp是选择的聚合过程，则引发剂通常包含卤素(例如，式(i)、(ii)或(iii)的化合物中的x、x1、x2和/或x3中的一个或多个是卤素)。如果raft是选择的过程，则引发剂通常包含链转移剂(例如，式(i)、(ii)或(iii)的化合物中的x、x1和/或x2中的一个或多个是链转移剂)。所得生物分子-聚合物缀合物优选为具有典型应用所需性质的生物活性分子。优选地，生物分子-聚合物缀合物相对于天然生物分子保留其原始功能或活性，或保留原始功能或活性的一部分。聚合物可以被设计用于特定地改变生物分子的性质，如提高溶解度、增加在特定生物环境中的保留、改变ph耐受性或者增加特定条件下生物分子的稳定性。许多类型的聚合物可以附接至生物分子，包括水溶性、两性离子型、温度或ph响应性的聚合物。例如，聚乙二醇(peg)聚合物与生物分子的附接称作peg化，可以通过增加缀合物尺寸来帮助基于蛋白质的治疗剂逃避免疫系统，以减慢从体内的清除。然而，通过peg化几乎没有增加额外的特定功能性。相比之下，选择诸如聚丙烯酸酯等聚合物可以赋予所得缀合物新的功能性。与蛋白质缀合的丙烯酸酯聚合物不仅增加缀合物的尺寸，还影响所得缀合物的溶解度和活性的ph依赖性。刺激响应性单体，如(甲基)丙烯酸酯或(甲基)丙烯酰胺，可以用于修饰感兴趣的生物分子，使得所得缀合物将表现出所需的性质，并且重要地，将以其在相关微环境中设计的方式起作用。刺激响应性单体的一个实例是pdmaema。pdmaema在其pka以下和以上表现出在超亲水特性与疏水特性之间的相转移。当pdmaema的叔胺基在pka以下质子化并水合时，pdmaema的链在水溶液中膨胀。相比之下，该聚合物链在pka以上通过胺基团的去质子化和脱水而收缩。在其lcst以上和以下，pdmaema也存在构象变化。选择要包含在缀合物体系中的单体dmaema对合成的最终缀合物的固有性质有很大影响。示例性的刺激响应性单体包括3-(二甲氨基)-1-丙胺、n-[3-(二甲氨基)丙基]丙烯酰胺和2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯。虽然使用不同的聚合物类型在生物分子-聚合物缀合物中赋予不同的功能性，但是这些性质源于可用于聚合的单体的不同类型。用于生物分子-聚合物缀合物合成的四种主要的单体类型是不带电荷的、两性离子型、阳离子型和阴离子型的。使用高通量系统可以在相同的合成过程中选择多种类型的单体，并且可以在最终生物分子-聚合物缀合物中产生独特的功能性。除不同的固有单体功能性以外，高通量系统还可以控制用于缀合物合成的单体的不同比例、浓度和类型。例如，可以在两种或三种不同单体——a、b和c——之间连续地对聚合增长进行循环，产生包括有重复的a-b-c-a-b-c单元的单一聚合物结构。替代地，可以在同一生物分子表面上生长三种不同的聚合物，分别仅由a、b和c单元组成，以给予缀合物不同的性质。本文所述的自动化高通量系统的使用对反应条件给予精细控制，使得可以在对所用单体的顺序以及各步骤的单体浓度进行高精度控制的情况下开始和/或停止聚合反应。对反应参数的这种扩展的选择和控制允许了从生物分子的表面生长的共聚物和嵌段共聚物的使用，并扩展了可以并入最终缀合物结构中的可能的功能性。氧气去除本文所述的高通量系统和方法还可以包括在单体聚合到生物分子-引发剂缀合物期间从多个反应室中的每个反应室除去氧气。催化活性物类，特别是用于聚合反应的催化活性物类，在氧气的存在下可能会失活，因此从反应室除去氧气可以提高在单体聚合至生物分子-聚合物缀合物期间的反应产率或催化效率。在一方面，本公开内容提供了筛选多个生物分子-聚合物缀合物的方法，该方法包括(a)(i)在多个反应室中的每个反应室中将生物分子-引发剂缀合物与单体在缓冲剂中合并，从而形成多个混合物；(a)(ii)从多个混合物除去氧气；以及(a)(iii)在脱氧的混合物中生成活性催化剂物类。在一些实施方案中，所述方法还包括(b)将所述多个反应室维持在适合于形成多个生物分子-聚合物缀合物的可控自由基聚合条件下；(c)评价所述生物分子-聚合物缀合物的一个或多个性质；以及(d)同时纯化所述多个生物分子-聚合物缀合物中的每个生物分子-聚合物缀合物。可以将多个反应室维持在封闭的系统或手套箱中以减少氧阻聚，或者在氧气的存在下使用耐氧的方法(例如，其中聚合催化剂在氧气的存在下保持催化活性的方法)。可以通过酶催化反应促进氧气的去除，其中所述反应包含选自葡萄糖氧化酶、胆红素氧化酶、邻苯二酚双加氧酶和萤光素酶的一种或多种酶。本文所述的聚合反应可以任选地在非惰性环境中通过光照射诱导。可以用uv、紫光或蓝光照射多个反应室以引发聚合。优选地，可以用对生物分子非破坏性的紫或蓝光照射多个反应室。光诱导聚合进一步扩展了可用于聚合的潜在单体和催化剂类型，并为生物分子-聚合物缀合物提供了更广泛的各种起始材料。另外，光诱导聚合可能对氧气是耐受性的。在本发明的高通量系统和方法中，可以控制诸如光强度和持续时间等参数，任选地单独控制多个反应室中的每个反应室。光诱导聚合反应可以在各种反应介质中进行而无需使用脱氧酶，反应介质包括水和缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(pbs)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、2-(n-吗啉基)乙磺酸半钠盐(mes)或磷酸盐缓冲液)。hepes缓冲液包含叔胺基基团，该叔胺基基团有利于在光的存在下将cuii还原为cui，这可能导致光诱导聚合反应的加速。在一方面，本公开内容提供了合成多个生物分子-聚合物缀合物的方法，所述方法包括(a)向多个反应室中的每个反应室提供生物分子-引发剂缀合物、单体、催化剂和缓冲剂；(b)通过在包含氧气的环境气氛下使所述多个反应室经受光照射来诱导可控自由基聚合，从而形成多个生物分子-聚合物缀合物；以及(c)同时纯化所述多个生物分子-聚合物缀合物中的每个生物分子-聚合物缀合物。所述方法还可以包括(d)评价纯化的生物分子-聚合物缀合物相对于天然生物分子的活性。优选地，纯化的生物分子-聚合物缀合物保持天然生物分子活性的至少100％，如至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％或至少170％。在一些实例中，纯化的生物分子-聚合物缀合物表现出一种或多种性质，这些性质增加了在应激条件下缀合物相对于天然生物分子的活性。如实施例中所示，所述合成多个生物分子-聚合物缀合物的方法是耐氧的并且可以无需脱氧而进行，例如不进行脱气或不添加脱氧酶。任选地，所述提供还包括添加三甲胺(tea)。引发剂可以是hoebib、ibbr或br。在一些实例中，缓冲剂选自水、pbs和hepes。可控自由基聚合，如atrp，通常使用紫光或蓝光诱导，任选地使用蓝或紫led作为光源，或者通过添加还原剂诱导。合适的催化剂包括铜基催化剂如cubr2，任选地具有配体如me6tren或tpma。在一些实例中，单体选自oeoma、dmapaam、dmaema、pnipaam、qnaam、tris-aam、dmaam、ampsa、amp、aam、sbaam和heaam。可以在任何合适的温度如1-8℃下完成光照射。所述方法还可以包括(b1)将所述多个反应室维持在特定的温度范围下，如1-8℃。优选地，将所述多个反应室维持在大约4℃下。监测、评价和筛选利用自动化合成系统的主要优点是集成了原位反应监测系统以评估反应进程和/或合成材料的纯度。这些随着反应进行而测试质量的方法的通用术语是过程分析技术(pat)。通常用于药物制造系统中，这些是用于评估最终产物的质量的自动化和集成的技术，范围从有机合成到光谱和色谱系统。本公开内容的pat方法通常包括数据分析、过程分析工具、过程监测和连续反馈。用于各个步骤的实时分析的方法可以包括用于反应分析的ftir光谱法；用于测量产物均匀性的nir光谱法；以及用于反应分析和产物鉴定的hplc、gc、nmr光谱法和ms。这些技术可以应用于生物分子-聚合物缀合物的合成，其中特别感兴趣的是引发剂合成、引发剂与生物分子的附接和反应进程的追踪，包括在生物分子-聚合物缀合物的合成期间的单体浓度。例如，质子nmr可以用于转化，并且分子量和分散度可以通过thfgpc测量。生物分子-聚合物缀合物的凝胶电泳可以揭示反应混合物中未缀合物的生物分子的量以评估反应效率，并且可以进一步用于评估生物分子-聚合物缀合物的尺寸。pat技术也可以用于材料的纯化。缀合物的纯化通常包括增加生物分子-引发剂或生物分子-聚合物缀合物相对于不需要的副产物的数量。本文所述的纯化的一方面包括同时从多个反应混合物分离多个生物缀合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使包含多个生物缀合物的多个反应混合物同时穿过多个超滤膜，其中所述生物缀合物保留在所述膜上，其中所述生物缀合物包括缀合至可控自由基聚合引发剂的生物分子或者缀合至合成聚合物的生物分子，并且其中所述多个反应混合物中的每个反应混合物被独立地纯化。超滤可以是真空辅助的。可以通过在多个反应室中利用膜而将这些纯化步骤和方法并入到高通量自动化系统中。膜可以是超滤膜，该超滤膜允许诸如水等小分子穿过，但保留诸如蛋白质或其他生物分子等较大分子。这给予了分别从生物分子-引发剂缀合物和生物分子-聚合物缀合物中洗去未附接的引发剂或单体的优点。使用自动化系统的额外优点是每个反应室可以是单独可寻址的，并且超滤膜可以被配置用于诸如在纯化期间通过膜连续输送流体。生物缀合物的纯化可以通过将生物分子或生物分子-引发剂缀合物附接或固定到反应室来辅助。使流体流过具有固定的生物分子或生物分子-引发剂缀合物的室可能有助于纯化，因为过量的引发剂或单体将从室中滤出，而仅保留生物分子-引发剂缀合物或生物分子-聚合物缀合物。固定方法随固定表面、生物分子性质以及最终生物分子-聚合物缀合物的所需功能而有很大变化。可以将蛋白质和其他生物分子通过几种不同机制之一附接到表面上。例如，生物分子可以通过被动吸附来附接，其中附接是通过生物分子与表面之间的疏水相互作用或疏水/离子相互作用来进行的。共价固定化可以用于将生物分子固定到表面。例如，可以使用基于胺的共价连接，利用生物分子表面的赖氨酸残基。可以在生物分子-聚合物缀合物的合成期间采用这些固定技术中的任何一种，并且可以发现特定的固定技术有助于加速生物分子-引发剂和/或生物分子-聚合物缀合物的纯化或分离。可以评价和/或筛选生物分子-引发剂和/或生物分子-聚合物缀合物的一个或多个性质。在一些实施方案中，在纯化缀合物之后进行评价和/或筛选，不过可以不需要纯化。利用高通量系统，反应室可以被配置成使得能够通过分光光度计准确地测量反应混合物或纯化缀合物的吸光度或荧光。其他评价步骤可以包括紫外可见光谱法、荧光光谱法、近红外光谱法和尺寸评估中的一个或多个。可以首先在理想工作条件下，然后任选地在诸如高温、极端ph或各种溶剂混合物等应激条件下，对生物分子-引发剂和/或生物分子-聚合物缀合物的活性如酶活性进行评估，以鉴定相对于天然生物分子表现出改善的活性和/或稳定性的缀合物。这些不同的评价技术帮助鉴定和评估根据本文所述的方法合成的缀合物的所需性质，如生物分子表面上的引发剂密度、催化活性、在特定介质和/或条件中的稳定性以及生物分子修饰和聚合的程度。使用高通量系统的优点在于以下事实，即可以容易地分离显示出被认为对特定应用有利的一种或多种性质的缀合物，并且可以探索类似的合成空间以用于生物分子-引发剂和生物分子-聚合物缀合物优化。筛选聚合反应的最佳条件尤其困难，因为这些反应通常高度依赖于反应动力学。因此，在相似条件下不同聚合参数的快速和可比较的筛选对于评价许多不同的聚合条件是有用的。平行地快速筛选条件的能力允许直接比较不同的反应条件，并有助于消除通常会影响动力学实验结果的操作错误。自动化高通量系统允许快速集中于一组特别稳健的反应条件，并产生具有特定功能的生物分子-引发剂或生物分子-聚合物缀合物，同时消除产生对于给定应用不稳定或不适合的缀合物的反应条件。小的反应条件变化可能产生功能性迥异的缀合物。因此，平行筛选反应条件是生物分子-引发剂和生物分子-聚合物缀合物生产中可用的合成工具的重要补充。平行筛选是探索反应条件和评估缀合物功能的极其有用的工具，而自动化反馈回路对于生成新的合成条件和制备生物分子-引发剂和生物分子-聚合物缀合物的库也是有用的。在合成初始缀合物之后，可以针对特定功能性狭义地定义这些库。通过筛选这些初始结果并鉴定感兴趣有用性质的命中，可以探索较小范围的合成空间，并且可以丢弃不会产生可用缀合物的条件。这种反馈回路是快速平行筛选条件的不可或缺的部分，这些条件最初可能并不明显。另外，可以包括自学习算法的这种反馈回路系统可以重复几代合成优化，用于针对给定应用对生物分子-聚合物缀合物进行帕累托优化。实施例实施例1：可以使用“从……接枝”atrp，用聚合物修饰治疗性抗体，如抗tnf。抗体-聚合物缀合物在无氧环境中通过靶向方式合成，并与反应物分离。当前没有方法可以在同一反应体系中生成修饰密度、聚合物长度和聚合物化学的所有可能变体以用于同时筛选功效。在机器人式atrp高通量系统中，抗体同时与成百上千个变体反应，这些变体在定制设计的高通量蛋白质聚合物合成反应器中系统地探测修饰的合成空间。该系统需要反应物与产物同时分离。传统上，每次分离在两个漫长的渗析步骤中需要数升的透析流体。定制设计的蛋白质-聚合物缀合物高通量纯化器在同时原位纯化期间改为使用数毫升的流体。使化学过程小型化和多路化的另一个挑战围绕从系统中除去所有氧气的当前需求。在有机溶剂和真空系统中的高通量atrp合成通常与在生物学耐受条件下的蛋白质atrp不相容。本实施例中使用了从微型多路反应器中除去氧气的先进方法。特别地，采用了酶促除氧化学法和耐氧atrp催化剂。在同时生成抗体的100-10,000个变体(这些变体的引发剂类型、聚合物长度和密度以及聚合物类型都不同)之后，使用高通量筛选来鉴定最具生物活性的变体。可以用自学习算法对高通量装置进行编程，该算法将获取第一代结果并选择第二代优化的缀合物。例如，该系统可能发现，带正电荷的缀合物是最好的，并且通过利用来自筛选的实验数据和所有先前筛选的信息来加深和微调在第一步中产生的缀合物组，同时生成另外的1,000-10,000个变体。该循环可以继续多代，其中自学习算法在每个阶段驱动精细化。最终，在帕累托优化之后，选择不能进一步改善的缀合物。实施例2：本实施例中，预测了使用基于聚合物的蛋白质工程与阳离子聚合物pqa对胰凝乳蛋白酶(ct)表面电荷的逆转。其他阳离子合成聚合物可以用于输送基于rna核苷酸的疗法以及使药物能够跨细胞膜运输。据显示，通过定向诱变或合成化学来修饰酶表面电荷对蛋白质功能造成显著影响。特别地，据显示，修饰蛋白质表面电荷影响了酶在诸如离子液体等非水溶剂中的稳定性和活性谱，并改变酶活性的ph谱。在本文中，预测“从……接枝”atrp在胰凝乳蛋白酶核心周围形成高密度阳离子壳。外源性胰凝乳蛋白酶的给药被用于治疗胰腺外分泌不足，但是由于未修饰的胰凝乳蛋白酶在胃酸中的降解导致稳定性低，需要更多的给药。包围胰凝乳蛋白酶的高密度阳离子pqa壳将增加稳定性，改变胰凝乳蛋白酶活性的ph谱，并影响抑制剂的结合。合成了四种或更多不同分子量的胰凝乳蛋白酶-pqa缀合物以研究基于聚合物的蛋白质工程化表面电荷修饰对酶动力学、稳定性和抑制剂亲和力的影响。向乙腈中添加2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯和溴乙烷并搅拌过夜。添加二乙醚后，滤出结晶的qa单体，用二乙醚洗涤并干燥。在继续进行之前，可以采集动态光散射数据以评估粒度。为了确保qa单体自ct-atrp引发剂缀合物的“从……接枝”atrp，将qa单体和ct-引发剂缀合物的溶液添加到hmteta和溴化亚铜(i)在去离子水中的脱氧催化剂溶液中，密封并搅拌。通过渗析将ct-pqa缀合物分离，并冻干。在酸水解之后将裂解的聚合物分离，并冻干。通过gpc测量裂解的聚合物的分子量。这种“从……接枝”合成可以在具有多个反应室的单板或多板系统中发生，并通过自动化机器人式系统控制。生物分子可以固定在反应室内，并且可以从系统除去氧气。这种高通量系统可以同时筛选许多不同的合成条件并生成所提出的缀合物的成百上千个变体。本实施例中变化的可能反应参数包括引发剂的类型、阳离子聚合物的类型以及所述聚合物的长度和密度。高通量筛选将有助于鉴定具有最有前景的功能性的缀合物，在此情况下该功能性为高稳定性和快速酶动力学。可以将自学习算法编程到此高通量系统中，以计算优化的合成策略，用于未来几代的合成缀合物。专有算法分析来自第一代合成缀合物的结果，选择特定特征或功能性——例如，产生更高缀合物稳定性的特定长度的聚合物或产生快速酶动力学的特定聚合物密度——然后使用该信息生成新的参数以引入第二代合成条件。在多次迭代的合成精细化和帕累托优化之后，获得用于特定应用的最佳生物分子-聚合物缀合物。实施例3：显示出温度响应性的两种聚合物为pnipam和pdmaps，尽管它们响应于温度的方式截然不同。pnipam表现出lcst行为，其中聚合物在32℃以上经历构形上的可逆变化，增加其疏水性并变得与水不混溶。相同的可逆变化见于pdmaps，除了该聚合物在ucst以下是不混溶的。pdmaps的ucst表现出对聚合物链长度和溶液离子强度的强烈依赖性，而pnipam的lcst变化较小，但仍受几个因素影响，如链支化的程度和分子量。使用温度作为酶功能变化的触发因素能够可控地操纵ct-pdmaps和ct-pnipam生物缀合物的动力学和稳定性。选择pnipam和pdmaps两者以便检验在高于和低于室温的刺激响应性温度下相对酶活性和稳定性的变化。ucst和lcst生物缀合物的对比温度响应性行为提供了一种有吸引力的方法来检查聚合物链在不同温度下如何收缩可以影响酶生物活性、稳定性和底物亲和力。将n-2-溴-2-甲基丙酰基-β-丙氨酸n'-氧基琥珀酰亚胺酯添加到ct，溶解在磷酸钠缓冲液中并冻干以提供ct-引发剂复合物。为了合成ct-pdmaps缀合物，将ct-引发剂复合物和dmaps溶解在磷酸钠缓冲液中。在分开的烧瓶中溶解hmteta和cu(i)br并添加到dmaps/ct-引发剂复合物溶液中。最后，通过渗析将溶液纯化，并冻干。对于ct-pnipam合成，将ct-引发剂缀合物和nipam溶解在去离子水中。在分开的烧瓶中溶解me6tren和cu(i)br并添加到ct-pnipam溶液中。最后，使用渗析将溶液纯化，并冻干。使用酸水解将pdmps和pnipam二者从ct表面裂解。将ct-pdmaps和ct-pnipam缀合物温育、分离并冻干。使用gpc确定聚合物分子量。将ct-pdmaps和ct-pnipam溶解在磷酸缓冲液中，将ct-pnipam样品从20℃加热到35℃并将ct-pdmaps样品从30℃冷却到5℃。测量吸光度，并根据温度-吸光度曲线上的拐点计算lcst/ucst温度。这种合成和温度响应性测试在具有多个反应室的单板或多板系统中发生，并通过自动化机器人式系统控制。生物分子可以固定在反应室内，并且可以从系统除去氧气。这种高通量系统可以同时筛选许多不同的合成条件并生成所提出的缀合物的成百上千个变体。变化的可能反应参数包括引发剂的类型、聚合物的类型以及选择的聚合物的长度和密度。高通量筛选有助于鉴定具有最有前景的功能性的缀合物，该功能性是例如在特定温度下的响应或者高酶活性。可以将自学习算法编程到高通量系统中，以计算优化的合成策略，用于未来几代的合成缀合物。算法可以分析来自第一代合成缀合物的结果，选择特定特征或功能性——例如，在特定温度下是响应性的聚合物——然后使用该信息生成新的参数以引入第二代合成条件。在多次迭代的合成精细化和帕累托优化之后，应该获得用于此特定应用的最佳生物分子-聚合物缀合物。实施例4：通过对生物分子进行逐步功能化、纯化和表征循环来实现高通量组合式的生物分子-聚合物缀合物合成和表征(图2a和图2b)。在第一阶段，将各种聚合引发部分缀合至生物分子并测试缀合对生物分子性能的影响。生物分子溶解在缓冲溶液中，或者可逆地固定在珠上。通过改变反应条件来实现不同程度的修饰，从而控制生物分子表面的最终聚合物覆盖率。完成后，通过高通量真空辅助过滤(超滤)或其他蛋白质纯化方法将合成的生物分子-引发剂缀合物纯化。在模型反应中分析atrp引发剂修饰的酶的酶活性，其中可以通过分光光度法检测反应进程。将化学修饰的生物分子-引发剂缀合物的库移至第二阶段，其中选择的聚合物直接从生物分子接枝(图3a和3b)。高通量聚合可以在封闭的小瓶和/或手套箱中进行，以减少氧阻聚(对于自由基聚合)，或者使用耐氧方法。光照射可以诱导聚合(光atrp)，并且可以在非惰性环境下在96孔板中成功地进行。通过对96孔板中的生物分子非破坏性的紫光或蓝光来诱导光atrp(图3a和3b)。该方法是耐氧的，并且可以有效地应用于96孔板中的聚合。完成聚合后，将生物分子-聚合物缀合物从聚合催化剂和其他试剂中纯化。可以首先在理性的酶工作条件下，然后在应激条件下(如在高温或低ph下温育)对纯化样品的酶活性进行评估，以鉴定表现出改善性质的生物分子-聚合物缀合物。该组合式光atrp系统允许仅用100个板快速筛选近10,000个变体。实施例5：通过添加还原剂、电流或光照射来诱导atrp。这些方法中的每个都原位生成活性催化物类以引发聚合。图4中图示的设置用于进行光介导的atrp(光atrp)过程，其中具有聚合溶液的96孔板放置在光源的上方。如果直接放置在光源上，聚合溶液可能被加热，这可能不利地影响溶液中生物分子的稳定性。因此，可以通过放置在光源下方的风扇提供任选的冷却。如果需要额外的冷却，风扇可以放置在冷却剂的上方以便吹出较冷的气流从而更有效地冷却。一组实验表明，通过光atrp制备聚合物不需要聚合混合物的脱氧(表1)。利用水中的模型聚合反应研究氧对光atrp的影响：聚合在通过氩气吹扫脱氧的溶液和非脱氧溶液中进行。氧气存在下的聚合(反应a，表1)经历了诱导期，但最终转化率几乎与脱氧溶液中的聚合(反应c，表1)一样高。图5图示了两个反应的转化率随时间的增长。分子量的线性增长(图5)和狭窄的分子量分布(<1.4，图6)指示对聚合的高水平控制。表1：通过紫光诱导的96孔板光atrp：条件和结果m-单体oeoma、i-引发剂hoebib、[hoebib]＝2mm、[oeoma500]＝432mm(20vol.％)、水、x–br、l–me6tren。通过质子nmr测量转化率。通过thfgpc以普适标定测量分子量和分散度。表2：用蓝光照射的96孔板上的光atrp#m脱气溶剂时间,h转化率,％mnmw/mn1oeoma否h2o2881199701.452oeoma否pbs2951133301.17条件：[oeoma500]:[hoebib]:cubr2]:[tpma]＝216:1:3:12、[hoebib]＝2mm、[oeoma500]＝432mm(20vol.％)。通过质子nmr测量转化率。通过thfgpc以普适标定测量分子量和分散度。通过不同光波长的照射进行聚合，包括紫光(表1)和蓝光(表2)。光被输送到每个反应室中，同时可以针对各个室控制参数，如光强度和持续时间。将该耐氧的光atrp方法(表3，条目1-4)与在脱氧酶葡萄糖氧化酶(gox)存在下进行的光atrp(表3，条目5-7)进行比较。葡萄糖氧化酶在葡萄糖存在下消耗氧气，从而作为一种有效的除氧方法。在多种反应介质中未使用脱氧酶的情况下成功进行了光atrp，多种反应介质包括水和缓冲溶液如磷酸盐缓冲盐水(pbs)(表3，条目1-3)。根据反应介质，2小时后的反应转化率达到约40-100％。根据以下反应图式，在300mmhepes缓冲液的存在下检测到反应加速，该缓冲液包含在光存在下有益于将cuii还原为cui的叔氨基基团：在存在gox下的光atrp仅在pbs中更快，但是在水和hepes中达到相似的转化率(表3，条目5-7)。该组反应指示出，光atrp是通常不需要额外脱氧方法的耐氧方法。表3：脱气酶存在或不存在下进行的光atrp的比较。[hoebib]＝1mm、[oeoma500]＝432mm(20vol.％)、tea-三乙胺、l–tpma；光源-蓝光led；通过质子nmr测量转化率。已使用该方法成功地聚合了不同类型的单体，如(甲基)丙烯酸酯和(甲基)丙烯酰胺。例如，根据反应图式可以对n-[3-(二甲氨基)丙基]丙烯酰胺进行光聚合：向聚合溶液添加gox导致水或pbs作为反应介质的聚合更快(表4，条目1-2与条目4-5)，但是添加hepes导致2小时内的转化率>40％，甚至无需添加gox。表4：丙烯酰胺的光atrp。[hoebib]＝1mm；[dmapaam]＝1217mm(20vol.％)、x–tea、l–tpma；光源-蓝光led；通过质子nmr测量转化率。实施例6：还将实施例5中所述的高通量光atrp方法应用于生物分子-聚合物缀合物的合成，其中将引发剂附接至生物分子。向包含单体的溶液添加生物分子-引发剂缀合物并暴露于光以诱导光atrp。不同的反应室暴露于不同波长的光下持续不同的时长，并评估所得生物分子-聚合物缀合物的性质，如化学和热稳定性以及催化活性。将高通量系统用于使用不同单体多次重复该合成循环，作为优化最终生物分子-聚合物缀合物性质的方法。聚合不同类型的单体以产生不同范围的生物分子-聚合物缀合物。表5示出了如何通过光atrp同时制备胰凝乳蛋白酶(ct)的几种聚合物缀合物(图7)。改变单体类型和反应时间，制备了一组不同的胰凝乳蛋白酶-聚合物缀合物。残余活性的测量显示出，阳离子聚合物类型更有益于ct活性，其残余活性相比于天然ct(100％残余活性)增加至近170％。表5：通过耐氧的光atrp制备的胰凝乳蛋白酶-聚合物缀合物。[ct-(ibbr)6.2±0.2]＝8.7mg/ml、[m]＝432mm；蓝光led光atrp用于制备缀合物；通过质子nmr测量转化率。实施例7：本实施例描述了用atrp引发剂对酶的高通量修饰。表6示出了改变哪些参数来鉴定一组理想条件，以用于制备多种结构的附接有聚合部分的酶(本实施例中为ct-br)。图8图示了nhs-atrp引发剂可以预先制备或原位生成，并在不同条件下添加至酶。图9示出了酶中经修饰氨基基团的数量与制备的酶-引发剂(ct-br)的残余活性的关系。通过评价所有反应条件来选择一组理想的修饰条件，其中可以实现广泛的修饰，同时最大保留残余酶活性。例如，表7汇总了nhs-atrp引发剂附接条件的选择，其中经修饰酶氨基基团的数量在1.6至10.2的范围内并且酶残余活性不降低至70％以下。这些修饰酶样品可以进一步被用于制备如实施例6中的酶-聚合物缀合物。表6：胰凝乳蛋白酶-br(ct-br)的制备中可变的参数表7：atrp引发剂固定条件的选择#附接的br-部分的数量残余活性,％条件11.6±0.387±7pbs,ph～7.3,r0.2523.7±0.3132±6naphos,ph～6,r0.2534.9±0.3105±8naphos,ph～6,r0.546.7±1.089±5mes,ph～6,r0.559.0±0.383±3mes,ph～6,r1610.2±0.172±7mes,ph～6,r6实施例8：本实施例说明，atrp引发剂附接筛选是鉴定制备具有不同量atrp引发剂且保留活性如酶活性的生物分子-引发剂缀合物的最良好条件的重要步骤。用另一种酶(脂肪酶，而不是胰凝乳蛋白酶)进行这组实验以显示该方法的广泛适用性。图10描绘了反应工作流程，其中在atrp引发剂附接反应之后通过荧光胺测定分析所进行的反应的效率。该测定允许定量酶中的经修饰氨基基团。图11示出，反应ph和atrp引发剂活化酯的当量数都影响经修饰氨基基团的数量。本实施例中，低当量的atrp引发剂活化酯(低于1)不会导致有效的反应，并且需要较高当量以实现该脂肪酶中氨基基团的修饰。修饰的最高效率在ph～7时实现(图11)，并且修饰磷脂酶的最高保留活性在ph～8时实现(图12)。在下一组条件中，酶的浓度连同atrp引发剂活化酯的当量数改变(图13)。图13和14证明，在浓度为7.5mg/ml时实现引发剂附接控制的最高水平和酶的最高保留活性。因此，显然阶段1(图2a和图2b)中反应条件的筛选对于鉴定atrp引发剂附接至酶的数量和条件如何影响酶的残余活性是重要的。实施例9：据显示，选择的96孔板形式非常适合于进行聚合反应，导致生物分子-聚合物缀合物的形成。图15示出，高通量生物缀合可以用于筛选所需生物分子-聚合物缀合物的聚合条件。在本实施例中，在聚合催化体系(溴化铜和三乙胺(tea))的25种不同组合下，聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)从脂肪酶接枝。如图15b中所示，在较高的溴化铜(ii)(7-10mm)和tea浓度(120-240mm)下产生较高量的溴化亚铜(i)，这由孔的更深颜色指示。合成的生物分子-聚合物缀合物的凝胶电泳分析(图16)也支持：与较高量溴化亚铜(i)的反应导致形成较大的生物分子-聚合物缀合物，如缺乏初始材料(酶)所证明的。图17描绘了合成的生物分子-聚合物缀合物的残余活性。实施例10：在本实施例中，在96孔板中使用光atrp过程将不同组的聚合物(图18)同时从附接有不同量atrp引发剂的脂肪酶接枝。表8和表9描述了脂肪酶-引发剂的类型、聚合物类型、聚合条件以及生物分子-聚合物缀合物的尺寸和活性。图19示出了凝胶电泳测定中的移动，指示成功的聚合。进一步测定了合成的生物分子-聚合物缀合物的残余活性(表8和9)，证明大多数样品保留酶活性。进一步测试几个样品在大豆油与甲醇的酯交换反应中的性能。这种类型的反应模拟了在较高温度和存在有机溶剂的情况下的更苛刻工业条件，其可用于进一步选择(图20)。该测试显示，脂肪酶-(qnaam)6(qnaam是(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵)优于天然脂肪酶和其他生物分子-聚合物缀合物，在反应条件(温度、有机溶剂)下显示出改善的稳定化。表8：附接有2.7个atrp引发剂的脂肪酶-聚合物生物缀合物。反应条件：1hr、蓝光led、4℃、hepes；m/i/cubr2/l/tea＝1333/1/10/10/200#单体类型半径(nm)活性(umole/min/mg)1无5.121.22qnaam6.913.53tris-aam6.114.14dmaam3.5175dmapaam7.515.86ampsa42.12.27amp5.130.38aam3.829.49sbaam3.127.710heaam3.731.1表9：附接有6个atrp引发剂的脂肪酶-聚合物生物缀合物。反应条件：1hr、蓝光led、4℃、hepes；m/i/cubr2/l/tea＝1333/1/10/10/200尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报告了在具体实施例中阐述的数值。然而，任何数值固有地包含误差，该误差必然由在其基础的相应测试测量中发现的标准偏差产生。此外，当本文中给出数值范围时，这些范围包括所述范围的端点(即，可以使用端点)。当本文使用重量百分比时，所报告的数值是相对于总重量。此外，应当理解，本文所述的任何数值范围均旨在包括其中包含的所有子范围。例如，“1至10”的范围旨在包括在所列举的最小值1与所列举的最大值10之间(并且包括1到10)的所有子范围，即，具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值。冠词“一”和“一个”在本文中用于指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。例如，“元件”是指一个元件或多于一个元件。虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方式，但是对于本领域技术人员容易理解的是，这些实施方式仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文所述的本发明实施方式的各种替代方案均可用于实施本发明。以下权利要求书旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。当前第1页12