检测FGD1基因突变的引物和方法与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变的引物，采用普通pcr结合sanger测序技术，可用于快速检测fgd1位点的突变情况。

背景技术：

aarskog综合征(aarskogsyndrome，aas)是一种罕见的遗传性面-指-生殖器异常综合征，主要临床表现为身材矮小、面部、指(趾)和生殖器形态改变，但程度各异，还可合并其他多种异常，目前诊断必备的表型尚不明确。aas是由位于xp11.21的fgd1基因突变所致的一种x连锁隐性遗传性疾病。

fgd1基因(fyve，rhogefandphdomaincontainingl,nc_000023)共含有18个外显子，能够编码形成一种鸟嘌呤核苷酸转化因子(guaninenucleotideexchangefactor,gef)。目前已经发现有多种fgd1的突变可导致aas的发生，包括第4，6，9-12及17号外显子区的缺失突变，第3和7号外显子区的插入突变，第3-8及15号外显子区的错义突变，以及在7、8、11号内含子剪切位点上的突变等。fgd1基因的突变可导致其编码的gef的结构域发生空间结构改变，从而干扰了fgd1/cdc42正常的信号传递系统，导致aas的发生。

aas患者可出现身材矮小、智力缺陷及生育障碍等多种复杂、严重的临床症状，严重威胁着患者的身体健康和生活质量。通过检测fgd1基因突变情况，将有望据此对高危的可疑人群(如有相关家族史，或有放射性辐射接触史等)开展早期筛查和干预，从而将有利于对该病进行基因筛查、产前诊断、植入前遗传学分析、靶位治疗和新药研发等，最终对该病的早期预防与诊断、优生与优育等产生重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变的引物，采用pcr结合sanger测序技术，可用于快速检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点的突变情况。所述检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变情况的引物，包括：扩增fgd1659+27t>c和482-113c>t位点5号外显子的引物，其碱基序列为：

fgd1-exon-3-f：tgtaaaacgacggccagtgcctcctgagttcaagcaat

fgd1-exon-3-r：aacagctatgaccatgtctgaggtgggtggtggac。

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg

本发明提供了检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提血液中的基因组dna；

(2)用pcr扩增步骤1中提取的dna；

(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；

(4)对测序结果进行判断，确定fgd1659+27t>c和482-113c>t位点是否发生突变。

本发明还提供了一种检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变的试剂盒，包括

(i)血液dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr扩增反应液；

(iii)测序体系试剂。

本发明还提供了一种检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系pcr扩增反应液、测序体系反应液，所述检测体系pcr扩增反应液包括至少fgd1-exon-3-f和fgd1-exon-3-r这对扩增引物，所述测序体系反应液包括m13f和m13r这对测序引物。

进一步地，所述检测体系pcr扩增反应液还包括2×pcrbuffer、dntps和kodfxdnapolymerase。

进一步地，所述测序体系反应液还包括edta、无水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。

有益效果：本发明设计了扩增fgd1659+27t>c和482-113c>t位点的引物。采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用sanger测序技术检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变的方法，可以准确将fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变类型检测出来，相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度。荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计2个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为20例临床样本引物扩增后的琼脂糖凝胶电泳图，m为markerdl2000，1-20为20例血液样本，经验证，引物扩增有效，且目的条带清晰，产物大小正确。

图2为样本3fgd1659+27t位点的测序截图，表明为阴性样本。

图3为样本1fgd1659+27t位点的测序截图，表明为阳性样本。

图4为样本3fgd1482-113c位点的测序截图，表明为阴性样本。

图5为样本1fgd1482-113c位点的测序截图，表明为阳性样本。

具体实施方式

实施例1

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

一种检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变的引物和方法，该引物是针对扩增fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变所设计的特异性扩增引物，其碱基序列为：

fgd1-exon-3-f：tgtaaaacgacggccagtgcctcctgagttcaagcaat

fgd1-exon-3-r：aacagctatgaccatgtctgaggtgggtggtggac。

一种检测fgd1659+27t>c和482-113c>t位点突变的试剂盒，包括

(i)血液dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr反应液；

(iii)测序体系试剂；

(iv)阳性对照品和阴性对照品。

其中，血液dna抽提试剂可购自天根dna抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系pcr扩增反应液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；fgd1659+27t>c和482-113c>t位点上、下游引物(10μm)。

测序体系试剂包括：测序纯化液(exoi:0.6u，cip:1.2u)、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：m13f和m13r(3.2μm)。

实施例2

血液基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因组dna

1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。

2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。

6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份18μl分装：

x＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系pcr反应液中2μldna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：

pcr扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

fgd1-exon-3-f：tgtaaaacgacggccagtgcctcctgagttcaagcaat；

fgd1-exon-3-r：aacagctatgaccatgtctgaggtgggtggtggac。

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，35min，凝胶成像系统观察。

如图1所示，即为2例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。

(6)sanger测序：

取9pcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlcbl后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(abi3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与fgd1(nc_000023)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取20例临床样品，按实施例1和2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。样本加入检测体系pcr反应液中1μl，同时做阳性，阴性，空白对照各一份。电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。

测序后发现共有8例样本发生fgd1659+27t>c和482-113c>t突变，分别为样本1、2、6、10、11、12、13、18，两种突变在样本中同时发生，且全部为纯合突变。样本1(阳性样本)和样本3(阴性样本)的测序结果如图2-5所示。图2和图3为fgd1659+27t位点阴性和阳性样本的测序截图。图4和图5为fgd1482-113c位点阴性和阳性样本的测序截图。

序列表

<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司

<120>检测fgd1基因突变的引物和方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgtaaaacgacggccagtgcctcctgagttcaagcaat38

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tgtaaaacgacggccagt18

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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