一株酵母菌ZB412及其应用的制作方法

本发明涉及食品发酵
技术领域：
，尤其是一株适用于食醋、米醋生产的酵母菌(saccharomycesp.)，本发明还涉及所述酵母菌在食醋生产中的应用。
背景技术：
：目前，市场上食醋的生产主要分为传统固态发酵工艺和液态深层法发酵工艺，传统固态发酵出来的食醋风味独特，酸味柔和，但传统固态工艺具有劳动强度大、生产效率低、生产周期长等缺点，而液态深层法发酵工艺通过酵母菌和醋酸菌进行快速发酵后即获得食醋产品，具有产品稳定、沉淀较少、发酵周期短、机械化程度高和成本低等优点，成为制醋产业科学化、机械化与大型化的发展方向，然而与传统固态发酵工艺相比，液态深层法发酵工艺中由于工艺条件的限制，不利于有机酸、酯类、游离氨基酸等香气物质的生成，导致所发酵食醋存在风味不足、口感较差等问题，从而无法满足人们对食醋风味的需求。乙酸乙酯作为食醋中重要的香气成分，占食醋总酯含量的70％左右，其在缓冲食醋中各种有机酸、酮类和醛类的相互作用，维持食醋风味方面起到重要的作用。4-乙基愈创木酚(4-ethylguaiacol，简称4-eg)又名乙基愈创木酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、2-甲氧基-4-乙基苯酚，作为食醋中具有明显酱香香气的酚类物质，对产品起到呈香和助香作用，对醋的质量尤其重要。它可以赋予醋各种复杂的口感和味感特征。以上不同风味物质的相互作用使得醋的香味更加醇正。而液态深层发酵工艺基本上是在密闭的状态下进行的，几乎是纯种发酵，作为主要香气成分的乙酸乙酯主要由酒精酵母代谢产生，随着发酵体系中发酵产物醋酸的累积，对酒精酵母的活性产生进一步地抑制作用，严重制约了乙酸乙酯的生成，使得乙酸乙酯含量很难达到固态食醋的含量水平，且呈香物质的缺乏使得所生产出的食醋味道单调，闻起来酯香味严重不足，缺乏高质量食醋的绵酸性。酵母菌(saccharomycesp.)是发酵微生物中较为广泛分布的成员，通常能够在许多发酵食品中被发现。目前对于酵母菌对食醋中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯的含量提升未见报道。国内一些发明专利/专利申请报道了一些其它菌株能够产生4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯。例如发明专利申请号cn201510468068.7中公开了一株高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌及其应用，该菌株是从高温酒曲中分离、筛选所得，通过以高粱糖化液为培养基液态发酵生产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯，但该发明并非针对食醋风味的提升，不一定能够在食醋液态深层法发酵工艺中直接应用。中国发明专利号cn201510849370.7中公开了一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌及其应用，该菌株在22℃、静置的发酵条件下产乙酸乙酯量达到最大，发酵代谢产物仅含有乙酸乙酯和少量乙醇，该酵母菌株28℃以上产乙酸乙酯活性低，应用于食醋的生产发酵时需降低传统生产工艺的发酵温度，增加了生产能耗及生产成本。由于液态深层法发酵食醋工艺条件的限制，不利于有机酸、酯类、游离氨基酸等香气物质的生成，导致所发酵食醋存在风味不足、口感较差等问题，从而无法满足人们对食醋风味的需求。因此，在现有技术中没有一株能够直接应用在液态深层发酵制取食醋工艺中，进而提高食醋发酵阶段发酵产物中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯含量的安全菌，以安全可靠地提高食醋的风味品质。技术实现要素：基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能提高食醋发酵阶段发酵产物中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯含量的酵母菌，从而安全可靠地提高食醋的风味品质，并且发酵所得食醋酯香味突出，口感回甜度好。为了实现本发明的目的，本发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下实验方案:一株酵母菌(saccharomycesp.)zb412，已于2018年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为酵母菌(saccharomycesp.)zb412，保藏编号为gdmccno:60523，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。本发明提供的酵母菌zb412是由常压室温等离子体诱变(简称artp诱变)选育获得的。具体地，本发明所述的酵母菌zb412的诱变选育方法如下：以酵母菌zb118为出发菌株，首先使用artp诱变法对菌株进行诱变获得诱变菌株，然后使用含有0.4％三丁酸甘油酯的ypd固体培养基对诱变菌株进行筛选，筛选透明圈直径与菌落直径比值较大且菌体生长旺盛的诱变菌株即为产酯能力较强的菌株。本发明提供的酵母菌zb412具有以下特征，在ypd固体培养基上，28℃条件下培养2天，菌落呈奶酪状，乳白色，表面平滑，不透明，不反光，边缘整齐，圆形，菌落直径2～4mm。通常认为一株优秀的食醋生产用酵母菌菌种应具备较好的酒精发酵能力，同时所生成产物促进食醋风味的形成，还应具备一定的遗传稳定性，利于长期获得质量稳定的发酵食醋。本申请发明人通过长期生产实践和观察研究，结合实际食醋液态深层发酵生产过程所需菌种的特点，提供一株优良的食醋生产用菌株——酵母菌(saccharomycesp.)zb412，具备发酵阶段高产乙酸乙酯和4-乙基愈创木酚的特点，并且可以同时具备上述特点。将酵母菌zb412在ypd斜面培养基上连续传代10代，将第1代、第5代、第10代菌株在发酵培养基中进行发酵，检测发酵液中乙酸乙酯和4-乙基愈创木酚的含量，乙酸乙酯和4-乙基愈创木酚含量在各代之间稳定，酵母菌(saccharomycesp.)zb412直到至少第10代未显示出回复突变，表明遗传稳定性好。所述发酵培养基的配制步骤为：1)、称取100g大米粉，并往大米粉中加入水，大米粉与水的质量比为1:4，搅拌均匀后加热至90～100℃蒸煮糊化60～90min；2)、待温度降至60～75℃时加入占大米粉质量0.5～4％的淀粉酶，保温水解2～4h；3)、温度降至40～60℃时加入占大米粉质量1～3％的糖化酶，保温糖化2～4h，即，得发酵培养基。将酵母菌zb412接种至食醋发酵醪液中，采用液态深层常规发酵工艺进行食醋发酵，发酵结束后，食醋中氨基态氮含量达到0.09g/100ml，乙酸乙酯以及4-乙基愈创木酚含量分别达到1.76g/l和2.38mg/l；发酵所得食醋酯香味突出，口感回甜度好。因此，在第一方面，本发明提供了一种酵母菌(saccharomycesp.)zb412。在第二方面，本发明提供了所述酵母菌zb412在食品发酵中的用途。在一个实施方案中，所述食品发酵为食醋、酱油、酿造酒的发酵。在一个实施方案中，所述食醋为香醋、米醋、白醋、果醋中的任意一种。在一个实施方案中，所述食醋发酵采用液态深层法发酵工艺发酵。在一个实施方案中，所述的酿造酒发酵为米酒发酵。在第三方面，本发明提供了所述酵母菌zb412在产乙酸乙酯和4-乙基愈创木酚方面的应用。综上所述，本发明的有益效果为：本发明利用常压室温等离子体诱变技术获得了一株可明显提高液态发酵食醋中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯含量的酵母菌(saccharomycesp.)zb412，该菌株具有高耐酸性，在糖化醪中接种该酵母菌菌种进行酒精发酵，可显著提升食醋的原料利用率、氨基态氮和总酯含量，所得食醋风味纯正度较高，酸度适中，酯香味突出，口感回甜度好；本发明的酵母菌zb412菌株可作为发酵功能菌应用于食醋、酱油、酿造酒等传统发酵行业及食品工业中，使得产品酯香味突出，显著提高产品品质，具有良好的可操作性和经济效益。附图说明图1是酵母菌zb412筛选流程图；图2是生长在ypd固体培养基上的酵母菌zb412的照片；图3是酵母菌zb412在电子显微镜下的照片。具体实施方式本发明提供了一株酵母菌zb412，在糖化醪中接种该酵母菌菌种进行酒精发酵，能够明显提高液态发酵食醋中乙酸乙酯和4-乙基愈创木酚的含量，改善液态发酵食醋的口感与风味。本发明涉及下列已在广东省微生物菌种保藏中心(广州市先烈中路100号大院59号楼)进行保藏的生物材料：酵母菌(saccharomycesp.)zb412，其具有保藏编号gdmcc.no：60523，且保藏日期为2018年12月12日。在一些实施例中，本发明从酵母菌zb118出发，利用artp诱变技术对出发菌株进行诱变，通过初筛培养基进行初筛，根据透明圈直径与菌落直径的比值进行筛选，比值较大的菌株即为产酯能力较强的菌株，从而得到6株产酯能力较强、生长良好的诱变菌株。将初筛菌株接种到发酵培养基中进行发酵，通过测量发酵液中乙酸乙酯和4-乙基愈创木酚的含量进行筛选，得到一株高产乙酸乙酯和4-乙基愈创木酚的酵母菌株zb412。将酵母菌zb412应用于液态深层酿造食醋工艺中，接种于糖化醪中进行酒精发酵，最终得到的酿造食醋中乙酸乙酯和4-乙基愈创木酚含量较传统食醋有明显的提高，食醋风味以及口感良好，显著提升食醋品质。在一些实施例中，本发明提供了一株能够在液态深层发酵制取食醋工艺中直接应用来提高食醋发酵阶段发酵产物中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯含量的安全菌，从而能够安全可靠地提高食醋的风味品质。为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本发明的实验路线如图1所示。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1菌种诱变以酵母菌zb118为出发菌株，酵母菌zb118的获得参考公开号为cn108315271a的中国专利《一种酵母及其应用》中所述方法。酵母菌zb118的生物保藏信息如下：其已于2017年11月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为酵母菌(saccharomycesp.)zb118，保藏编号为gdmccno:60280，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。将该菌株zb118的成熟斜面制成菌悬液，并对酵母菌悬液进行artp诱变。用无菌生理盐水将诱变后的酵母菌悬液逐级稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度，制成菌体稀释液，将不同浓度的菌体稀释液在显微镜下进行计数，选择10-3浓度梯度的菌体稀释液进行后续实验。实施例2诱变菌株的筛选(1)诱变菌株的初筛移取0.1ml实施例1所得菌体稀释液，并均匀涂布于添加了0.4％三丁酸甘油酯的ypd固体培养基上，28～30℃避光培养48小时，培养过程中观察菌落生长情况和透明圈形成快慢情况，并记录菌落生长直径和透明圈直径。透明圈直径与菌落直径的比值大小用以表征酵母菌株的产酯能力，因此，根据透明圈直径与菌落直径的比值进行筛选，比值较大者即为产酯能力较强的菌株，从而挑选出与出发菌株相比菌落生长良好、产酯性能较好的菌落。经过筛选获得6株产酯能力较好的菌株，并依次编号为lb410、md411、zb412、nb413、de414、gc415，筛选结果见表1。将上述菌株转接于ypd斜面培养基上培养，成熟后保存于4℃冰箱备用。ypd液体培养基配方为(以质量百分比计)：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，余量为水。ypd固体或斜面培养基则在ypd液体培养基中另外添加2％琼脂。表1诱变菌株的初筛结果表1结果显示，与出发菌株相比，经过诱变获得了6株具有较高产酯能力且生长情况良好的酵母菌株。(2)诱变菌株的复筛将上述初筛选出的6株酵母菌依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，保持28℃恒温，180rpm培养48小时，获得菌悬液，然后以1％体积比接种量接种于发酵培养基中继续进行发酵小试，28～33℃条件下静置发酵72h后停止发酵，采用高效液相色谱法测定其发酵液中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯的含量，检测结果如表2所示。上述发酵培养基的制备方法为：首先称取100g大米粉，然后往大米粉中加入400g水搅拌均匀，将上述混合物料升温至90～100℃，蒸煮糊化60～90min后散热冷却，待温度降至60～75℃时加入占大米质量0.5～4％的淀粉酶，保温水解2～4h，接着进一步散热冷却，待温度降至40～60℃时加入占大米质量1～3％的糖化酶，保温糖化2～4h，即得所需发酵培养基。表2诱变菌株的复筛结果从上表2的结果可以看出，优选乙酸乙酯、4-乙基愈创木酚指标最高的酵母菌菌株zb412进行菌种保藏及后续试验。本实施例选育获得的zb412已经由本发明人于2018年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为酵母菌(saccharomycesp.)zb412，保藏编号为gdmccno:60523，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。酵母菌zb412菌落特征(如图2所示)为：在ypd固体培养基上，28℃条件下培养2天，菌落呈奶酪状，乳白色，表面平滑，不透明，不反光，边缘整齐，圆形，菌落直径2～4mm。酵母菌zb412在电子显微镜下的照片如图3所示。实施例3酵母菌zb412菌株遗传稳定性检测将实施例2中筛选出的酵母菌株zb412接种于ypd斜面培养基连续传代10代，观察各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面菌种按实施例2中方法对菌种进行发酵培养，发酵结束后采用高效液相色谱法测定其发酵液中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯的含量，判断其遗传稳定性，若十代菌种发酵所得发酵液中测定4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯的含量误差在10％误差范围内，则表明菌株遗传稳定性良好，具体数据见表3。表3酵母菌株传代稳定性检测结果如表3的结果所示，从发酵液中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯的检测结果来看，酵母菌zb412的遗传稳定性良好。实施例4酵母菌株zb412的耐酸性能试验调节发酵培养基的ph至2.0～7.0，以ph0.5梯度递增，每个梯度做3个平行，接种1％体积比的酵母菌zb412菌悬液，在28～33℃条件下静置发酵72h后停止发酵，采用高效液相色谱法测定发酵液中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯的含量，根据其含量高低来判断菌株的生长情况。菌株耐酸性结果如下表4所示。表4菌株耐酸性能结果从表4结果可以看出，酵母菌株zb412在ph为2.5时仍能正常生长，且随着ph的增大，酵母菌株仍能在酸性环境中良好的生长；因此，酵母菌株zb412具有良好的耐酸性能。实施例5酵母菌株zb412的耐乙醇性能试验调节发酵培养基乙醇浓度为0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％(v/v)，接种1％体积比的酵母菌zb412菌悬液，每个梯度做3个平行，在28～33℃条件下静置发酵72h后停止发酵，采用高效液相色谱法测定发酵液中4-乙基愈创木酚和乙酸乙酯的含量，根据其含量高低来判断菌株的生长情况。菌株耐乙醇性能结果如下表5所示。表5菌株耐乙醇性能结果乙醇浓度(％)乙酸乙酯(g/l)4-乙基愈创木酚(mg/l)01.482.3621.482.3241.482.3561.462.0281.251.98101.161.56121.020.85从表5的结果可以看出，当乙醇浓度在0％～10％时，酵母菌株zb412皆能够正常生长，当酒精浓度大于10％时，酵母菌株的生长稍受限制。由此表明，本发明酵母菌株具有较好的耐乙醇性能。实施例6酵母菌zb412在米醋发酵中的效果将实施例2诱变筛选获得的酵母菌zb412与出发菌株同步展开米醋发酵生产使用，其具体操作步骤为：称取10kg大米粉，加入40kg水，搅拌后加热煮沸进行高温糊化60min，然后降温至60～75℃，加入淀粉酶液化2小时，控制温度在45～60℃，添加糖化酶，搅拌糖化2小时，结束后通入50l液态发酵罐，控制温度在28～32℃，按照5％体积比的接种量加入酵母菌zb412菌液进行酒精发酵72h，酒精发酵结束之后检测米酒清液的酒精度和还原糖浓度，其检测结果如下表6。之后再接入醋酸菌，进行醋酸发酵15天。发酵成熟后，检测米醋的理化指标，其检测结果如下表7。表6酵母菌zb412发酵米酒检测结果菌株酒精度(％vol)还原糖(g/l)出发菌株zb1187.94.5zb41210.13.9由表6可知，酵母菌zb412较出发菌株发酵所得米酒，其酒精度提高了27.8％，且其发酵米酒清液中的还原糖含量也低于出发菌株，充分说明了酵母菌zb412较出发菌株具有较高的原料利用率。表7酵母菌zb412发酵米醋检测结果表7结果显示，采用酵母菌株zb412制备的米醋各项理化指标均要优于出发菌株zb118制备的米醋，特别是在乙酸乙酯以及4-乙基愈创木酚含量等方面，可见将酵母菌株zb412应用于液态米醋酿造，可明显改善液态发酵所得米醋的品质。本发明还召集20名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评，感官鉴评方法参照gb/t5009.41-2003，感官鉴评的评价指标包括酸味、刺激性、回甜度、色泽和香气，分值为0～5分，平均分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结于表8中。表8米醋感官鉴评结果如表8中的结果所示，酵母菌zb412发酵所得米醋在香气、色泽以及回甜度等方面均具有较大改善，并且要优于采用出发菌株zb118发酵所得米醋。综上所述，加入酵母菌zb412进行液态米醋发酵可以显著改善液态深层发酵所得食醋的口感与风味，全面提升米醋质量，应用前景广阔。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12