用于重组蛋白质的改进的收获操作的制作方法
相关申请的交互引用
本申请要求2012年3月27日提交的临时美国申请号61/616,297的优先权的权益，将所述申请以其整体并入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及用于在原核宿主细胞中培养重组蛋白质的改进方法。
发明背景
对于活的生物技术产品而言，蛋白质的大规模经济纯化是必须的。通常，使用哺乳动物或细菌细胞系，通过细胞培养产生蛋白质，通过插入含该蛋白质的基因的重组质粒来改造所述哺乳动物或细菌细胞系以产生目的蛋白质。由于所使用的细胞系是活的生物，所以必须使用复合生长培养基培养它们，所述复合生长培养基通常含有盐、糖、氨基酸、维生素、痕量元素和蛋白胨的混合物。从培养细胞的化合物的混合物中以及从细胞自身的副产物中分离期望的蛋白质达到足够用作为人类治疗剂的纯度是一种艰难的挑战。
通常在几种宿主细胞系中产生重组治疗性蛋白质，包括哺乳动物宿主细胞例如，鼠骨髓瘤ns0和中国仓鼠卵巢(cho)细胞(anderson,d.c和krummen,l.(2002)curr.opin.biotech.13:117-123；chu,l.和robinson,d.k.(2001)curr.opin.biotechnol.12:180-187)以及细菌宿主细胞包括大肠杆菌escherichiacoli(e.coli)。就产率和由细胞产生的蛋白质的特征而言，每一细胞系都具有优点和缺点。大肠杆菌已经最广泛地用于治疗性蛋白质的大规模产生，其不需要用于生物活性的复合糖基化。由大肠杆菌表达的异源蛋白质可以聚积成可溶性产物或者不溶性聚集体。通常，为了分离蛋白质，可以将细胞进行用于周质提取的处理或者裂解以释放用其它方法无法接近的胞内产物。发酵和细胞培养技术的发展极大地增加了目标重组蛋白质的滴度。
选择市售产品细胞系通常平衡了对于高产率的需求和递送给定产品所需的产品质量特性的能力。在cgmp发酵协议下，质量已经构建到整个工艺中，以确保就安全性、产品同一性、质量和纯度而言，符合管理机构的需求。然而，偶然会出现给定产品不符合其规格的问题。存在的挑战是研发健全的工艺，其中鉴别并分离不符合规格的产品，然后减少不符合规格的产品的出现，以使工艺控制可以维持在已建立的参数范围内，并确保工艺持续产生符合产品规格的产品。本领域存在减轻或消除不符合规格的产品的发生率的需求。
发明概述
本发明涉及产生重组蛋白质的方法，其包括(a)发酵原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)在溶解氧(do2)水平大于0％的条件下收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成用于储存的经过滤的储备物(filteredbulkforstorage)(fbs)，其中通过分析测定法如离子交换层析(iec)测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的1,4-二羟基-2-萘甲酸(dhna)-重组蛋白质加合物。在一个实施方案中，在上述方法中，分析测定法是hplc、rphplc、hichplc、nmr、质谱法或uv光谱学。
本发明涉及产生重组蛋白质的方法，包括(a)发酵原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)在do2水平大于0％的条件下收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成fbs，其中如通过iec测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的dhna-重组蛋白质加合物，其中所述重组蛋白质是重组多肽或分离的抗体。
本发明涉及产生重组蛋白质的方法，包括(a)发酵原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)在do2水平大于0％的条件下收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成fbs，其中如通过iec测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的dhna-重组蛋白质加合物，其中发酵是独立于规模的。
本发明涉及产生重组蛋白质的方法，包括(a)发酵原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)在do2水平大于0％的条件下收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成fbs，其中如通过iec测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的dhna-重组蛋白质加合物，其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌(escherichiacoli(e.coli))、肠杆菌属(enterobacter)、固氮菌属(azotobacter)、欧文氏菌属(erwinia)、芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙门氏菌属(salmonella)、沙雷氏菌属(serratia)、志贺氏菌属(shigella)、根瘤菌属(rhizobia)、透明颤菌属(vitreoscilla)和副球菌属(paracoccus)。
本发明涉及产生重组蛋白质的方法，包括(a)发酵原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)在do2水平大于0％的条件下收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成fbs，其中如通过iec测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的dhna-重组蛋白质加合物，其中所述do2在整个步骤(b)的收获操作中持续维持在大于0％的水平。在上述方法的一个实施方案中，收获操作包括匀浆阶段。在另一个实施方案中，do2在匀浆前维持在约30％至约75％。又在另一个实施方案中，do2在匀浆前维持在大于75％的水平。仍在另一个实施方案中，do2在匀浆后维持在约50％。在一个实施方案中，do2在匀浆后维持在大于50％的水平。在一个实施方案中，do2维持大于或等于1.5个小时。仍在一个实施方案中，do2维持大于或等于2个小时。
本发明涉及产生重组蛋白质的方法，包括(a)发酵原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)在do2水平大于0％的条件下收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成fbs，其中如通过iec测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的dhna-重组蛋白质加合物，其中用覆盖的或喷射的气体(在增加的反压或在振荡(即搅拌)的情况下)维持do2。在一个实施方案中，覆盖的气体为约0.4vvm至约0.8vvm。在另一个实施方案中，覆盖的气体规定为0.6vvm。在另一个实施方案中，增加的反压在约1.0至30psi之间。在一个实施方案中，增加的反压为19psi。仍在另一个实施方案中，搅拌速率为约6瓦特/l至约8瓦特/l。又在另一个实施方案中，搅拌速率为至少6瓦特/l。在另一个实施方案中，搅拌速率为6瓦特/l。
在本发明的另一方面中，提出了产生重组蛋白质的方法，包括(a)发酵缺失mene基因的原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成fbs，其中如通过iec测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含可检测的dhna-重组蛋白质加合物。作为上述方法的其他实施方案，与使用对照原核宿主细胞得到的产量相比，重组蛋白质产量增加了约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多。
在本发明的另一方面中，提出了产生重组蛋白质的方法，包括(a)发酵缺失mene基因的原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成fbs，其中如通过iec测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的dhna-重组蛋白质加合物，其中与使用对照原核宿主细胞比较，重组蛋白质产量增加了约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多，其中发酵是独立于规模的。
在本发明的另一方面中，提出了产生重组蛋白质的方法，包括(a)发酵缺失mene基因的原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成fbs，其中如通过iec测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的dhna-重组蛋白质加合物，其中与使用对照原核宿主细胞比较，重组蛋白质产量增加了约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多，其中所述重组蛋白质是重组多肽或分离的抗体。
在本发明的另一方面中，提出了产生重组蛋白质的方法，包括(a)发酵缺失mene基因的原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成fbs，其中如通过iec测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的dhna-重组蛋白质加合物，其中与使用对照原核宿主细胞比较，重组蛋白质产量增加了约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多，其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌、肠杆菌属、固氮菌属、欧文氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、根瘤菌属、透明颤菌属和副球菌属。
附图简述
图1显示了产品的三种生产操作的coc测定结果，其中两种操作run2和run3没有满足coc测定法的预期结果。pw＝纯水，c＝研发操作对照，1＝run1，2＝run2和3＝run3。
图2a显示了run1-3的uv/vis光谱(10cm)–近uv，其中显示了run1-3。大约在320nm和460nm处观察到了新的吸收峰，其在run1中不明显。图2b显示了run3减去run1的uv/vis光谱，其中run2和3的吸收峰的差别可以区别于run1。
图3显示了在310nm使用iec测定监测run1-3。对于run2和3，观察到了主峰的后面的小肩峰，而run1的图谱与参照材料类似。
图4显示了在280nm和310nm处监测的完整run1-3的2dlc-ms分析。对于run1，观察到了期望的质量，而对于run2和3，观察到了期望的质量以及157da的其他质量。
图5显示了2d-lcms以及使用ms检测收集的褐色加合物的级分(收集了iec测定的较小峰)，通过胰蛋白酶肽图鉴定的质量。根据2dlc-ms分析，除期望的质量外，对于分级的肩峰，观察到了+156da质量。
图6显示了在48.8分钟，310nm观察到了新褐色加合物峰的lc-ms-ms分析，其测定为+154.006da的具有修饰的cys182的t20肽。通过质量提取(massextraction)还检测到了修饰的(在半胱氨酸处，+154.006da)和未修饰的t6以及t16肽。
图7比较了产物和合成肽(nh2-ivqcr-cooh)的1h-15nhsqc数据，并且显示在产物样品中缺失了cysnh相关性。
图8显示了通过在cys的ch和精氨酸的nh之间观察到的强noe确认的推测结构。
基于收集的nmr数据，图9中显示了褐色加合物的推测结构。
图10显示了原核细胞中制备甲基萘醌的生物合成途径。
图11显示了通过离子交换层析在310nm处测试代表性经过滤的储备物重组产物的褐色加合物形成，并且显示没有可测量的加合物形成。
图12显示了在收获操作前后执行的hi-do工艺增强的示例性示意图。
发明实施方案的详细描述
i.定义
除非另外指明，在本文中使用的以下术语和短语旨在具有以下含义：
术语“搅拌速率”用于混合培养基或匀浆，其通常测量为每分钟转数(转/分钟)。在一个实施方案中，可以通过“单位体积功率”来测量搅拌速率。例如，1,000升发酵罐中200转/分钟，搅拌速率为大约6瓦特/l。
在本文中，术语“抗体”以最广义使用，并且特别地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性。抗体可以是鼠、人、人源化的、嵌合的或者来源于其他物种。如本文中所用，术语“抗体”还指全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含免疫特异地结合目标靶抗原的抗原结合位点的分子或其部分，此类靶标包括但不限于癌细胞或者产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文所公开的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任意类型(例如，igg、ige、igm、igd和iga)、种类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任何物种。然而，在一个方面中，免疫球蛋白是人、鼠或兔来源的。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab′、f(ab′)2和fv片段；双抗体；线性抗体；通过fab表达文库产生的片段、抗独特型(anti-id)抗体、cdr(互补决定区)、ecd(胞外结构域)和任意上述与癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原免疫特异地结合的抗体的表位结合片段、单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“澄清度、乳浊度和显色(coc)测定法(clarity,opalescenceandcoloration(coc)assay)”定义为使用具有平底和15-25mm内径的无色、透明、中性玻璃的相同测试管，将待检查的液体与如上所述新鲜制备的参照悬浮液比较，层深为40mm。可将u.s.pharmacopeia2012(uspmonograph631，colorandachromicity)中或europeanpharmacopoeia5.0(epmethod2.2.2，degreeofcolorationofliquids)中列出的标准颜色溶液用于确认合适颜色指示。
术语“1,4-二羟基-2-萘甲酸(dhna)”是来源于大肠杆菌细胞的化学产物。okaday,tsuzukiy,miyazakij,matsuzakik,hokarir,komotos，等人(2006)gut55:681-8。dhna是大肠杆菌细胞的甲基萘醌(mk)，也称为维生素k2生物合成途径中的中间产物。neidhardt,f.c.(2010)escherichiacoliandsalmonella(onlineversion:module3.2.2pgs.36-37)；inledew,w.j.&r.k.poole(1984)therespiratorychainsofescherichiacoli.microbiologicalreviews.48:222-271；nowicka,b.&j.cruk(2010)occurrence,biosynthesisandfunctionofisoprenoidquinones.biochimicaetbiophysicaacta1797:1587-1605。
术语“溶解氧”(do2)是在给定介质中溶解的或者携带的氧的量的相对测量。可以在液体介质中使用溶解氧探针如氧传感器测量溶解氧。
如本文中所用，术语“发酵”意为培养已经转化了的原核宿主细胞，以诱导目的重组蛋白质产生的工艺。
术语“经过滤的储备物(filteredbulk)”或“经过滤的储备物质(filteredbulksubstance)(fbs)”意为收获和纯化后目的产物的重组蛋白质，其中已经使该蛋白质从宿主细胞中释放、离心和/或过滤以去除任何细胞碎片、在合适的层析柱上纯化，并随后通过过滤方法浓缩。
术语“收获的细胞培养液”，也表示为hccf，意为已经通过包括离心或过滤的方法去除了细胞的原核或真核细胞培养液。细胞培养是原核或真核细胞在可控条件下生长的过程。术语“细胞培养”指培养来源于多细胞真核生物(包括动物细胞)或者单细胞原核生物(包括细菌和酵母)的细胞。真核细胞培养物包括哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤和昆虫细胞。使用合适的细胞培养容器，可以从依赖贴壁细胞或悬浮细胞系中获得分泌蛋白质。哺乳动物细胞培养包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞或ns0细胞。
在不限制的情况下，术语“收获操纵”或“收获”意为这样的工艺，其包括裂解或匀浆，然后离心和/或过滤发酵的经转化的原核宿主细胞培养物，以产生重组目的蛋白质，从而开始分离和纯化所述目的蛋白质。
如本文中所用，术语“hi-do”指如本文中所述的增强工艺，其中在收获操作期间，维持溶解氧水平在大于0％。为此，本发明提出了可以用于维持do2水平处于或者高于设定点(即大于0％、或者处于约30％至约75％、或者处于大于75％的水平、或者处于约50％、或者处于大于50％水平)的覆盖气体、反压和搅拌速率的组合。在另一个实施方案中，本领域技术人员还可以喷射气体或纯氧到培养基中，以直接实现溶解氧水平的hi-do大于0％。
如本文中所用，术语“匀浆”意为裂解或机械性细胞裂解用重组目的蛋白质转化的原核宿主细胞，以从宿主细胞中释放所述蛋白质的工艺。
术语“增加的反压”用于增加穿过培养基的氧转移速率。反压通常以psi或巴测量。
“甲基萘醌(mk)”是维生素k2同系物，并且在微氧和/或厌氧条件时，在膜结合蛋白质复合体之间的呼吸链中用作为电子穿梭分子。术语“mene”是制备甲基萘醌的生物合成途径中的基因。
术语“微生物发酵”意为细胞培养基因工程细菌或酵母，以产生蛋白质和小分子(例如次级代谢产物)。发酵用于增殖重组细菌和酵母，以及其他微生物并产生有价值的蛋白质。通过供应特定生长培养基并控制多种环境因素(例如ph、温度和通气)，最大化细胞产率和这些生物的生长。细菌发酵液可以来源于大肠杆菌培养物。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体(即，除可能存在极少量的天然发生的突变外，群体包含的各个抗体是相同的)的抗体。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每一单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体是有利的，因为它们可以合成，而不被其他抗体污染。修饰词“单克隆”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，并且不应理解为需要通过任意特定方法产生抗体。例如，可以通过由kohler等人(1975)nature256:495第一次描述的杂交瘤方法制备或者可以通过重组dna方法(美国专利号4,816,567)制备根据本发明所使用的单克隆抗体。“单克隆抗体”还可以使用例如在clackson等人(1991)nature,352:624-628；marks等人(1991)j.mol.biol.,222:581-597中所述的技术，分离自噬菌体抗体文库。
术语“覆盖气体”意为从含培养基的发酵罐的顶部吹送气体。通常，通过在液体培养基中产生气泡，常常伴随剧烈搅拌以实现良好的气泡分散，来向发酵罐供氧。
如本发明中所用，术语“原核宿主细胞”应当包括使用甲基萘醌生物合成途径的那些细胞。在一个实施方案中，原核宿主细胞包括，例如古细菌(archaebacteria)和真细菌(eubacteria)，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(例如，大肠杆菌)、芽孢杆菌属(例如，枯草芽孢杆菌(b.subtilis))、肠杆菌属、假单胞菌属物种(例如，铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescans)、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、志贺氏菌属、根瘤菌属、透明颤菌属或副球菌属。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在另一个实施方案中，将大肠杆菌细胞(bachmann,cellularandmolecularbiology,vol.2(washington,d.c.:americansocietyformicrobiology,1987),pp.1190-1219；atcc贮藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型w3110δfhua(δtona)ptr3laciqlacl8δomptδ(nmpc-fepe)degp41kanr(美国专利号5,639,635)的菌株33d3用作为本发明的宿主。当然，其他菌株及其衍生物，例如大肠杆菌294(atcc31,446)、大肠杆菌b、大肠杆菌λ1776(atcc31,537)和大肠杆菌rv308(atcc31,608)也是合适的。这些实例是说明性的，而不是限制性的。用于构件具有定义的基因型的任一上述细菌的衍生物的方法是本领域已知的，并且描述于例如bass等人(1990)proteins,8:309-314中。当然，选择合适的细菌需要考虑复制子在细菌细胞中的复制性。例如，当将熟知的质粒如pbr322、pbr325、pacyc177或pkn410用于提供复制子时，可以将大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门氏菌属物种合适地用作为宿主。
如本文中所用，“重组蛋白质”通常指包括抗体的肽和蛋白质。此类重组蛋白质是“异源的”，即对于所使用的宿主细胞是外来的，例如通过大肠杆菌产生的人蛋白质。多肽可以产生为不溶性聚集体或者周质间隙或细胞质中的可溶性多肽。
术语“独立于规模的”意为本发明发酵工艺的体积容量可以使用任意规模实现，例如如约1升或更大、或者约10升或更大、或者约100升或更大、或者约500升或更大、或者约1,000升或更大、或者约10,000升或更大、或者约100,000升或更大。
ii.实施本发明的方法
本发明涉及在原核系统中重组产生蛋白质的改进方法。本发明基于防止重组蛋白质生产期间发现的褐色加合物的形成，所述褐色加合物形成造成某些产物不符合规格。如在本文中所提供的实施例中所示，褐色加合物问题起因于收获操作期间不一致的氧化还原电势。目前令人惊奇的发现，可以通过在收获操作期间维持溶解氧环境大于零或者备选地，通过遗传缺失用于重组产生重组目的蛋白质的原核宿主细胞基因组中的mene基因，来防止褐色加合物形成。
原核细胞中重组蛋白质的重组产生
在上述方法的第一步中，将用于产生重组目的蛋白质的异源核酸(例如，cdna或基因组dna)合适地插入到可复制载体中以在细菌的合适启动子控制下在细菌中表达。对于该目的，许多载体都是可用的，并且合适载体的选择主要取决于待插入到载体中的核酸的大小，以及用载体转化的特定宿主细胞。取决于载体的功能(dna扩增或者dna表达)以及与其相容的特定宿主细胞，每一载体含有多种组分。用于细菌转化的载体组分包括用于异源多肽的信号序列，并且包括信号序列，并且还包括用于异源多肽的可诱导启动子。如本文中所用，它们通常还包括复制起点以及一个或多个标记基因。
如果异源多肽是分泌的，那么编码本文中异源目的多肽的dna含有信号序列，例如成熟异源多肽n-端的信号序列。总之，信号序列可以是载体的成分，或者其可以是插入到载体中的异源多肽dna的一部分。选择的异源信号序列应当是宿主细胞可以识别和加工(即，通过信号肽酶切割)的信号序列。由于细菌宿主细胞不识别和加工天然的异源多肽信号序列，所以通过任一熟知的细菌信号序列取代该信号序列。
表达载体含有能使载体在一个或多个选择的宿主细胞中复制的核酸序列。在多种细菌中含有此类序列。来自质粒pbr322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌。
表达载体通常还含有选择基因，也称为选择标记。该基因编码对在选择培养基中培养的经转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。没有用含选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中不会存活。一般的选择基因编码这样的蛋白质，其(a)赋予对抗生素或其他毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，(b)互补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中不能得到的关键营养物，例如编码芽孢杆菌属的d-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个实例使用药物来阻滞宿主细胞的生长。这些用异源基因成功转化的细胞产生赋予抗药性的蛋白质，并因此在选择方案中存活下来。
用于产生异源多肽的表达载体还含有被宿主细菌生物识别的可诱导启动子，并且其与编码异源目的多肽的核酸是有效连接的。该表达载体还含有与编码水解酶的核酸有效连接的分离的可诱导或低基础表达启动子。适合于细菌宿主使用的可诱导启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(chang等人，nature,275:615(1978)；goeddel等人,nature,281:544(1979))、阿拉伯糖启动子系统，包括arabad启动子(guzman等人,j.bacteriol.,174:7716-7728(1992)；guzman等人,j.bacteriol.,177:4121-4130(1995)；siegele和hu,proc.natl.acad.sci.usa,94:8168-8172(1997))、鼠李糖启动子(haldimann等人,j.bacteriol.,180:1277-1286(1998))、(haldimann等人,j.bacteriol.,180:1277-1286(1998))、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统(goeddel,nucleicacidsres.,8:4057(1980)和ep36,776)、p.sub.lteto-1和p.sub.lac/are-1启动子(lutz和bujard,nucleicacidsres.,25:1203-1210(1997))，以及杂合启动子如tac启动子。deboer等人,proc.nati.acad.sci.usa,80:21-25(1983)。然而，其他已知的细菌可诱导启动子和低基础表达启动子也是合适的。已经公布了它们的核苷酸序列，从而使得技术人员可以使用提供任何所需限制位点的连接体或衔接子，将它们与编码异源目的多肽的dna或者与编码水解酶的核酸(siebenlist等人,cell,20:269(1980))有效连接。如果使用强的且高渗漏启动子(highlyleakypromoter)，如trp启动子，那么通常仅用于表达编码异源多肽的核酸，而不用于表达编码水解酶的核酸。可以将tac和pl启动子用于表达异源多肽和编码水解酶的核酸之一，而不是二者的同时表达。在一个实施方案中，将碱性磷酸酶(phoa)启动子用于产物，并且将阿拉伯糖(ara)启动子用于水解酶。
在细菌系统中使用的启动子通常还含有与编码异源目的多肽的dna有效连接的shine-dalgarno(sd)序列。可以通过限制酶消化，从细菌来源dna中去除启动子，并插入到含期望dna的载体中。通过限制酶消化，可以将phoa启动子从细菌来源dna中去除，并插入到含期望dna的载体中。
含一个或多个上述组分的合适载体的构建使用了本领域技术人员熟知的标准连接技术。切割、修改分离的质粒或dna片段，并以期望的形式再连接，以产生所需的质粒。
如本文中所定义，用于要求专利保护的本发明的合适的原核宿主细胞包括使用生物合成途径来制备甲基萘醌的任何原核宿主细胞。一些非限制性实例包括，例如大肠杆菌、肠杆菌属、固氮菌属、欧文氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、根瘤菌属、透明颤菌属和副球菌属。
转化意为将dna作为染色体外元件或者通过染色体整合引入原核宿主中，以使dna可以复制。取决于所使用的宿主细胞，使用对于此类细胞合适的标准技术进行转化。通常将使用氯化钙的钙处理用于含坚固的细胞壁屏障的细菌细胞。用于转化的另一方法使用聚乙二醇/dmso。还使用的另一技术是电穿孔。
将用于产生本发明多肽的原核细胞培养于本领域已知的并且适合用于选定宿主细胞培养的培养基中。合适的培养基的实例包括添加了必需营养补充物的luria-bertani(lb)培养基。在某些实施方案中，培养基还含有选择剂，基于构建的表达载体进行选择，以选择性地允许含表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素加入到用于细胞生长的培养基中，所述细胞表达氨苄青霉素抗性基因。还可以以合适的浓度包括除碳、氮和无机磷源之外的任何必需补充物，其可以单独地或者以与另一补充物或培养基如复合氮源的混合物的形式引入。
对于表达基因产物的聚积，在足以聚积基因产物的条件下培养宿主细胞。此类条件包括例如，允许细胞表达和聚积蛋白质的温度、营养和细胞密度条件。此外，如本领域技术人员已知，此类条件是这样的条件，在该条件下细胞可以进行基本细胞功能，如转录、翻译，以及蛋白质从一个细胞区室进入到另一用于分泌蛋白质的细胞区室。
在合适的温度培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌培养，例如，一般的温度为约20℃至约39℃。在一个实施方案中，温度为约25℃至约37℃。在另一个实施方案中，温度为约30℃。
主要取决于宿主生物，培养基的ph可以是约5-9的任一ph。对于大肠杆菌，ph为约6.8至约7.4，或者约7.0。
对于诱导，通常培养细胞直到达到确定的光密度，例如约80-100的a550，在此时开始诱导(例如，通过添加诱导物，通过耗竭阻遏物、抑制剂或培养基组分等)，以诱导编码异源多肽的基因的表达。
产物聚积后，任选地在产物回收之前，将培养基裂解物温育足够的时间，以使细胞中含有的异源多肽释放。在备选的实施方案中，或者在前面的步骤之后，可以使用本领域已知的任何机械方法(其可以包括例如化学裂解或渗透压休克)机械地裂解培养物中存在的细胞，以从宿主细胞中释放所述蛋白质。
一旦裂解，就将裂解物或匀浆转移到贮料罐中，其中等待更多批次的裂解物/匀浆的加入和/或其中发生进一步的处理，例如如用水稀释、添加缓冲液或絮凝剂、ph调整，或者改变或维持用于后续回收步骤的制备物中裂解物/匀浆的温度。
在后续的步骤中，以最小化共回收的细胞碎片和产物的方式，从裂解物或匀浆中回收异源多肽(例如释放自细胞基质的可溶性或不溶性产物)。可以通过任何方法进行回收，但在一个实施方案中，可以包括沉降含异源多肽的可折射颗粒或者收集含可溶性产物的上清液。沉降的实例是离心。因此，在膨胀床吸附(eba)或者沉降之前，在破坏外层细胞壁以增加渗透性并允许回收更多固体的试剂存在的情况下，进行回收。此类试剂的实例包括螯合剂如乙二胺四乙酸(edta)或者兼性离子例如偶极离子去垢剂如zwittergent316tm去垢剂。在一个实施方案中，在edta存在的情况下进行回收。
如果将离心用于回收，相对离心力(rcf)是重要的因素。调整rcf，以最小化裂解时细胞碎片与释放自细胞壁的可折射颗粒的共沉降。用于该目的的具体rcf将依据例如待回收产物的类型改变，但至少为约3000×g，更优选地约3500-6000×g或者约4000-6000×g。
离心的持续时间取决于几个因素。沉降速率取决于例如可折射(retractile)颗粒的大小、形状和密度，以及液体的粘度。固体的沉淀时间取决于例如沉降距离和速率。期望连续圆盘堆叠(disc-stack)离心可以良好地用于大规模回收释放的异源多肽聚集体或者用于去除细胞碎片是合理的，这是因为它们具有相对大的离心力和相对小的沉降距离，这些离心机可以以高液体速度进行处理。
然后可以从污染的蛋白质中进一步纯化初始回收步骤中捕获的异源多肽。在一个实施方案中，如美国专利号5,288,931中所公开，分离聚集的异源多肽，然后同时进行多肽的增溶和再折叠。备选地，通过如下所述的标准技术回收可溶性产物。
一般的层析方法及其用途是本领域技术人员已知的。参见例如，chromatography,5thedition,parta:fundamentalsandtechniques,heftmann,e.(ed),elseviersciencepublishingcompany,newyork,(1992)；advancedchromatographicandelectromigrationmethodsinbiosciences,deyl,z.(ed.),elseviersciencebv,amsterdam,thenetherlands,(1998)；chromatographytoday,poole,c.f.和poole,s.k.,elseviersciencepublishingcompany,newyork,(1991)；scopes,proteinpurificationprinciplesandpractice(1982)；sambrook,j.,等人(ed),molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989或者currentprotocolsinmolecularbiology,ausubel,f.m.,等人(eds),johnwiley&sons,inc.,newyork。以下方法是用于从周质或胞质中释放的可溶性异源多肽的合适纯化方法的示例，并且是本领域熟知的：免疫亲和或离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相hplc；二氧化硅上或阳离子交换树脂例如deae上层析；层析聚焦；sds-page；硫酸铵沉淀；以及使用例如sephadextmg-75的凝胶过滤。
在本发明的一个方面，通过发酵方法大量进行抗体产生。可将多种大规模分批发酵方法用于重组蛋白质的产生。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选地约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用叶轮搅拌器分配氧和营养物，特别是葡萄糖(优选的碳/能量源)。小规模发酵通常指在大约20升以下容量的发酵罐中的发酵。
如本文中所讨论，可将要求专利保护的本发明用于产生重组蛋白质，包括例如肽和蛋白质，所述蛋白质包括抗体。
可以通过本发明方法产生的重组肽和蛋白质的实例包括但不限于分子例如，肾素、生长激素，包括人生长激素、牛生长激素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、脂蛋白、α1-抗胰蛋白酶、胰岛素a-链、胰岛素b-链、胰岛素原、血小板生成素、促卵泡激素、降钙素、黄体生成素、胰高血糖素、凝血因子如因子viiic、因子ix、组织因子和和vonwillebrand因子、抗凝血因子如蛋白c、心房钠尿肽(atrialnaturieticfactor)、肺表面活性物质、纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-pa)、蛙皮素、凝血酶、造血生长因子、肿瘤坏死因子-α和-β、脑啡肽酶、血清白蛋白如人血清白蛋白、muellerian抑制物质、松弛素a链、松弛素b链、前松弛素(prorelaxin)、小鼠促性腺激素相关肽、微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶、dnase、抑制素、激活素、血管内皮生长因子(vegf)、激素或生长因子的受体、整联蛋白、蛋白a或d、类风湿因子、神经营养因子，例如脑衍生神经营养因子(bdnf)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(ντ-3、ντ-4、ντ-5或ντ-6)或神经生长因子如ngf-β、心肌营养蛋白(心脏肥大因子)如心营养蛋白-i(ct-i)、血小板衍生生长因子(pdgf)、成纤维细胞生长因子，例如afgf和bfgf、表皮生长因子(egf)、转化生长因子(tgf)，例如tgf-α和tgf-β，包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4或tgf-β5、胰岛素样生长因子i和ii(igf-i和igf-ii)、des(l-3)-igf-i(脑igf-i)，胰岛素样生长因子结合蛋白、cd蛋白，例如cd-3、cd-4、cd-8和cd-19、促红细胞生成素、骨诱导因子、免疫毒素、骨形态发生蛋白(bmp)、干扰素，例如干扰素-α、-β和-γ、集落刺激因子(csf)，例如m-csf、gm-csf和g-csf、白细胞介素(il)，例如il-i到il-13、抗-her-2抗体、超氧化物歧化酶、t细胞受体、表面膜蛋白、衰变(decay)加速因子、病毒抗原，例如aids包膜的一部分、转运蛋白、归巢受体、地址素(adderssin)、调节蛋白。
通过要求专利保护的本发明产生的抗体可以是针对特定抗原决定簇(例如，癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、糖、化学物质、核酸以及它们的片段)的同质性抗体群体的单克隆抗体。可以通过本领域已知的任何技术(其通过提供培养的连续细胞系来产生抗体分子)制备针对目的靶标的单克隆抗体(mab)。这些技术包括但不限于，最初由
有用的单克隆抗体包括但不限于，人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、抗体片段或嵌合的人-小鼠(或其他物种)单克隆抗体。可以通过本领域已知的任一种技术(teng等人(1983)proc.natl.acad.sci.u.s.a.80:7308-7312；kozbor等人(1983)immunologytoday4:72-79；和olsson等人(1982)methodsinenzymology92:3-16)制备人单克隆抗体。
抗体还可以是双特异性抗体。双特异性抗体具有一个臂中的杂合的免疫球蛋白重链(具有第一结合特异性)和在另一臂中的杂合的免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。这种不对称结构有助于从不想要的免疫球蛋白链组合中分离期望的双特异性化合物，因为免疫球蛋白轻链在一半双特异性分子中的存在提供了分离的方便方法(wo94/04690；suresh等人(1986)methodsinenzymology,121:210；rodrigues等人(1993)j.ofimmunology151:6954-6961；carter等人(1992)bio/technology10:163-167；carter等人(1995)j.ofhematotherapy4:463-470；merchant等人(1998)naturebiotechnology16:677-681)。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的(milstein等人(1983)nature305:537-539；wo93/08829；traunecker等人(1991)emboj.10:3655-3659)。使用此类技术，可以将双特异性抗体缀合为抗体药物缀合物(adc)，其治疗或预防如本文中所定义的疾病。
所定义的抗体可以是与癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原免疫特异地结合的抗体的有功能的活性片段、衍生物或类似物或者是与肿瘤细胞或基质结合抗体。在这点上，“有功能的活性”意为片段、衍生物或类似物能引发识别相同抗原的抗-抗独特型抗体，所述抗原是抗体、衍生物或类似物所衍生的。特别地，在示例性实施方案中，通过缺失构架区和cdr序列可以增强免疫球蛋白分子的独特型的抗原性，所述cdr序列是特异性识别抗原的cdr序列的c-端。为了确定哪个cdr序列结合抗原，可以通过本领域已知的任何结合测定法，例如biacore测定法(kabat等人,(1991)insequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,nationalinstituteofhealth,bethesda,md.；kabat等人(1980)j.ofimmunology125(3):961-969)，使用抗原，将合成的含cdr序列的肽用于结合测定法。
其他有用的抗体包括抗体的片段，例如但不限于f(ab′)2片段，其含有可变区、轻链恒定区和可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的重链的ch1结构域，以及可以通过减少f(ab′)2片段的二硫键产生的fab片段。其他有用的抗体是抗体的重链和轻链，或者其最小片段如fvs或单链抗体(sca)(例如，如美国专利号no.4,946,778；bird(1988)science242:423-42；huston等人,(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:5879-5883；和ward等人(1989)nature334:544-54中所述)，或者具有与抗体相同特异性的任何其他分子。
抗体可以是抗体的融合蛋白质或者其有功能的活性片段，例如其中抗体通过共价键(例如，肽键)在n-端或c-端与非抗体的另一蛋白质(或其部分，例如蛋白质的至少10个、20个或50个氨基酸部分)的氨基酸序列融合。抗体或其片段可以在恒定域的n-端与其他蛋白质共价连接。
在本文中，单克隆抗体包括“嵌合”抗体以及此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性，在嵌合抗体中重链和/或轻链部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中相应的序列相同或同源，而链的剩余部分与来源于其他物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源(美国专利号4,816,567；和morrison等人(1984)proc.natl.acad.sci.u.s.a.,81:6851-6855)。嵌合抗体是这样的分子，其中不同部分来源于不同的动物物种，例如具有来源于鼠单克隆的可变区和人免疫球蛋白恒定区那些嵌合抗体(美国专利号4,816,567；4,816,397)。嵌合抗体包括“灵源化的(primatized)”抗体，其包括来源于非人灵长类动物(例如，旧世界猴(oldworldmonkey)、类人猿等)可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
可以使用标准重组dna技术制备包含人类和非人部分的嵌合和人源化单克隆抗体((wo87/02671；ep184,187；ep171496；ep173494；wo86/01533；美国专利号4,816,567；ep12023；berter等人(1988)science240:1041-1043；liu等人(1987)proc.natl.acad.sci.u.s.a.84:3439-3443；liu等人(1987)j.immunol.139:3521-3526；sun等人(1987)proc.natl.acad.sci.u.s.a.84:214-218；nishimura等人(1987)cancer.res.47:999-1005；wood等人(1985)nature314:446-449；和shaw等人(1988)j.natl.cancerinst.80:1553-1559；morrison(1985)science229:1202-1207；oi等人(1986)biotechniques4:214；美国专利号5,225,539；jones等人(1986)nature321:552-525；verhoeyan等人(1988)science239:1534；和beidler等人(1988)j.immunol.141:4053-4060；所述每一文献在此处以其整体并入本文作为参考)。
可以通过本发明方法产生的治疗性单克隆抗体包括但不限于，曲妥珠单抗(
iii.方法和测定法
分析方法/测定法
澄清度、乳浊度和显色(coc)测定法
考虑到均一的乳浊溶液和悬浮液的亚显微光密度，还可以通过吸收光或散射光的仪器测量来测定乳浊的程度。此类技术是浊度测定法和比浊法。对于有色样品的浊度测量，使用比率比浊法和具有比率选择的浊度测定法。可以通过观察透射光(比浊法)或散射光(浊度测定法)，测量悬浮颗粒的光散射效应。比率比浊法组合了浊度测定法和比浊法的原理。对于测量稍乳浊的悬浮液，比浊法和浊度测量法是有用的。必须使用在明确限定的条件下产生的参照悬浮液。对于确认合适的颜色分配，在u.s.pharmacopeia2012(uspmonograph631,colorandachromicity)中或europeanpharmacopoeia5.0(epmethod2.2.2,degreeofcolorationofliquids)中列举了标准比色溶液。对于定量测量，校准曲线的构建是必需的，因为悬浮液的光学特性与分散相的浓度之间的关系最好是半经验的。使用比率比浊度或具有比率选择的浊度测定法进行有色液体浊度的测定，因为颜色提供了负干涉，减弱了入射光和散射光，并且降低了浊度值。对于不能使用常规浊度计的中等有色样品，该影响是非常大的。澄清度和乳浊度的仪器评估提供了更易区分的测试，其不再取决于分析者的视敏度。对于质量监测和工艺控制，特别是在稳定性研究中，数值结果是更有用的。例如，可以参照以前的稳定性数值数据，以测定给定批次的剂量制剂或者活性药物成分是否会在有效期之前超出贮藏期限限制。
hplc测定法
高效液相层析(也称为高压液相层析，简称为hplc)是液相层析的特殊形式，并且目前广泛用于生物化学和分析化学。在高压下，使分析物在液体(流动相)中通过固定相的柱子，所述液体减少了分离的组分保留在固定相上的时间，以及因此它们必须在柱中扩散的时间。这导致得到的层析谱中更窄的峰，并因此与lc相比较更好的分辨率和灵敏度。选择流动相，以确保样品溶质的溶解性。对于固定相，优选使用微粒状二氧化硅(裸露的或化学修饰的)，因为其大表面积增强了溶质-固定相相互作用之间的差异。使用相对于溶质流动相相互作用而言，与溶质强相互作用的流动相导致了非常长的停留时间，这种情况在分析上是没有用的。因此，必须选择固定相，以提供相对于流动相中的那些溶质而言，弱至中等的溶质相互作用。结果，溶质性质决定了所选择的lc的类型。在流动相中应当发生更强的相互作用，以确保样品溶解性并且便于洗脱，而固定相应当响应溶质间更细微的差异。例如，使用极性流动相以及非极性固定相(其区分溶质分散特征的细微差异)通常可以更好地分析极性中性化合物。hplc的一个强大方面是可以变化流动相来改变停留机制。可以将修饰剂加入流动相，以控制停留。例如，ph是含水流动相中重要的变量。
反相层析(rp-hplc)要求使用非极性固定相和极性流动相(含一种或多种极性溶剂，例如水、甲醇、乙腈和四氢呋喃)。
疏水相互作用层析(hic)hplc：该层析方法可以很好地用于分析基于其疏水性的蛋白质或抗体/蛋白质生物缀合物。疏水相互作用层析的原理是通过使用含水的高盐流动相使蛋白质与树脂结合。盐条件有助于易溶作用，其允许蛋白质与较低表面覆盖度的疏水配体结合。通过降低盐浓度的简单技术洗脱蛋白质。大多数治疗性靶标都在低盐或无盐缓冲液中洗脱。因此，可以在更极性并且较少变性的环境中洗脱化合物。例如，已经将hic广泛地用于分析抗体-药物或蛋白质-药物缀合物的载药量。
nmr测定法
核磁共振(nmr)检测基于某些核具有奇数质子(mass)包括h和13c，以随机方式绕轴旋转的事实。然而，当放置在强磁体的极点之间时，旋转与磁场平行或者反平行排列，其中平行方向是有利的，因为其能量稍微更低。然后，用电磁辐射照射核，电磁辐射被吸收并使平行的核置于更高的能级；因此，它们现在与辐射处于“共振”。由于分子中的全部核都被电子云围绕，所述电子云改变了所包围的磁场，并从而改变了吸收频率，取决于h或c的位置以及邻近分子或者化合物中的元素，每一h或c产生不同的光谱。
质谱法
质谱法是用于测量离子的质荷比(m/z或m/q)的分析技术。通过产生表示样品组分的质量的质谱法，其最常用于分析物理样品的组成。该技术具有几个应用，包括通过化合物和/或其片段的质量鉴定未知化合物、测定化合物中一种或多种元素的同位素组成、通过观察化合物的断裂测定化合物的结构、使用精心设计的方法定量样品中化合物的量(质谱法本身并不是定量的)、研究气相离子化学(真空中离子和中子的化学)的原理，以及使用多种其他方法测定化合物的其他物理、化学或者甚至生物学特性。
质谱仪是用于质谱的设备，并且其产生了样品的质谱，以分析其组成。这通常通过离子化样品并分离不同质子的离子，并且通过测量离子流的强度记录器相对丰度来实现。一般的质谱仪包含三部分：离子源、质量分析器和检测器。
离子源的类型是强烈影响可以通过质谱分析的样品类型的关键因素。将电子电离和化学电离用于气体和蒸汽。在化学电离源中，通过化学电离源中碰撞期间化学离子-分子反应电离分析物。通常将两种技术用于液体和固体生物学样品，包括电喷射离子化(esi)和基质辅助激光解析/离子化(maldi)。其他技术包括快速原子轰击(fab)、热喷雾、大气压化学电离(apci)、次级离子质谱(sims)和热电离。
uv光谱学
紫外-可见光谱法或紫外-可见分光光度法(uv-vis或uv/vis)指紫外-可见光谱区中的吸收光谱法或反射光谱法。其意为它使用可见和邻近(近-uv和近-红外(nir))范围中的光线。可见范围中的吸收或反射直接影响所涉及化学物质的感知颜色。在该区域的电磁波谱中，分子经历了电子跃迁。该技术与荧光光谱学互补，因为荧光处理从激发态至基态的跃迁，而吸收测量了从基态至激发态的跃迁。uv分光光度计是使用来自可见和/或uv光源(着色成红色(coloredred))的光束的仪器，所述可见和/或uv光源通过棱镜或衍射光栅分离成其组分的波长。每一单色(单一波长)光线通过半透明反光镜装置依次分裂成两个等同强度的光束。一束光线(样品光线(着色成红紫色))穿过小透明容器(比色杯)，其含有透明溶剂中存在的待研究化合物的溶液。另外的一束光线(参照(着色成蓝色))穿过仅含有溶剂的相同比色杯。然后通过电子检测器测量这些光束的强度，并进行比较。将应当具有很小的光吸收或者无光吸收的参照光线的强度定义为i0。将样品光束的强度定义为i。短时间后，分光光度计自动以所述方式自动扫描全部组分波长。扫描的紫外(uv)区域通常为200至400nm，并且可见部分为400至800nm。
iv.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，考虑到以上提供的一般说明，可以实践多种其他实施方案。
实施例1：加合物检测
在产生特定重组蛋白质期间，产生了7个用于储存的经过滤的储备物(fbs)，其中7个中的5个储备物获得了针对产品外观标准的一般结果。根据生产说明，产物特异性测试需要使用黄(y)色系列，通过coc测定法评价产物样品，所述coc测定法是用于测定澄清度/乳浊度、显色度和外观的方法。然而，两个储备物(run2和3)呈现为褐色，并且不满足coc测定法期望的≤y7的黄色系列颜色标准。图1中显示了run1-3的coc结果的比较。为了研究该差异，进一步浓缩了7个fbs样品，以增加颜色的强度。针对u.s.pharmacopeia2012(uspmonograph631,colorandachromicity)中和europeanpharmacopoeia5.0(epmethod2.2.2,degreeofcolorationofliquids)中的全部标准比色溶液比较了浓缩的样品，以确认合适的颜色分配。制备参照样品后，将样品在漫射自然光(diffuseddaylight)中比较5分钟，针对黑色背景垂直观察。光的漫射必须使参照样品i可以容易地与水区分，并且参照悬浮液ii可以容易地与参照悬浮液i区分。当在上述条件下检查时，如果液体的澄清度与水r或者所使用的溶剂的澄清度相同，或者如果液体的乳浊度不比参照样品i的乳浊度更显著，那么认为液体是澄清的。
由于run2和3的着色原因未知，所以完成了多个调查研究，以测定非典型性褐色的来源和原因。分析了来自run1-3的样品中的金属、痕量元素(除金属以外)和生色团。这些研究显示，run2和3中观察到的显色并不归因于金属或其他痕量元素(数据未显示)。
为了测定生色团是否与fbs中观察到的不期望颜色相关，使用具有1cm路径比色杯，用紫外和可见(uv/vis)光谱学分析run1-3。对于所分析的样品，uv光谱(200-600nm)并没有显示出任何显著差异。
为了增加uv分光光度计的灵敏度，使用10cm路径比色杯重复了实验。由于样品的吸光度与分光光度计计量光束(meterlightbeam)中吸收分子的数量成比例，所以10cm比色杯相对于1cm比色杯提供了增加的灵敏度。在200-700nm之间扫描样品，以测定run1-3的吸收光谱。run2和3的光谱形状与run1不同：大约在320nm和460nm处观察到了新的吸收峰，其在run1并不明显(图2a)。当将run3的光谱减去run1的光谱时，该差异可以更清楚地观察到(图2b)。run2和3在460nm处观察到的峰与黄素(例如，维生素)指纹图谱一致。
基于10cmuv/vis结果，在来自run1-3的fbs上进行了可选择进行ms检测的rp-hplc和iec全光谱分析。
使用rp-hplc的全光谱检测，run1-3都没有观察到色谱差异(数据未显示)。然而，对于310nm处的iec，观察到了较小差异。如图3中所示，run2和3观察到了主峰后面的小峰，而run1的图谱与参照物质类似。
将完整的样品进行2dlc-ms，并在280nm和310nm处监测。2dlc-ms分析由两部分组成–第一维(dimension)通过rp-hplc分离，并且第二维分级的峰用于质谱分析。根据该实验，观察到了run1的期望质量，并且观察到了run2和3的期望质量和大约+157da的其他质量(图4)。
实施例2：加合物的说明
为了更好地说明加合物，选择run3用于分级分离(收集来自iec测定法的较小峰(图3))并进一步通过2d-lcms以及使用ms检测得到的胰蛋白酶肽图进行质量鉴定来分析该加合物。
根据2dlc-ms分析(图5)，除期望的质量外，再次观察到针对分级的肩峰的大约+156da质量增加。基于样品的在线还原(使用dtt)，观察到了期望的减少的质量。在还原的和天然的分析物之间观察都的4个额外的道尔顿归因于二硫键的破坏以及4个氢的添加。再次观察到额外的质量表明修饰是不可逆的或者共价的。
根据胰蛋白酶肽图，在214nm和310nm处收集样品。如图6中所示，在45-55分钟区域中新的峰是增强的。lc-ms-ms分析48.8分钟310nm处观察到的新峰测定为+154.006da的具有修饰的半胱氨酸残基的t20肽。通过质量提取还检测到了修饰的(在半胱氨酸处，+154.006da)和未修饰的t6和t16肽。没有检测到还原的t21或修饰的t21，但这可能归因于低水平存在。当与参照比较时，在洗脱50至56分钟之间310nm处观察到的其他两个峰并不含有任何独特种类。
收集了1d和2d1hnmr分析，以测定加合物结构。使用toscy(totalcorrelationspectroscopy)、hsqc(heteronuclearsinglequantumcoherence)、hmbc(heteronuclearmultiplebondcorrelation)和roesy(rotating-frameoverhausereffectspectroscopy(noe))获取了其他数据。
tocsy产生了相互偶联的全部质子与给定旋转系统内全部其他质子之间的相关性。hsqc实验使直接结合的核(即两种类型的化学原子核)的化学位移相互关联，而hmbc实验使通过两个或多个化学键相互分离的两种类型核化学位移相互关联。roesy应用使用空间的noe，而不通过化学键来确认精确的分子构型(即，分子的三维结构)。收集的肽在182ppm观察到了芳香族(苯醌)质子与c＝o之间的长距离1h-13c偶联。收集的肽在芳香族区域中的1h-13chsqc化学位移与合成的模式化合物中观察到的那些1h-13chsqc化学位移相当匹配，该合成的模式化合物与萘-1,4-二酮(dione)结合。tocsy指定了产物中的q、v和r共振。如图7中所述，产物的1h-15nhsqc数据与合成肽(nh2-ivqcr-cooh)的比较显示了产物中cysnh相关性的缺失。通过cys的ch与arg的nh之间观察到的强noe确认了提出的结构(图8)。基于收集的nmr数据，图9中显示了推测的结构。
基于ms、nmr和遗传数据，鉴定形成褐色重组蛋白质加合物的有色种类为1,4-二羟基-2-萘甲酸(dhna)。nmr数据确认dhna通过半胱氨酸残基与重组蛋白质连接。dhna是来源于大肠杆菌细胞的甲基萘醌生物合成途径的产物(图10)。甲基萘醌存在于大肠杆菌中，但当培养物处在厌氧和/或微氧条件中时，其产量是增加的。甲基萘醌在有限的氧环境中用于电子传递，并且在厌氧(微氧)条件中用于将形成二硫键的蛋白质dsbb转变成活化的氧化状态。
实施例3：减少dhna-产物加合物形成的hi-do工艺
研发了控制策略，以防止产物的游离巯基产生，以及随后dhna-产物加合物的形成。确认了颜色形成的原因是由于收获操作期间低氧化还原环境，因为run2和3显示出最高的滴度和细胞密度、为了稀释匀浆，进行了较长的保持时间、为了使匀浆达到15℃以下的靶温度，持续了较长的持续时间，并且具有亚最佳匀浆混合时间和速率(数据未显示)。这些因素有助于产生低氧环境，所述低氧环境促进了产物二硫键的还原，并允许了dhna与蛋白质产物的游离巯基连接的可能。
由于dhna-蛋白质加合物是在产生还原性二硫键(即游离巯基)的收获操作期间，在低氧化还原环境中形成的，所以研发了防止游离巯基产生以及dhna-蛋白质加合物形成的方法。这种增强的工艺控制(称为hi-do)在收获操作中使溶解的氧水平维持大于零(>0％)，以消除还原环境(即没有游离巯基产生)。
dhna-蛋白质加合物的形成是复杂的生物学反应，其需要发酵和收获操作期间多个事件的组合。发酵工艺的产出是相当水平的和/或可利用的dhna的产生。一般收获操作的三个主要阶段是：发酵后阶段、匀浆阶段，然后是匀浆后阶段。具体而言，发酵后阶段涉及全细胞培养基(wcb)；匀浆阶段涉及匀浆；匀浆后阶段涉及匀浆(hmg)贮料罐中/匀浆后。
测试了发酵后/匀浆前以及匀浆后的几个工艺步骤，以测定该操作是否可以降低还原环境或减少游离巯基产生。测试的此类工艺增强显示于表1和图12中。
表1.工艺增强(hi-do)
表1和图12中概述的工艺增强的结果显示于表2中。
表2
使用hi-do增强的工艺控制进行的developmentrun的产物质量分析
实施原因分析，以了解褐色的来源。该分析导致了有色种类(dhna)的鉴定，其与重组蛋白质产物的连接、加合物(dhna-蛋白质)结构、其来源，以及在生产工艺期间dhna如何以及何时与产物连接的可能机制。如表1总结，通过在收获操作期间维持溶解氧水平大于零(>0％)来消除还原环境并防止产物游离巯基形成，执行减少策略以防止褐色加合物形成。结果，如通过iec分析所示，由于％不规则峰显示为0％，所以在fbs中没有检测到褐色加合物形成(表2)。
实施例4：产生mene基因缺失的大肠杆菌宿主细胞
除本发明hi-do收获工艺之外，采取了另一方法减少褐色化合物形成。该方法涉及遗传改造原核宿主细胞，以使mene基因从基因组中缺失，从而防止来自甲基萘醌生物合成途径的可能与重组产物连接的任何dhna中间产物的产生。
按照baba等人,constructionofe.colik-12in-frame,single-geneknockoutmutants:thekeiocollection,molecularsystemsbiology,vol.21,p.1-10(2006)(将所述文献并入本文作为参考)中所述的方法，将缺失mene基因的宿主细胞产生为阅读框内单个基因敲除的突变体。使用pcr产物靶向诱变mene基因，所述pcr产物含有位于flp识别靶位点的侧翼的抗性盒(如卡那霉素)以及与邻近染色体序列同源的50个碱基对。
当在37℃，在含30g/ml卡那霉素的luria-bertani培养基(lb)琼脂上需氧培养宿主细胞时，诱变产生了大约10-1000个卡那霉素抗性菌落。
实施例5：使用mene基因缺失的大肠杆菌宿主细胞产生重组蛋白质
测试了mene基因缺失的大肠杆菌宿主细胞产生重组蛋白质的能力，所述重组蛋白质不显示出dhna结合的蛋白质加合物。简言之，根据本领域技术人员熟知的标准技术(参见例如，simmons等人,expressionoffull-lengthimmunoglobulinsine.coli:rapidandefficientproductionofaglycosylatedantibodies,jofimmunolmethods263p.133-147(2002))，使用编码两种重组蛋白质prot1和prot2以及两种重组抗体ab1和ab2的质粒构建体转化mene基因缺失的大肠杆菌细胞。如本文中所述(还参见美国6,979,556，将所述文献并入本文作为参考)进行四种重组蛋白质/抗体的发酵。
通过iec测定法在310nm处，测试了全部四种重组蛋白质/抗体的经过滤储备物重组产物中dhna-蛋白质加合物形成，并且显示没有检测到dhna-蛋白质加合物形成(对于prot1的示例性结果，参见图11)。
令人惊奇地，与使用具有完整的野生型mene基因的大肠杆菌宿主细胞的产量比较，发现由于使用mene缺失大肠杆菌细胞的重组产物的产量明显增加了约20％至50％。
表3-使用mene基因缺失的宿主细胞的重组蛋白质产量
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