一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用的制作方法

本发明涉及一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

果胶是植物细胞壁和中胶层的重要组成部分，主要是直链α-1,4糖苷键连接的d-半乳糖醛酸残基组成的复合多糖，一般带有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、海藻糖、乳糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化物结合在一起，含有20种不同的糖苷键。

果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果胶酶广泛分布在高等植物和微生物中。目前多种微生物来源果胶酶已经进入到商品化应用阶段，销售额可占到微生物酶制剂产值的25%。但是目前商品化的果胶酶多为酸性果胶酶，在碱性条件下活性较弱。碱性果胶酶研究较少，寻找具有特殊性质的碱性果胶酶，并研究其降解条件及最终产物具有重要意义。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有嗜冷（cold-adapted）特性的碱性果胶酶pelv307及其应用。该酶与已有功能的果胶酶的氨基酸相似度仅为56%。最适反应温度为30℃，最适反应ph为8.6；具有嗜冷的特性，在0℃和10℃下的酶活力分别能达到最大反应温度下活性的33.4%和68.6%。该酶降解方式为内切，降解主产物为不饱和二糖和三糖。

一方面，本发明提供一种新型具有嗜冷特性的碱性果胶酶pelv307，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

seqidno.1：

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另一方面，本发明还提供所述果胶酶pelv307对应的核酸序列，如seqidno.2所示。

seqidno.2：

atgtctcaaaaatacctatctctatctctagtttctctagctgttgctggttctatggctctaaactctgcttacgctgcttctctatctactaaccaagaactaactgctgctgacatcggttacgctactgaaaacggtggtactactggtggtgctgacgctgtttctgacaacatctacctagtttctaacaaaactgacttcaaagctgctctaaaagaagacaaaggtgaaccacgtatcatccaaatctctggtactatcgacatctctggtggtgaagaatactctgacttcgacgaccaaaaatctcgttctcaaatcaaaatcccagctgacactactatcatcggtgttacttctgacgctggtttcactaacggttctctagttgtttctaaagttgaaaacgttatcatccgtaacatctctatcgaaactccagttgacgttgaaccacactacgaagacggtgacggttggaacgctgaatgggactctatgactatcacttactctactaacgtttgggttgaccacgttactttcgacgacggttctttcactgacgctgactacgaagaagttgacggtgaagaatacgttcaacacgacggtcaactagacatcaaacacggttctgactacgttactgtttctaactctatcttcaaaaaccacaacaaaactatgctaatcggtcactctaaatctaactcttctgaagacgacggtcacctacgtgttactctagctaacaacatcttctcttctatcatccaacgtactccacgtgttcgtttcggtaaaatccacgttttcaacaacctattcgaaggtgactacaaagacgacacttacggttacatgtactctttcggtctaggttacaaaggttctatcttctctgaaaaaaacatcttcactatcgacaacctaaaagactctaaaaaatgtaaactagtttctgttaaacaatctaactcttctctactagacgacgactctgttttcaacggttcttctctatctctagacgactgtgacatcccaactgacaacctatcttggactgttccatacaactactctctactatctactgacgaactagaagcttctctagaatctaacgctggtgctggtaaactatacctataa

另一方面，本发明还提供一种所述果胶酶pelv307的制备方法。

另一方面，本发明还提供了所述果胶酶pelv307在裂解果胶中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述果胶酶pelv307在制备果胶寡糖中的应用。

另一方面，一种裂解果胶的方法，所选用的果胶酶为所述果胶酶pelv307。

优选：所述裂解条件中反应温度为0~60℃。最适反应温度为30℃。

优选：所述裂解条件中反应ph为3.0~10.6。最适反应ph为8.6。

有益效果：

1.本发明的果胶酶pelv307为结构与功能新颖的酶，归属于多糖裂解酶第1家族（pl-1），其氨基酸序列与已知功能的果胶酶序列相似度最高仅为56%。

2.本发明提供了一种制备该新型果胶酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将果胶酶pelv307的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经摇瓶发酵后，发酵液酶活力高达120.9u/ml。并且该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率达到71.3%，蛋白质纯度高达95%。

3.本发明的果胶酶pelv307具有优良的理化性质，该酶最适反应ph为8.6。并且，其具有嗜冷特性，在0℃和10℃下的酶活力分别能达到最大反应温度下活性的33.4%和68.6%。该酶降解方式为内切，降解主产物为不饱和果胶二糖和三糖

综上所述，本发明所述的果胶酶pelv307具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明果胶酶pelv307与已知功能果胶酶序列之间的进化关系结果；

图2为本发明果胶酶pelv307蛋白质分离纯化图（m，蛋白质标准品；1，纯化所得果胶酶pelv307）；

图3为本发明果胶酶pelv307的温度和ph适应性分析（a，果胶酶pelv307的最适反应温度；b，果胶酶pelv307的温度稳定性；c，果胶酶pelv307的最适反应ph；d，果胶酶pelv307的ph稳定性）；

图4为本发明粘度法检测果胶酶pelv307的降解方式（实线为反应体系粘度变化，虚线为反应体系a235变化）；

图5为高效液相法（a）和阴离子一级质谱法（b）检测本发明果胶酶pelv307的降解产物（dp2，不饱和果胶二糖；dp3，不饱和果胶三糖）。

具体实施方式

实施例1果胶酶pelv307序列分析

本发明所述果胶酶pelv307的产酶基因pelv307为人工合成序列。前期研究中，我们发现海洋细菌vibriosp.hy628具有较高的果胶酶活性，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的果胶酶序列。我们将该基因序列根据宿主（大肠杆菌的）的密码子偏好性，进行了序列优化，并由华大基因公司进行全合成。本发明所述果胶酶pelv307包含有1164个碱基序列，编码387个氨基酸序列。利用nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)中的保守结构域分析conserveddomain(cdd)和多重序列比对basiclocalalignmentsearchtool(blast)发现，该序列包含有一个多糖裂解酶第1家族（pl-1）的保守区。已经报道的果胶酶中，与pelv307氨基酸序列相似度最高的为来源于dickeyachrysanthemi的多糖裂解酶第1家族（pl-1）的果胶酶peld（genbankaaa24854），两者之间的氨基酸序列相似度（identity）为56%。本发明所述的果胶酶pelv307氨基酸序列进行blast分析，将其与已报道的果胶酶，利用clustalx软件进行多重序列比对，并利用mega7.1软件进行进化树分析。如图1所示，果胶酶pelv307与其他已经报道的果胶酶具有较远的亲缘关系，为一个新颖的果胶酶。

实施例2果胶酶pelv307的重组表达

将实施例1中所述的果胶酶pelv307的产酶基因序列以限制性内切酶ndei和xhoi为酶切位点，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点）：

正向引物：seqidno.3：pelv307ef：

5’-catatgtctcaaaaatacctatctct-3’(ndei)

反向引物：seqidno.4：pelv307er：

5’-ctcgagtaggtatagtttaccagcacc-3’(xhoi)

pcr扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。pcr反应所用dna聚合酶为primerstarhs购自大连宝生物公司。

pcr产物用限制性内切酶ndei和xhoi进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的pcr产物。pet24a(+)质粒dna（美国invitrogen公司），同样用限制性内切酶ndei和xhoi进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、dna用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的pcr产物和pet-24a(+)质粒载体参照dna连接酶（大连宝生物公司）说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌dh5α菌株（美国invitrogen公司），涂布在luria-bertani(lb)培养基固体平板上（含有50μg/ml卡纳霉素的），37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至lb液体培养基中（含有50μg/ml卡纳霉素），转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pet-24a(+)-pelv307。重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为bl21(de3)/pet-24a(+)-pelv307，保存在-80℃备用。

实施例3果胶酶pelv307的发酵及纯化制备方法

将实施例2中构建的大肠杆菌bl21(de3)/pet-24a(+)-pelv307转接至lb液体培养基中（50μg/ml卡纳霉素），在37℃摇床中180rpm震荡培养至od600=0.6，加入终浓度为0.1mm的诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg），在20℃诱导20h。果胶酶活性测定方法为：100μl酶液加入900μl0.3%果胶底物（20mmgly-naoh缓冲液，ph=8.6），在30℃下反应10min，用分光光度计测定a235数值。酶活力定义为1ml酶液引起a235数值增加0.1为一个酶活力单位。发酵液酶活力可达120.9u/ml。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液，上样于5ml镍离子亲和层析柱，上样流速为5ml/min，利用10mm咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mm的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到71.3%。纯化所得果胶酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page），如图2所示，纯化所得pelv307的分子量大约为36.5kda，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得果胶酶pelv307的蛋白纯度达到95%以上。

实施例4温度和ph对果胶酶pelv307的影响

将实施例3中纯化所得果胶酶pelv307100μl加入900μl0.3%果胶底物（20mmgly-naoh缓冲液，ph=8.6），在不同温度（0-60℃）下反应10min，用分光光度计测定a235数值，以最高酶活力为100%，计算不同温度下果胶酶pelv307的相对酶活力。如图3a所示，果胶酶pelv307的最适反应温度为30℃。具有嗜冷的特性，在0℃和10℃下的酶活力分别能达到最大反应温度下活性的33.4%和68.6%。

将实施例3中纯化所得果胶酶pelv307（1ml）在不同温度（0-60℃）下孵育1h，取出后，立即在其最适反应温度（30℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3b所示，果胶酶pelv307温度稳定性较差，在30℃下孵育1h，酶即失去大部分活性，利于在反应过程中定向灭活，终止反应。

将实施例3中纯化所得果胶酶pelv307100μl加入900μl0.3%褐藻胶底物（gly-naoh缓冲液，ph=8.6），在4种不同缓冲液中反应10min，用分光光度计测定a235数值，以最高酶活力为100%，计算不同ph条件下果胶酶pelv307的相对酶活力。使用的4种缓冲液分别为50mm磷酸盐缓冲液，甘氨酸-naoh缓冲液，na2hpo4^-柠檬酸缓冲液，tris-hcl缓冲液。如图3c所示，果胶酶pelv307的最适反应ph为8.6。

将实施例3中纯化所得果胶酶pelv307在不同ph条件（3-10.6）下孵育12h，取出后，立即在其最适反应ph（8.6）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3d所示，果胶酶pelv307只在比较狭窄的ph范围内保持稳定。

实施例5果胶酶pelv307降解方式的粘度法检测

使用乌氏粘度计进行降解方式的确定，0.1ml果胶酶pelv307酶液（30u）加入9.9ml0.3%果胶底物，30℃反应不同时间（1、5、10、30、60min），煮沸10min终止反应。在室温条件下，利用乌氏粘度计计算不同酶解时间的产物粘度。同时，利用a235法测定不同酶解时间的产物的吸光度变化，测定对应的酶活力。通过测定结果（图4）可知，酶解反应初期（1-5分钟），产物粘度急剧下降，而此时a235法检测的酶解产物形成的不饱和双键没有急剧增加，说明果胶酶pelv307的酶解方式为内切。

实施例6果胶酶pelv307降解产物的高效液相检测

将实施例3中纯化所得果胶酶pelv307（10u）与0.1%的果胶底物共孵育过夜，降解产物12,000g离心10分钟，弃沉淀，将上清20μl上样至预平衡（0.2m的碳酸氢铵）的凝胶过滤柱（superdexpeptide10/300）。流速为0.6ml/min，流动相为0.2m的碳酸氢铵，检测时间为40分钟，在235nm下检测吸光度。如图5a所示，与标准寡糖出峰时间进行比对发现，果胶酶pelv307的降解产物主要为不饱和果胶二糖和三糖。

实施例7果胶酶pelv307酶解产物质谱（esi-ms）分析

将实施例6中孵育所得样品进行脱盐处理，并与乙腈进行等体积混合，进行阴离子一级质谱检测，确定酶解产物的分子量。阴离子模式一级质谱结果表明（图5b），降解主产物为不饱和果胶二糖和三糖，与hplc检测结果一致。

序列表

<110>青岛大学

<120>一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>387

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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151015

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<213>人工序列(artificialsequence)

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