一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其获得的菌株和应用与流程

本发明涉及螺旋藻的选育与筛选技术领域，具体涉及一种富硒螺旋藻的制备方法，更具体地说，本发明涉及一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其获得的菌株和应用。

背景技术：

硒是人体必需的微量元素，位于多种抗氧化酶的活性中心，具有重要的生理功能和广泛的药理作用。螺旋藻工业化生产技术成熟，对无机硒有较强的耐受性，是对硒进行生物有机化的理想载体，因此获得拥有高富硒能力的螺旋藻对于我国的补硒工业具有十分重要的意义。

硒在人体中主要以硒蛋白形式发挥功能，如维持机体氧化还原平衡、提高免疫力、解除重金属毒性等。我国硒资源分布呈现三个鲜明特点：一是硒资源储备量巨大，总储备量占全球30％以上；二是硒资源分布极为不均，约70％的国土面积属于缺硒地区；三是缺硒人口数量庞大，占全国人口的72％。硒与人体健康密切相关，缺硒会导致克山病、大骨节病的发生。心血管疾病、糖尿病、癌症等疾病也常与缺硒相伴发生。因此合理利用硒资源以解决我国的严重缺硒现状，是当前国家亟需解决的重大问题之一。

环境中的硒多为无机硒，无机硒毒性高、人体利用率差，相对而言有机硒是安全有效的补硒形式，有机硒是指硒与蛋白质、糖类和脂质结合成的有机化合物。微藻是地球上的初级生长者，能通过光合作用将二氧化碳和水转化成有机物，螺旋藻是目前能大规模养殖的微藻之一，其生长周期短、生长速度快、硒蛋白丰富。

cn1085951公开了一种螺旋藻富硒技术，首先在低硒浓度的培养液中驯化培养，筛选出适应此种培养液的藻体，然后置于高硒浓度培养液中进行高富硒藻种的筛选，筛选出的藻株在相同硒浓度下进行连续培养，或将选出的藻株置于硒浓度为700-1000ppm培养液中，培养时间2-24h进行浓缩培养，得到富硒藻泥用清水将多余的无机硒洗掉，洗涤到ph＝7，在温度为60-80℃下烘干或喷雾干燥成为富硒藻粉。但这种方法将浓缩后的螺旋藻置于超高硒浓度(700-1000ppm)培养液中，让其在短时间(2-24h)内快速富硒。首先，700-1000ppm的硒浓度工作液，硒含量非常高，对正常的螺旋藻来说是有毒的，其次，螺旋藻将硒吸收体内并完成生物转化是一个漫长的生物学过程，难于在2h内完成，因此该发明将螺旋藻置于有毒的硒环境中短时间搅拌就制成高富硒藻粉，其富硒效果有待证实。

cn101715986a公开了一种富硒红球藻粉的制备方法及应用，其步骤：a、筛选无机硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系；b、在一定温度、ph值、光照下，利用红球藻培养基进行培养；c、根据雨生红球藻品种对硒耐受性的不同，采用接种培养基中直接加无机硒或当藻细胞达到一定生物量后加入不同量的无机硒，配制高浓度含硒培养基或低浓度含硒培养基；d、藻细胞连续培养后，通过过滤或离心的方法采收，并用清水冲洗新鲜藻泥，洗去藻细胞表面的无机硒。烘干、喷雾干燥或冷冻干燥获得富硒雨生红球藻藻粉。制备的富硒雨生红球藻藻粉硒化合物含量介于10-2000μg/g，有机硒含量达到99％以上。富硒红球藻制品可在制备食品、保健食品和药品中应用。但该发明采用的雨生红球藻是单细胞真核生物，其生长条件要求更苛刻，需要在无菌条件下培养，因此产量很低，大多数企业用该藻种产虾青素；而螺旋藻是多细胞的原核生物，生长速度非常快，可在室外大规模培养。

基于上述理由，提出本申请。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其获得的菌株和应用。本发明通过人工驯化和紫外诱变的方法筛选到1株高富硒的螺旋藻，能高效的将无机硒转化成有机硒，这对我过补硒工业的发展具有十分重要的意义。

为达到本发明上述一个目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取钝顶螺旋藻，先在低浓度亚硒酸钠的培养基中培养，再依次转接到浓度依次递增的高浓度亚硒酸钠的培养基中，直至得到耐受470mg/l亚硒酸钠的钝顶螺旋藻；

(2)将步骤(1)所得耐受470mg/l亚硒酸钠的钝顶螺旋藻超声破碎成单细胞、二细胞或三细胞的藻液；

(3)将步骤(2)所得藻液离心后收集沉淀，并用培养基将沉淀稀释；

(4)将步骤(3)稀释后的藻液装于平板表面，用紫外光照射至致死率＞90％，然后转移至黑暗条件下，过夜；

(5)收集步骤(4)过夜后的藻液、离心、将所得沉淀转移至高亚硒酸钠浓度的培养基中培养，存活下来的细胞即为富硒螺旋藻突变株(藻种)。

进一步地，上述技术方案，步骤(1)所述低浓度亚硒酸钠培养液的浓度为280～360mg/l。

进一步地，上述技术方案，步骤(2)所述超声破碎功率为5～30w，优选为20w；超声破碎时间为20～80s，优选为20s。

进一步地，上述技术方案，步骤(4)所述紫外光照射时间为20～60s，优选为40s。

进一步地，上述技术方案，步骤(4)所述致死率优选采用显微计数法统计。

进一步地，上述技术方案，步骤(5)所述高浓度亚硒酸钠培养液的浓度为600～1500mg/l。

本发明的第二个目的在于提供上述所述利用紫外诱变方法筛选出的富硒螺旋藻突变株。

本发明的第三个目的在于提供上述所述利用紫外诱变方法筛选出的富硒螺旋藻突变株的应用，可用于制备富硒螺旋藻粉。

一种富硒螺旋藻粉，采用如下方法制备而成：

将富硒螺旋藻突变株在28℃、ph＝10、光照强度为40μe·m-²·s-¹条件下，利用zarrouk培养基进行培养；在培养初期加入1000mg/l的na2seo3，培养2周，离心收集，冷冻真空干燥，制得所述富硒螺旋藻粉。

进一步地，上述技术方案，所述zarrouk培养基主要成分包括：13.61g/lnahco3，4.03g/lna2co3，0.5g/lk2hpo4，1g/lk2so4，1g/lnacl，0.2g/lmgso4·7h2o，2.5g/lnano3，0.04g/lcacl2·2h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，1ml/l微量元素a5溶液。

与现有技术相比，本发明涉及的一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其应用具有如下有益效果：

(1)本发明利用超声波将螺旋藻破碎成单细胞或二细胞，然后在紫外诱变的条件下使之发生突变，得到耐受高浓度亚硒酸钠的螺旋藻突变株。本发明采用计数法来计算致死率，相比传统的固体平板涂布法，该方法操作简单、周期短。所得到的富硒螺旋藻突变株对硒的富集能力强，在补硒工业上有较大的应用前景。

(2)紫外诱变正常实施的一个主要因素是要保证致死率在合适的范围之内，致死率太低则达不到突变效果，致死率太高则能存活的细胞数太少。螺旋藻是多细胞串联的生物，目前的文献中没有关于如何计算螺旋藻致死率的报道。本发明通过将多细胞的螺旋藻破碎成单细胞和二细胞的，用显微计数的方法统计数螺旋藻的致死率，为紫外诱变的正常实施提供基础。

附图说明

图1为本发明实施例1～16不同条件超声破碎后的螺旋藻的显微镜照片；

图2为本发明实施例1～16不同条件超声破碎后的螺旋藻的od值对比图；

图3为本发明实施例20中分别采用叶绿素法、od值法、显微计数法致死率计算结果对比图。

具体实施方式

下面结合实施案例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

实施例1

本实施例的一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法，所述方法包括如下步骤：

一、人工筛选

取钝顶螺旋藻spirulinaplatensis(fachb-882,来自中科院淡水藻种库)，先在含有360mg/l亚硒酸钠的培养基中培养，再依次转接到含有370、380、390、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470mg/l亚硒酸钠的培养基中，得到耐受470mg/l亚硒酸钠的螺旋藻，并以此为材料进行紫外诱变。

二、紫外诱变筛选

(1)取od＝1.0人工筛选所得的钝顶螺旋藻，用branson超声波细胞破碎仪(型号450d)，1/8探头，在p(超声波功率)＝40％(20w)条件下，超声破碎20s。

(2)将破碎后的藻液离心5min，转速1000g。

(3)收集沉淀，并用培养基将其稀释至od＝0.3。

(4)取4ml藻液装于平板，紫外照射40s，使螺旋藻致死率＞90％，致死率采用显微计数法计算。

(5)黑暗条件下，过夜。

(6)收集藻液离心5min，转速2500g。

(7)将所得沉淀转移至1000mg/l亚硒酸钠浓度的培养基中，存活下来的细胞即为耐硒螺旋藻藻种。

实施例2

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝40％(20w)条件下，超声破碎时间为40s。

实施例3

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝40％(20w)条件下，超声破碎时间为60s。

实施例4

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝40％(20w)条件下，超声破碎时间为80s。

实施例5

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝30％(15w)条件下，超声破碎时间为20s。

实施例6

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝30％(15w)条件下，超声破碎时间为40s。

实施例7

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝30％(15w)条件下，超声破碎时间为60s。

实施例8

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝30％(15w)条件下，超声破碎时间为80s。

实施例9

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝20％(10w)条件下，超声破碎时间为20s。

实施例10

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝20％(10w)条件下，超声破碎时间为40s。

实施例11

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝20％(10w)条件下，超声破碎时间为60s。

实施例12

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝20％(10w)条件下，超声破碎时间为80s。

实施例13

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝10％(5w)条件下，超声破碎时间为20s。

实施例14

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝10％(5w)条件下，超声破碎时间为40s。

实施例15

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝10％(5w)条件下，超声破碎时间为60s。

实施例16

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(1)中超声波功率p＝10％(5w)条件下，超声破碎时间为80s。

实施例17

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(7)培养基中亚硒酸钠的浓度为600mg/l，最终得到耐受600mg/l亚硒酸钠的螺旋藻。

实施例18

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(7)培养基中亚硒酸钠的浓度为800mg/l，最终得到耐受800mg/l亚硒酸钠的螺旋藻。

实施例19

本实施例的利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法与实施例1基本相同，区别仅在于：紫外诱变筛选步骤(7)培养基中亚硒酸钠的浓度为1500mg/l，最终得到耐受1500mg/l亚硒酸钠的螺旋藻。

螺旋藻为多细胞藻类，其细胞外由内壁、外壁和角质鞘多层结构组成，对紫外线有较强的抵抗能力。因此，在进行紫外诱变前需将螺旋藻破碎成单细胞、二细胞或三细胞。本发明采用超声破碎仪破碎螺旋藻，在功率为10％、20％、30％、40％的条件下分别破碎20s、40s、60s、80s，在显微镜下观察破碎效果，如图1所示。

另外，本发明采用两个指标来评价超声破碎的效果：一个是使多细胞破碎成单细胞、二细胞或三细胞，这个通过显微镜来观察；另一个是使破碎后的细胞尽可能多，这个通过测量破碎后的od值来衡量。

由图1可以看出，在功率＝30％，破碎60s、80s；功率＝40％，破碎20s、40s、60s、80s的条件下均能使螺旋藻破碎成单细胞、二细胞或多细胞。上述条件下，功率＝40％，破碎20s这一条件破碎后得到藻液的od值最高(图2)。因此，采用功率＝40％，破碎20s这一条件对螺旋藻进行破碎。

紫外诱变获得螺旋藻突变株的方法操作简单、周期较短，但螺旋藻为多细胞藻类，其细胞外由内壁、外壁和角质鞘多层结构组成，对紫外线有较强的抵抗能力，因此在进行紫外诱变前需将螺旋藻破碎成单细胞、二细胞或三细胞。致死率是否达到90％是衡量紫外诱变的一个重要条件，传统试验中采取固体涂布法来计算致死率，但该方法周期较长且一些破碎后的单细胞不易在固体平板上生长，本发明中采用显微计数法来计算致死率，能准确、快速计算出螺旋藻的致死率。

螺旋藻照紫外后需要统计致死率，致死率大于90％时才能保证有较多突变体的产生。因此本发明比较了涂平板法、叶绿素法、od值法、显微计数法这四种方法计算致死率的好坏。

实施例20

本实施例做了三次平行实验来比较叶绿素法、od值法、显微计数法这三种方法，实验步骤如下：

(1)取od＝1.0的钝顶螺旋藻，在40％的功率下，超声破碎20s。

(2)将破碎后的藻液离心5min，转速1000g。

(3)收集沉淀，并用培养基将其稀释至od＝0.3。

(4)取4ml藻液装于平板，分别紫外照射0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s、65s、70s。

(5)黑暗放置5d，使死亡的藻降解。

(6)在显微镜下计数，并测od值。用这三种方法统计致死率，结果图3所示。

本发明比较了涂平板法、叶绿素法、od值法、显微计数法这四种方法计算致死率的好坏。

(1)涂平板法：

(2)叶绿素法：

(3)od值法：

(4)显微计数法：

首先是涂平板法，破碎后的螺旋藻在照紫外后，将其涂布在含有高硒浓度的固体平板上，待长成单菌落后计算致死率。但单细胞的螺旋藻在平板上长成肉眼可见的菌落需要二三十天的时间，因此这种方法耗时太久，不适合用来计算致死率。

由图3可以看出，由叶绿素法和od值法得到的致死率随着诱变时间的增加有较大的波动，分析原因是：这两种方法均需通过测量吸光度来计算致死率，但诱变后的藻液浓度很稀，由吸光度来评估藻液的浓度会带来较大的误差。且od值法需测量藻液在560nm波长下的吸光度，而叶绿素法需要测量藻液在665.2nm和652.0nm这两个波长下的吸光度，因此叶绿素法带来的误差更大。由显微计数法得到的致死率随着紫外照射时间的增加而平稳增加，说明显微计数法可以作为评估螺旋藻紫外诱变致死率的方法，且当紫外照射时间为40s时螺旋藻的致死率达到了90％。

应用实施例1

将上述实施例1制得的富硒螺旋藻突变株用于制备富硒螺旋藻粉，方法如下：

(1)将筛选到的螺旋藻在28℃，ph＝10，光照强度为40μe·m-²·s-¹条件下，利用zarrouk培养基进行培养。其培养基主要成分包括：13.61g/lnahco3，4.03g/lna2co3，0.5g/lk2hpo4，1g/lk2so4，1g/lnacl，0.2g/lmgso4·7h2o，2.5g/lnano3,0.04g/lcacl2·2h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，1ml/l微量元素a5溶液。

(2)在培养初期加入1000mg/l的na2seo3，培养2周，离心收集，冷冻真空干燥，制得藻粉。

(3)微波消解后，用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)测其硒含量，硒含量为3517ppm，有机硒占比90％以上。