基于甲基化修饰的肿瘤标记物STAMP-EP7及其应用的制作方法

本发明属于疾病诊断标记物领域，更具体地，本发明涉及基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp(specifictumoralignedmethylationofpan-cancer)及其应用。

背景技术：

肿瘤被认为是一种遗传性疾病的观念在本领域持续几十年。人类几次系统的大规模测序证实了癌组织中体细胞的突变数量明显少于预期，这些结果暗示了癌症并非简单的遗传性疾病。

为了实现肿瘤的诊断，近年来许多新型的肿瘤标记物被发现并用于临床诊断。1980年之前，肿瘤标记物主要是一些激素、酶类、蛋白质等细胞分泌物，例如癌胚抗原(cea)、甲胎抗原(afp)等可以作为胃癌和肝癌等多种肿瘤的标记物，糖类抗原125(ca125)可以作为宫颈癌的标记物，前列腺特异性抗原(psa)可作为前列腺癌标记物，目前这一类肿瘤标记物虽然临床仍在用，但其敏感性与准确性已难以满足临床需求。

越来越多的证据表明，表观遗传调控的细小变化在肿瘤中的重要作用。表观遗传学是研究基因在不发生dna序列改变的情况下，基因功能发生的可遗传的变化，并最终导致了表型的变化的一门学科。表观遗传学主要包括dna甲基化(dnamethylation)，组蛋白修饰(histonemodification)，microrna水平变化等生化过程。dna甲基化是表观遗传学机制之一，其是指生物体内在dna甲基转移酶(dnamethyltransferase，dmt)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(sam)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物中dna甲基化主要发生在5’-cpg-3’的c上，生成5-甲基胞嘧啶(5mc)。

液体活检技术是以血中循环肿瘤细胞或循环肿瘤dna为检测靶标对肿瘤进行诊断和预测的技术。该技术存在诸多不足：首先，敏感性与特异性不够高，肿瘤本身有很大的异质性，包含多种亚型的细胞群，而临床样本尤其是血液样本，肿瘤dna所占比例非常小，现有的肿瘤标记物难以满足临床要求的敏感性，在临床容易造成误诊；其次，一种标记物只针对一种或少数几种肿瘤有较好效果，而血液中的dna来源非常复杂，因此现有的肿瘤标记物无法应对复杂的肿瘤来源、转移等问题。由于这些复杂情况的存在，使得很多dna甲基化肿瘤标记物在应用于临床时难以有统一的使用标准，严重影响标记物的敏感度以及准确性。

在本发明人的前期研究中，找到了一部分基于甲基化修饰的肿瘤标记物，但是，仍然有必要找到更多的新型肿瘤标志物，从而为肿瘤的诊断提供更多的途径。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供以dna甲基化修饰作为肿瘤标记物，利用肿瘤中特异性位点异常高甲基化现象来检测肿瘤的方法。

在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸，包括：(a)seqidno:1所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)(a)的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个修饰的cpg位点(如2～77个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70个)；和/或(c)与上述(a)或(b)的多核苷酸或片段互补的核酸(如seqidno:3所示核苷酸序列的多核苷酸)。

在一个优选例中，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰。

在另一优选例中，(b)中，所述的多核苷酸的片段中存在：seqidno:1中第281～309位(包含017～020号甲基化位点)或第282～308位碱基(包含017～020号甲基化位点)；

seqidno:1中第1～389位碱基(包含001～025号甲基化位点)；或

seqidno:1中第418～970位碱基(包含026～077号甲基化位点)。

在本发明的第二方面，提供分离的多核苷酸，其由所述的多核苷酸转变而来，对应于前述第一方面的序列，其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变，非修饰的胞嘧啶转为t或u。

在一个优选例中，其由对应于前述第一方面的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理转变而来。在另一优选例中，所述的多核苷酸包括：(d)seqidno:2或seqidno:4所示核苷酸序列的多核苷酸；(e)上述(d)的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个修饰的cpg位点(如2～77个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70个)。

在另一优选例中，(e)中，所述的多核苷酸的片段中存在：seqidno:2中第281～309位(包含017～020号甲基化位点)或第282～308位碱基(包含017～020号甲基化位点)；seqidno:2中第1～389位碱基(包含001～025号甲基化位点)；seqidno:2中第418～970位碱基(包含026～077号甲基化位点)；seqidno:4中第662～690位(对应于017～020号甲基化位点)或第663～689位碱基(对应于017～020号甲基化位点)；seqidno:4中第582～970位碱基(对应于001～025号甲基化位点)；seqidno:4中第1～553位碱基(对应于026～077号甲基化位点)。

在本发明的第三方面，提供前述第一方面或第二方面所述的多核苷酸的用途，用于制备肿瘤的检测试剂或试剂盒。

在一个优选例中，所述肿瘤包括(但不限于)：血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；消化系统肿瘤如食道癌(食管癌)，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。

在另一优选例中，所述肿瘤的样本包括但不限于：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。

在本发明的第四方面，提供一种制备肿瘤检测试剂的方法，所述方法包括：提供前述第一方面或第二方面所述的多核苷酸，以所述多核苷酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的cpg位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中存在至少1个(如2～77个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70个)修饰的cpg位点；较佳地，所述的检测试剂包括(但不限于)：引物，探针。

在本发明的第五方面，提供试剂或组合的试剂，其特异性检测靶序列的cpg位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面或第二方面任一所述的多核苷酸的全长或片段，其中存在至少1个(如2～77个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70个)修饰的cpg位点。

在一个优选例中，所述的试剂或组合的试剂针对包含所述靶序列的基因序列(基于所述基因序列而设计)，所述的基因序列包括基因panel或基因群组。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括：引物，探针。

在另一优选例中，所述的引物为：seqidno:3和4所示的引物；seqidno:7和8所示的引物；或seqidno:9和10所示的引物。

在本发明的第六方面，提供本发明的第五方面所述的试剂或组合的试剂的用途，用于制备检测肿瘤的试剂盒；较佳地，所述的肿瘤包括(但不限于)：血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；消化系统肿瘤如食道癌(食管癌)，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。

在本发明的第七方面，提供一种检测试剂盒，其包括：容器，以及位于容器中的前面所述的试剂或试剂组合；较佳地，每一种试剂位于一个独立的容器中。

在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐，dna纯化试剂，dna提取试剂，pcr扩增试剂和/或使用说明书(标明检测操作步骤和结果判定标准)。

在本发明的第八方面，提供一种体外检测样品的甲基化谱式的方法，包括：(i)提供样品，提取核酸；(ii)检测(i)的核酸中靶序列的cpg位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面所述的多核苷酸或由其转变而来的前述第二方面所述的多核苷酸。

在一个优选例中，步骤(3)中，分析的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qpcr法、数字pcr法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、dna富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、hplc法、massarray、甲基化特异pcr(msp)、或它们的组合以及seqidno:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。并且，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。

在另一优选例中，步骤(ii)包括：(1)对(i)的产物进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；(2)分析经(1)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。

在另一优选例中，所述的甲基化谱式异常是指该多核苷酸cpg中的c发生高度甲基化。

在另一优选例中，所述的甲基化谱式的方法不以直接获得疾病的诊断结果为目的，或不是诊断性的方法。

在本发明的第九方面，提供一种肿瘤诊断试剂盒，包括利用本发明的第一方面或第二方面所示序列设计的引物对以及包含该序列的基因panel或基因群组，通过dna甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、seqidno:1区域中001-025甲基化位点肺癌细胞与正常肺细胞甲基化水平bsp验证。图中深色方框表示呈现甲基化。

图2、seqidno:1区域中026～077甲基化位点肺癌细胞与正常肺细胞甲基化水平bsp验证。图中深色方框表示呈现甲基化。

图3、针对白血病临床样本，stamp-ep7在肺癌组织以及癌组织中的甲基化值比较。

图4、针对乳腺癌临床样本，stamp-ep7在癌旁样本以及癌组织样本中的甲基化值比较。

图5、针对直肠癌临床样本，stamp-ep7在癌旁样本以及癌组织样本中的甲基化值比较。

图6、针对食管癌临床样本，stamp-ep7在癌旁样本以及癌组织样本中的甲基化值比较。

图7、针对肝癌临床样本，stamp-ep7在癌旁样本以及癌组织样本中的甲基化值比较。

图8、针对肺癌临床样本，stamp-ep7在癌旁样本以及癌组织样本中的甲基化值比较。

图9、针对胰腺癌临床样本，stamp-ep7在癌旁样本以及癌组织样本中的甲基化值比较。

具体实施方式

本发明人致力于肿瘤标志物的研究，经过广泛的研究筛选，提供一种通用型的dna甲基化肿瘤标志物stamp(specifictumoralignedmethylationofpan-cancer)，在正常的组织中stamp处于低甲基化状态，在肿瘤组织中stamp呈高甲基化状态，可用于临床肿瘤的检测，以及用于作为设计肿瘤诊断试剂的基础。

术语

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“样本”或“样品”包括从任何个体或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于dna甲基化状态检测的物质。例如，所示的样本可以包括但不限于：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。

如本文所用，“高(度)甲基化”是指在一个基因序列中cpg存在高度甲基化、羟甲基化、醛甲基化或羧甲基化修饰。例如，以甲基化特异pcr(msp)分析手段而言，以甲基化特异性引物所进行的pcr反应可获得阳性的pcr结果即可认为该受试的dna(基因)区处于高甲基化状态。例如，以实时定量甲基化特异性pcr而言，高甲基化状态的判定可根据其对照样品的甲基化状态的相对值分析统计学差异。

基因标志物

为了寻找对于诊断肿瘤有用的靶标，本发明人经过了广泛而深入的研究，确定了stamp-ep7这一靶标。stamp-ep7基因序列区域的甲基化状态在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在显著的差异，只要检测到stamp-ep7基因序列区域存在异常高甲基化状态，即可判定该受检者属于肿瘤高危人群。并且，stamp-ep7呈现的这种在在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存的显著差异广谱地存在于不同种类的肿瘤中，包括实体瘤以及非实体瘤。

因此，本发明提供了分离的多核苷酸，所述的多核苷酸，具有seqidno:1或seqidno:3(为seqidno:1的反向互补序列)所示的核苷酸序列，在肿瘤细胞内，该多核苷酸序列中多处5’-cpg-3’的碱基c位置上，生成5-甲基胞嘧啶(5mc)。本发明也包含seqidno:1或seqidno:3所示核苷酸序列的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个(如2～77个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70个)甲基化cpg位点。上述的多核苷酸或片段也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。

在本发明的一些具体实施例中，所述的多核苷酸的片段例如是：包含seqidno:1中第281～309位碱基的片段(含有第017～020号cpg位点)。上述片段的反义链也是可用的。这些片段是本发明的较佳实施方式的举例；根据本发明提供的信息，也可以选择其它的片段。

此外，包含seqidno:1或seqidno:2所示核苷酸序列或序列片段的基因panel或基因群组也被包含在本发明中。针对所述的基因panel或基因群组，也可以通过dna甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。

上述的多核苷酸可以作为基因组中人们分析甲基化状态的关键区域，通过各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态。任何可用于分析甲基化状态的技术均可被应用于本发明中。

上述的多核苷酸在经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。

因此，本发明还提供了上述多核苷酸(包括其互补链(反义链))经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸，包括：seqidno:2或seqidno:4所示核苷酸序列的多核苷酸。这些多核苷酸也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。

本发明也包含上述多核苷酸或其反义链经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个甲基化cpg位点(如2～77个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70个)。反义链中各个cpg位点相应于正义链的编号是根据本发明所提供的内容易于获得的。

检测试剂及试剂盒

基于本发明的新发现，还提供了基于所述的多核苷酸序列设计的检测试剂，用于体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式。本领域已知的确定基因组的序列、其变异及甲基化状态的检测方法和试剂均可被应用于本发明中。

因此，本发明提供了一种制备肿瘤检测试剂的方法，包括：提供所述的多核苷酸，以所述多核苷酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的检测试剂；其中，所述的靶序列中存在至少1个甲基化cpg位点。

本发明所述的检测试剂包括但不限于：引物，探针，等等。

所述的试剂例如是引物对，在得知了多核苷酸的序列后，设计引物是本领域技术人员已知的，两个引物在将被扩增的目标基因特定序列的两侧(包含cpg序列在内，与其中cpg互补为针对原为甲基化的基因区，而与其中tpg互补为针对原为去甲基化的基因区)。应理解，根据本发明的新发现，针对所述靶序列上的不同位置的cpg位点或其组合，本领域技术人员可以设计出多种引物或探针或其它类型的检测试剂，这些均应被包含在本发明的技术方案中。在本发明的优选实施例中，所述的引物为：seqidno:5和6所示的引物，其可以获得包含seqidno:1中001～025号cpg位点的扩增产物；或seqidno:7和8所示的引物，其可以获得包含seqidno:1中026～077号cpg位点的扩增产物；或seqidno:9和10所示的引物，其可以获得包含seqidno:1中017～020号cpg位点的扩增产物。

所述的试剂也可以是试剂组合(引物组合)，包括多于一组的引物，从而可分别扩增上述的多条多核苷酸。

本发明还提供了体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式的试剂盒，该试剂盒包括：容器，以及位于容器中的上述引物对。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取dna、dna纯化、pcr扩增等所需的各种试剂。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。

检测方法

测定多核苷酸的甲基化谱式可通过已有的技术(如甲基化特异性pcr(msp)或实时定量甲基化特异性pcr，methylight)来进行，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。

检测甲基化水平时也可使用定量甲基化特异性pcr(qmsp)的方法。这种方法是基于一种荧光pcr的持续性的光学监控，其较msp方法更为敏感。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。

其他可用的技术还有：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、qpcr法、二代测序法、全基因组甲基化测序法、dna富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术或hplc法以及组合基因群组检测法等该领域常规方法。应理解，在本发明的新揭示的基础上，本领域公知的这些技术以及即将发展的一些技术，均可被应用于本发明中。

作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式的方法。所述的方法基于的原理是：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在后续的pcr扩增过程中转变为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理多核苷酸后，甲基化的位点产生类似于一个c/t的多核苷酸多态性(snp)。基于上述原理来鉴定检测样品中多核苷酸的甲基化谱式，可以有效区分出甲基化与非甲基化的胞嘧啶。

本发明所述的方法包括：包括：(a)提供样品，提取基因组dna；(b)利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组dna，从而基因组dna中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(c)分析经步骤(b)处理的基因组dna中是否存在甲基化谱式异常。

本发明的方法可用于：(i)对受试者样品进行检测，分析受试者是否患有肿瘤；(ii)区分肿瘤高危人群。所述的方法也可以是不以获得直接的疾病诊断结果为目的的情形。

在本发明的优选实施例中，通过pcr扩增及焦磷酸测序法检测dna甲基化，本领域人员应理解，实际应用中并不限于该方法，其它dna甲基化检测方法亦可。在进行pcr扩增中，所应用的引物也不限于是实施例中所提供的。

由于基因组dna经过重亚硫酸盐处理后，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，在后续的pcr过程中又转换为胸腺嘧啶，会降低基因组的序列复杂度，使得pcr扩增出特异目标片段的难度增大。因此优选地可采用巢式pcr扩增，设计外围与内围两对引物，进行两轮pcr扩增反应，以第一轮的扩增产物作为第二轮扩增的模板，可以有效提高扩增的效率与特异性。然而应理解，本发明中可用的检测方法并不限于此。

经过针对临床样本的研究验证，本发明的方法用于诊断临床肿瘤时，准确性非常高。本发明可应用于肿瘤辅助诊断、疗效判定、预后监测等等领域，具有很高的临床应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、针对stamp-ep7检测的核酸序列

本发明人经过广泛的研究，获得一种肿瘤标记物stamp-ep7，其序列如下seqidno:1(chr14:60951977-60952946，human/hg19)所示，其中下划线标示碱基为甲基化cpg位点，下划线下面的数字表该位点的编号。

上述seqidno:1序列经重亚硫酸盐处理后序列如下seqidno:2(其中y代表c或u)：

上述seqidno:1所示核苷酸序列的反向互补序列如下seqidno:3：

上述seqidno:3序列经重亚硫酸盐处理后序列如下seqidno:4(其中y代表c或u)：

实施例2、stamp-ep7cpg位点在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的甲基化差异—亚硫酸氢盐处理后测序法(bsp-bisulfitesequencingpcr)

该亚硫酸氢盐处理后测序法步骤如下：

1、提取肺癌细胞系a549与正常肺细胞系mrc5基因组dna；

2、分别用重亚硫酸盐处理提取的肺癌细胞系a549与正常肺细胞系mrc5基因组dna，作为后续pcr扩增的模板；

3、根据seqidno:1的序列设计扩增引物(seqidno:5～8)，常规方法设计引物进行扩增。

4、pcr扩增之后，2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr片段特异性，切胶回收目的片段，连接插入t载体，转化感受态大肠杆菌，涂菌板，第二天挑克隆测序，每个片段挑取大于10个克隆进行sanger测序；

表1、bsp引物

图1是seqidno:1区域中001～025甲基化位点肺癌细胞与正常肺细胞甲基化水平bsp验证。结果显示，肺癌细胞stamp-ep7甲基化水平显著高于正常肺细胞。

图2是seqidno:1区域中026～077甲基化位点肺癌细胞与正常肺细胞甲基化水平bsp验证。结果显示，肺癌细胞stamp-ep7甲基化水平显著高于正常肺细胞。

实施例3、stamp-ep7cpg位点在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的甲基化差异—焦磷酸测序法(pyrosequencing)

该焦磷酸测序法步骤如下：

1.获取临床样本：从临床获取癌旁/非癌-癌组织样本，癌旁/非癌样本作为对照组，癌组织样本作为肿瘤检测实验组；

2.dna提取：分别提取实验组和对照组dna；本实验用酚氯仿抽提法，但不限于该方法；

3.重亚硫酸盐处理：以重亚硫酸盐处理提取的dna样本，严格按照步骤操作；本实验中用zymoresearch公司的ezdnamethylation-goldkit，货号d5006，但不限于该试剂盒；

4.引物设计：根据stamp-ep7序列seqidno:1特点，设计pcr扩增引物与焦磷酸测序引物，检测017～020号cpg位点的甲基化值，作为stamp-ep7甲基化值的代表，pcr引物扩增序列、焦磷酸测序引物序列、焦磷酸测序上机检测序列如seqidno9～12所示，检测位点列于表2；

5.pcr扩增及琼脂糖凝胶电泳：以重亚硫酸盐处理后的样本作为pcr的模板，进行pcr扩增，扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增的特异性；

6.焦磷酸测序：通过qiagen公司的pyromarkq96id焦磷酸测序仪进行检测，严格按照说明书步骤进行操作；

7.stamp-ep7甲基化值计算：焦磷酸测序可以独立检测出目标区域内单个cpg位点的甲基化情况，计算所有cpg位点甲基化平均值作为stamp-ep7在该样本中的甲基化值；

8.结果分析：比较癌旁/非癌对照组与肿瘤实验组stamp-ep7甲基化值。

表2、pyro引物

实施例4、stamp-ep7：白血病临床样本验证-焦磷酸测序法

从临床获取8例非白血病骨髓涂片样本作为对照组，获取8例白血病骨髓涂片样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组stamp-ep7甲基化水平。

结果如图3，显示在白血病临床样本中，stamp-ep7在实验组中甲基化值显著高于非癌组织。

实施例5、stamp-ep7：乳腺癌临床样本验证-焦磷酸测序法

从临床获取5例乳腺癌癌旁样本作为对照组，获取5例乳腺癌组织样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组stamp-ep7甲基化水平。

结果如图4，显示在乳腺癌临床样本中，stamp-ep7在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。

实施例6、stamp-ep7：直肠癌临床样本验证-焦磷酸测序法

从临床获取8例结直肠癌癌旁样本作为对照组，获取8例结直肠癌样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，分析stamp-ep7甲基化水平。

结果如图5，显示在结直肠癌临床样本中，stamp-ep7在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。

实施例7、stamp-ep7：食管癌临床样本验证-焦磷酸测序法

从临床获取10例食管癌癌旁样本作为对照组，获取10例食管癌样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，分析stamp-ep7甲基化水平。

结果如图6，显示在食管癌临床样本中，stamp-ep7在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。

实施例8、stamp-ep7：肝癌临床样本验证-焦磷酸测序法

从临床获取8例肝癌癌旁样本作为对照组，获取8例肝癌样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，分析stamp-ep7甲基化水平。

结果如图7，显示在肝癌临床样本中，stamp-ep7在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。

实施例9、stamp-ep7：肺癌临床样本验证-焦磷酸测序法

从临床获取4例肺癌癌旁样本作为对照组，获取4例肺癌样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，分析stamp-ep7甲基化水平。

结果如图8，显示在肺癌临床样本中，stamp-ep7在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。

实施例10、stamp-ep7：胰腺癌临床样本验证-焦磷酸测序法

临床获取4例胰腺癌癌旁样本作为对照组，获取4例胰腺癌样本作为实验组，按照实施例3的焦磷酸检验步骤，分析stamp-ep7甲基化水平。

结果如图9，显示在胰腺癌临床样本中，stamp-ep7在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海奕谱生物科技有限公司

<120>基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp-ep7及其应用

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