一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用。

背景技术：

莲子的营养价值较高，它含有丰富的蛋白质、脂肪和碳水化合物。每100g干莲子中含有19.5g蛋白质、1.7g脂肪、58.9g糖类、0.23mg维生素b1、0.05mg维生素b2、7.0mg维生素h、2.8mg维生素e、550mg磷、87mg钙、14.5mg钾、9mg锰、3.2mg锌。磷可以帮助机体进行蛋白质、脂肪、糖类代谢和酸碱平衡；莲子中的钾元素含量位居所有动植物食品前列，对维持肌肉的兴奋性、心跳规律和各种代谢有着重要作用。此外，莲子中还含有丰富的磷脂、生物碱和类黄酮等营养保健成分。

莲子具有很高的保健价值，是滋补元气的珍品。早在汉朝，《神农本草经》便将其奉为上品，认为莲子味甘、涩，性平，具有镇静安神、补中益气、养心益肾、健脾养胃、清腑润脏、聪耳明、湿肠止泻的功效，可用于病后或产后脾胃虚弱的治疗。莲子有养心安详的功效，中老年人特别是脑力劳动者经常食用，可以健脑、增强记忆力、提高工作效率，并能预防老年痴呆症的发生。从莲子芯中提出的莲芯碱结晶，具有降压功效；莲子芯味道苦，却有显著的强心作用，能扩张外周血管，降低血压；莲子芯还有很好的去心火功效，可以治疗口舌生疮，并有助于睡眠。中医认为，莲子有益心补肾、健脾止泻、固精安神的作用。莲子适宜体质虚弱、心慌、失眠、多梦和遗精者食用；适宜脾虚气虚、慢性腹泻的人食用；适宜癌症病人及其放疗化疗后食用；适宜妇女脾肾亏虚、白带过多的人食用；对于久病、产后或老年体虚者，莲子更是常用营养佳品。

莲子在我国有着悠久的种植和食用历史，资源十分丰富，其营养保健价值广为人知，是农产品深加工及保健食品的优良资源。大力发展莲子深加工，对于充分利用我国莲子资源、扩大其产品用途、改善人们膳食结构、提高农民收入有着较大的经济及现实意义。目前的莲子加工产品有莲子汁饮料、莲子蜜饯、混合型营养莲子糊、莲子泥、莲子酱、莲子罐头、莲子软糖、以及蒸馏型莲子酒等。

蒸馏型莲子酒属于白酒的一种，由于蒸馏作用，产品中只含有挥发性组分(主要为水、乙醇及微量的酯类、其他醇类等物质)，而莲子中上述的大量营养成分没有被保留；另外，蒸馏型莲子酒中乙醇含量过高，不适合于大多数妇女及年老体弱者饮用。目前国内外还没有关于过滤型莲子酒的报道，更没有商业化的产品。研究开发过滤型莲子酒具有重要实际应用价值，筛选合适的酵母菌种是这项技术的关键。

技术实现要素：

针对上述现状，本发明提供一株酵母菌及其在莲子酒发酵中的应用方法及发酵工艺。

本发明提供的汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为cctccm2018683，保藏日期为2018年10月15日。

本发明提供一株汉逊酵母，并利用这株汉逊酵母发酵制备莲子酒。通过对本发明菌株的18srdna进行测序，并将本发明菌株的18srdna序列与ncbi数据库中已收录的酵母菌株的18srdna序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的18srdna序列与已知汉逊酵母(hanseniaspora)属菌株的18srdna序列的同源性大于99％。本发明菌株的18srdna序列已提交到genbank数据库中，登录号为mk886519。

采用本发明提供的汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1，在莲子酒发酵中的应用方法及发酵工艺涉及的实施步骤如下：

步骤1)原料预处理：将莲子粉碎，用60目的筛子筛分，取筛得的细组分加入水，配成30％(质量比)的莲子粉悬浊物；用氢氧化钠溶液调节ph至7.0，边搅拌边升温至80℃，糊化作用20min；待温度降低至70℃，加入α-淀粉酶液化1h，α-淀粉酶的加入量为10u/g；液化结束，降低温度至60℃，用盐酸溶液调节ph至4.5，加入γ-淀粉酶糖化4h，γ-淀粉酶的加入量为400u/g；待温度降至42℃，用氢氧化钠溶液调节ph至8.5，加入中性蛋白酶水解作用5h，中性蛋白酶的加入量为4000u/g；

步骤2)菌种活化：将本发明提供的菌株汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1划线接种到yepd固体培养基上，置于30℃的恒温箱中培养8–12h，至菌落生长丰满，所述yepd固体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖、17g琼脂粉；

步骤3)制备液体种子：用接种环挑取步骤2)获得的菌落，接种到yepd液体培养基中，采用体积为250ml的玻璃三角瓶，装液量为50ml，置于30℃的摇床中，120rpm培养9–11h，所述yepd液体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖；

步骤4)莲子发酵：将步骤3)所得汉逊酵母液体种子按照5％的接种量接入到步骤1)所得的水解物中进行30℃发酵，采用体积为100ml的玻璃三角瓶，每瓶装有40g水解物，并补加30g无菌水，瓶口用带有砂芯的硅胶塞塞住；三角瓶首先在转速为120rpm的摇床中发酵10h，然后静置发酵24h；

步骤5)获得莲子酒并检测：将步骤4)所得的发酵醪液以9000rpm离心10min，取上清用硅藻土过滤，得到莲子酒；取5.0g莲子酒，用1.6g的二氯甲烷萃取，将有机相12000rpm离心10min后采用气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)检测，以正己醇为内标，采用tg-sqc型(0.25mm×0.25μm)色谱柱，柱温以40℃保持3min，然后以10℃/min升至260℃，并在260℃保持5min，进样口温度设置为220℃，以氦气作为载气，质谱离子源采用70ev电子轰击模式，扫描范围设置为20-400amu。

利用本发明所述汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1，采用上述发酵方法制备得到的莲子酒，经过gc-ms检测，莲子酒中的特征风味物质为苯乙醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、苯乙醇乙酸酯，含量分别为25mg/l、6.5mg/l、6.5mg/l。乙醇含量测得3.5％，比较适合女士和老人等消费者。苯乙醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯和苯乙醇乙酸酯是安全的食品香料，赋予莲子酒玫瑰花香、酯香、水果香等悦人的香气。采用本发明方法制备的过滤型莲子酒，呈金黄色，色泽诱人，十分清亮，具有诱人的香气；莲子酒入口有莲子的清香，并带有淡淡的酸味和苦味，口感上佳。

附图说明

图1是汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1cctccm2018683在光学显微镜下观察的照片；

图2是由汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1cctccm2018683发酵制备的莲子酒经gc-ms测得的苯乙醇的质谱图；图3是由汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1cctccm2018683发酵制备的莲子酒经gc-ms测得的3-甲硫基丙醇乙酸酯的质谱图；图4是由汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1cctccm2018683发酵制备的莲子酒经gc-ms测得的苯乙醇乙酸酯的质谱图。

具体实施方式

实施例1：菌株富集筛选与分离纯化

1.1环境样品采集

从本地超市购得几种不同品种的苹果。

1.2菌株初筛

将购买的苹果切成小块，用料理机打碎成糊状，转移至250ml的三角瓶中，用封口膜封口，室温下(约25℃)自然发酵48h。将上述样品加入到无菌水中，快速搅拌并自然沉降10min，然后取上清液适当稀释后涂布到yepd固体培养基上，在30℃培养8–12h。挑取单菌落，经多次划线分离纯化得到纯的菌株。所述yepd固体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖、17g琼脂粉。

1.3菌株复筛

将上述实验得到的纯的菌株，接种到复筛培养基中，在30℃摇瓶培养24h，用gc-ms检测产物，得到能产生良好风味物质的菌株。所述复筛培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖。

经过复筛，发现1个菌株产生的物质香味清香怡人，将此菌株命名为pt-1，即为本发明菌株。将得到的目的菌株采用斜面传代法、低温甘油法、低温真空干燥法等常规方法保存备用。

实施例2：菌株鉴定与保藏

本发明提供一株汉逊酵母，并利用这株汉逊酵母发酵制备莲子酒。通过对本发明菌株的18srdna进行测序，并将本发明菌株的18srdna序列与ncbi数据库中已收录的酵母菌株的18srdna序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的18srdna序列与已知汉逊酵母(hanseniaspora)属菌株的18srdna序列的同源性大于99％。本发明菌株的18srdna序列已提交到genbank数据库中，登录号为mk886519。

本发明菌株汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1已于2018年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2018683。

实施例3：采用汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1在莲子酒发酵中的应用方法及发酵工艺

3.1原料预处理

将莲子粉碎，用60目的筛子筛分，取筛得的细组分加入水，配成30％(质量比)的莲子粉悬浊物。用16％的氢氧化钠溶液调节ph至7.0，边搅拌边升温至80℃，糊化作用20min。待温度降低至70℃，加入α-淀粉酶液化1h，α-淀粉酶的加入量为10u/g干淀粉。液化结束，降低温度至60℃，用盐酸溶液调节ph至4.5，加入γ-淀粉酶为400u/g干淀粉进行糖化，糖化时间为4h。待温度降至42℃，调节ph至8.5，加入中性蛋白酶4000u/g，水解作用5h。

3.2活化菌株

将本发明提供的菌株汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1划线接种到yepd固体培养基上，置于30℃的恒温箱中培养8–12h，至菌落生长丰满。所述yepd固体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖、17g琼脂粉。

3.3制备液体种子

用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到yepd液体培养基中。采用体积为250ml的摇瓶，装液量为50ml，置于30℃的摇床中，120rpm培养9–11h。所述yepd液体培养基每升中含有：20g蛋白胨、10g酵母粉、20g葡萄糖。

3.4莲子发酵

将上述第三步获得的液体种子按5％体积比接种到经过上述第一步处理得到的水解物中进行发酵。发酵采用体积为100ml的玻璃三角瓶，每瓶装有40g水解物，并补加30g无菌水，三角瓶瓶口用带有砂芯的硅胶塞塞住，砂芯中有微孔可以通气，但能防止空气中的杂菌污染。三角瓶先在30℃、转速为120rpm的摇床中发酵10h；然后静置，30℃继续发酵24h，结束发酵。成熟的发酵醪液以9000rpm离心10min，取上清用硅藻土过滤，得到莲子酒。

3.5莲子酒的检测

取5g上述第四步获得的莲子酒，用1.6g二氯甲烷萃取，将有机相(下层)12000rpm离心10min，取纯净的有机相进行气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)检测发酵产物。具体方法为：用正己醇作为内标，采用tg-sqc型(0.25mm×0.25μm)色谱柱，柱温以40℃保持3min，然后以10℃/min升至260℃，并在260℃保持5min。进样口的温度为220℃，载气为氦气，ms采用70ev电子轰击模式，扫描范围20-400amu。

利用本发明所述汉逊酵母hanseniasporasp.pt-1，采用上述发酵方法制备得到的莲子酒，经过gc-ms检测，莲子酒中的特征风味物质为苯乙醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、苯乙醇乙酸酯，含量分别为25mg/l、6.5mg/l、6.5mg/l。乙醇含量测得3.5％，比较适合女士和老人等消费者。苯乙醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯和苯乙醇乙酸酯是安全的食品香料，赋予莲子酒玫瑰花香、酯香、水果香等悦人的香气。采用本发明方法制备的过滤型莲子酒，呈金黄色，色泽诱人，十分清亮，具有诱人的香气；莲子酒入口有莲子的清香，并带有淡淡的酸味和苦味，口感上佳。