一株铜绿假单胞菌噬菌体及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株能够特异性裂解铜绿假单胞菌菌株的噬菌体分离物及其应用。

背景技术：

水貂出血性肺炎是由铜绿假单胞菌引起的一种急性传染病，发病迅速，不易控制，曾在多个国家和地区呈地方性流行，导致大批水貂死亡，造成了严重的经济损失。铜绿假单胞菌存在自然性和获得性多种机制从而可抵抗多种抗生素，这些机制包括外排泵、抗生素降解、修饰酶系统及降低膜渗透性的功能等，很容易使该菌产生耐药性且临床分离的许多株铜绿假单胞菌表现出对多种抗生素同时耐药。污染铜绿假单胞菌的肉类饲料和患畜的粪便、尿、分泌物以及污染的水源和环境，都是该病的传染源，主要通过口腔和鼻等呼吸道感染该病。而集约化养殖环境，增加了水貂感染铜绿假单胞菌病的机会。

噬菌体是一类能特异性感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体的病毒，可以从污水、粪便以及土壤等自然环境中分离得到。噬菌体具有严格的宿主特异性，铜绿假单胞菌噬菌体只特异性感染铜绿假单胞菌，对人、动物和植物没有感染作用，所以噬菌体具有安全性的特征，对人和动植物没有感染作用。噬菌体是一类病毒，只能依附于相应的宿主菌存在。当噬菌体与相应的宿主菌接触后，就会吸附在宿主菌表面并侵入宿主菌细胞内，在胞内进行增殖，之后裂解细菌释放更多的噬菌体。噬菌体裂解细菌具有高效的特点，一个噬菌体颗粒感染宿主菌后能迅速生成几百个子代噬菌体颗粒，每个子代噬菌体颗粒又可感染细菌释放更多的子代噬菌体，如此重复只需4次，一个噬菌体颗粒便可使几十亿个细菌裂解死亡，所以噬菌体能够作为一种具有杀菌作用的高效生物消毒剂和药物。

噬菌体消毒试验有过报道，但是通过口服能够入血的噬菌体未见报道。本发明中应用的噬菌体单次口服后能持续存在8h，且动物体内带有铜绿假单胞菌时，存在时间更长，含量会逐渐升高，且该噬菌体还能对动物体内的铜绿假单胞菌有明显的抑制杀灭作用。

技术实现要素：

本发明提供了一株能够通过口服、肌肉注射、腹腔注射入血的噬菌体及其应用，旨在解决养殖场因水貂出血性肺炎发病急而治疗不及时，且因致病菌耐药性而导致用药无效等困难。水貂的抗生素治疗面临严重的细菌耐药性问题，铜绿假单胞菌存在多种耐药机制，很容易产生耐药性。国内的研究者做过很多类似的噬菌体消毒试验，但是没有既有环境消毒作用又能通过口服、肌肉注射、腹腔注射入血的噬菌体研究，本发明提供的噬菌体不仅能通过多种方式入血，还能对水貂体内的铜绿假单胞菌起到抑制和杀灭作用，从而达到保健、预防和治疗等多方面的良好效果。

本发明的目的在于提供一株具有口服、肌肉注射、腹腔注射入血能力的铜绿假单胞菌噬菌体，该噬菌体的单体为铜绿假单胞菌噬菌体，拉丁名p.aeruginosaphage，被命名为asp11，对铜绿假单胞菌有广谱的杀菌能力，噬菌体asp11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年9月26日，保藏编号为cgmccno.16395。

该噬菌体对铜绿假单胞菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及其用于环境消毒和噬菌体防治由铜绿假单胞菌引起的毛皮动物的出血性肺炎提供了噬菌体来源。

该噬菌体可用于工业生产，可由宿主菌特异性扩增，可作为生物消毒剂应用于毛皮动物或禽类饲养场以及动物饲养、食品、药品、医疗器械厂、医院等其他人类活动场所的环境消毒剂。

该噬菌体作为饲料添加剂添加入水貂的饲料中，对水貂体内的铜绿假单胞菌具有明显的抑制杀灭效果，能有效预防铜绿假单胞菌引起的水貂出血性肺炎病的发生。

该噬菌体可通过口服、肌肉注射、腹腔注射途径给水貂用药，1h即可在血液中检测到噬菌体，能够在血液中存在3d以上，且能够进入肝脏和肺脏等脏器，为治疗铜绿假单胞菌引起的毛皮动物出血性肺炎提供新型药物。

噬菌体asp11经双层平板法以51株各种来源的铜绿假单胞菌(水貂、狐狸、牛、猪、禽类、兔等)为对象，测定出噬菌体asp11可以裂解51株铜绿假单胞菌中的44株，宽噬率为86.27％，这一结果说明该噬菌体是多价烈性噬菌体且具有较强的广谱性，在临床预防和治疗上具有良好的应用前景。

本发明一个方面提供了一种铜绿假单胞菌噬菌体，拉丁名p.aeruginosaphage，被命名为asp11，保藏编号为cgmccno.16395。

本发明另一个方面提供了所述铜绿假单胞菌噬菌体在制备预防和或治疗铜绿假单胞菌引起的疾病的药物中的用途。

本发明另一个方面提供了所述铜绿假单胞菌噬菌体在制备预防和或治疗铜绿假单胞菌引起的疾病的饲料中的用途。

本发明另一个方面提供了所述铜绿假单胞菌噬菌体在制备预防和或治疗铜绿假单胞菌引起的疾病的食品添加剂中的用途。

本发明另一个方面提供了所述铜绿假单胞菌噬菌体在制备杀灭环境中铜绿假单胞菌消毒剂或作为处理包含中铜绿假单胞菌的动物粪便、尸体、地面、水源、水槽、料槽、笼具的无害化生物试剂中的用途。

本发明另一个方面提供了一种预防和或治疗铜绿假单胞菌引起的疾病的药物，其有效成分包括本发明所述的铜绿假单胞菌噬菌体，优选地，所述的铜绿假单胞菌噬菌体作为唯一活性成分。

在本发明的技术方案中，所述的药物为口服药物、肌肉注射药物、腹腔注射药物。

本发明另一个方面提供了一种预防和或治疗铜绿假单胞菌引起的疾病的饲料，其有效成分包括本发明所述的铜绿假单胞菌噬菌体，优选地，所述的铜绿假单胞菌噬菌体作为抗铜绿假单胞菌噬菌体的唯一有效成分。

本发明另一个方面提供了一种预防和或治疗铜绿假单胞菌引起的疾病的添加剂，其有效成分包括本发明所述的铜绿假单胞菌噬菌体。

本发明另一个方面提供了一种杀灭铜绿假单胞菌的消毒剂，其有效成分包括本发明所述的铜绿假单胞菌噬菌体，优选地，所述的铜绿假单胞菌噬菌体作为唯一活性成分。

在本发明的技术方案中，所述的铜绿假单胞菌引起的疾病选自动物出血性肺炎、化脓性肺炎、败血症、皮肤病、子宫内膜炎、乳房炎。

在本发明的技术方案中，所述的铜绿假单胞菌引起的疾病选自毛皮动物来源的铜绿假单胞菌引起的疾病，其中毛皮动物来源优选为水貂源、狐狸源、牛源、猪源、兔源、禽类等动物来源。

在本发明的技术方案中，所述的环境中铜绿假单胞菌为动物饲养、食品、药品、医疗器械厂、医院以及其他人类活动场所中的铜绿假单胞菌。

本发明提供了一株能够过口服、肌肉注射、腹腔注射入血的噬菌体及其应用，该噬菌体对铜绿假单胞菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产噬菌体及其用于环境消毒及噬菌体预防和治疗铜绿假单胞菌引起的毛皮动物出血性肺炎提供了噬菌体来源；该噬菌体可用于工业生产，可由宿主菌铜绿假单胞菌特异性扩增；该噬菌体还可以作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒和动物体表的消毒，从而治疗动物养殖场污染；该噬菌体还可作为一种药物用于铜绿假单胞菌引起毛皮动物的出血性肺炎的预防和治疗。

附图说明

图1电镜下观察噬菌体asp11形态图。

图2噬菌体asp11热稳定性图。

图3噬菌体asp11ph稳定性图。

图4噬菌体asp11对66-1杀灭效果时效图(体外裂解)。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐明本发明。应当理解为，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例1噬菌体的分离培养和生物学特性

(一)菌种的复苏培养和菌悬液的制备

挑取铜绿假单胞菌的冻存菌液在nac平板上三区划线，分离单菌落，37℃恒温箱中培养16～24h。挑取单菌落，接种5mlnb肉汤中，37℃空气振荡器中，170rpm振荡培养16h，得到单一的菌悬液。

(二)噬菌体的分离与纯化

取粪样、垫料、污水以及皮毛等样品装入盛有nb肉汤的三角瓶中，每个三角瓶中按照1％的量加入各株铜绿假单胞菌，搅拌均匀后，于37℃的空气振荡器中，170rpm振荡培养过夜，10000rpm离心5min，0.22μm的细菌滤器过滤除菌。将滤液和宿主菌混合，37℃孵育5min后倒双层平板，待凝固后放入37℃的恒温箱中倒置培养，6～8h后观察结果。若有噬菌体存在，则会在培养基上形成透明、规则的圆形空斑，即为噬菌斑。抠取单个噬菌斑，于1mlnb肉汤中，37℃的空气振荡器中孵育30min，10000rpm离心5min，取上清再用双层平板法得到单个的噬菌斑，如此重复3～5次直至得到大小、形态一致的噬菌斑，并将该噬菌体命名为asp11。噬菌体asp11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年9月26日，保藏编号为cgmccno.16395。

(三)噬菌体的增殖和效价测定

各取100μl宿主菌和噬菌体抠斑浸出液加入到5ml营养肉汤中，37℃的空气振荡器中，170rpm培养3～4h，待混合液变澄清，得到噬菌体增殖液。10倍倍比稀释噬菌体增殖液，双层平板法测效价，每个稀释度分别做3个平行样。计数时，观察平板中的噬菌斑取30～300之间的平板来计数，计算效价。

取稀释度为10-⁷的3个平行样计数，结果分别为：87、92、89个噬菌斑，计算效价为8.9×10⁹pfu/ml。

(四)透射电镜观察噬菌体的形态

取高于1×10⁸pfu/ml噬菌体样品20μl滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μl的2％的磷钨酸(pta)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照。形态结果参见附图1。

结果可见asp11为头部直径60nm左右的多面体的短尾噬菌体。

(五)噬菌体的热稳定性检测

将1.02×10¹⁰pfu/ml的噬菌体asp11增殖液分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，水浴中作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组。双层平板法测定噬菌体的效价。

结果可见噬菌体asp11在40℃和50℃作用1h后基本保持原活性；60℃作用1h后仍保持在6.18×10⁹pfu/ml以上；70℃作用20min效价下降4个数量级，1h后效价降低6个数量级；80℃的高温作用下，20min噬菌体基本失活。具体结果参见附图2，由此可见噬菌体asp11的热稳定性较高。

(六)噬菌体的ph稳定性检测

取无菌试管中加入不同ph值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的nb肉汤4.5ml，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl1.02×10¹⁰pfu/ml的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的hcl或者naoh使混合液的ph值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。

具体结果参见附图3，结果可见在ph5～11范围内噬菌体asp11效价几乎没变或略有降低，仍然在10⁹pfu/ml以上，ph为4时，3h，效价下降1个数量级，可见该噬菌体对ph的适应范围较广。

(七)噬菌体的最佳感染复数(moi)测定

按照常规方法增殖铜绿假单胞菌噬菌体asp11和宿主菌绿脓杆菌，测定噬菌体及宿主菌效价，并将噬菌体asp11和宿主菌进行适当的稀释。按照感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001的比例各取100μlasp11和宿主菌加入到nb肉汤中。于37℃，170rpm振荡培养至液体变澄清，记录液体变澄清时间。10000rpm离心5min，双层平板法测定噬菌体的效价，结果如表1。

表1噬菌体的最佳感染复数(moi)测定结果

结果可见噬菌体的最佳感染复数是0.00001，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为2.95×10¹⁰pfu/ml，在9个感染复数中噬菌体滴度最高。

实施例2噬菌体裂解谱的测定和体外裂解试验

(一)噬菌体裂解谱的测定

采用单斑法测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：按照实施例1中的方法得到宿主菌的菌悬液，51株铜绿假单胞菌分别来源于水貂、狐狸、牛、猪、禽类、兔等动物。将100μl的菌悬液加入上层琼脂中制备双层平板，待琼脂凝固后，分别取1μl的噬菌体增殖液滴于平板上，待自然干燥后置于37℃的恒温箱中倒置培养6～8h后观察结果。

结果显示，用51株铜绿假单胞菌为宿主菌进行裂解谱的测定，噬菌体asp11能裂解其中的44株，裂解率达86.27％。

(二)asp11对绿脓杆菌菌株体外裂解试验(od值法)

按照一定的比例加入绿脓杆菌菌株和噬菌体asp11，绿脓杆菌菌株的终浓度为1.00×10⁸cfu/ml，噬菌体的终浓度分别为1.00×10⁹pfu/ml，1.00×10⁸pfu/ml，1.00×10⁷pfu/ml，1.00×10⁶pfu/ml，对照组加入与噬菌体相同量的无菌肉汤，菌液和噬菌体混合后在37℃，170rpm的摇床内振荡培养。每隔一定的时间测定od值直至混合液变清亮，涂布平板法测定作用一定时间后各组菌的残留量。

结果可见asp11对绿脓杆菌菌株的裂解效果很好，4个不同浓度的噬菌体对绿脓杆菌菌株的裂解效率都可以达到99.80％以上，只是时间长短不同，但是4h以内都能够达到较好的杀灭效果，具体数据见表2和表3。

表2各时间段od值变化

表3od值测定结束后测定菌残留量

实施例3噬菌体的安全性试验

选择12只体重为18～20g的健康balb/c小鼠20只，雌雄各半，分成实验组和对照组，每组小鼠雌雄各半，分别灌服纯化的噬菌体增殖液(200μl10¹⁰pfu/ml)和生理盐水(200μl)，连续灌服7d，观察小鼠的行为表现，并剖检观察小鼠脏器的变化。

结果可见，实验组和对照组小鼠行为无异常，剖检肝脏、肺脏、心脏、脾脏、肾脏等脏器正常，与对照组无明显差别。

实施例4噬菌体在水貂血液中的动力学

(一)通过拌料饲喂方式给噬菌体在水貂血液中的动力学

选择1～2kg的健康水貂，试验前水貂后肢趾间静脉采血300μl，测定血液中噬菌体效价，确认无噬菌体asp11存在时，每只貂饲喂一次10g拌有1ml10¹⁰pfu/ml的asp11的饲料。隔一定的时间采血，测定血液中噬菌体的含量。

结果显示，饲喂前血液中无噬菌体asp11，噬菌体asp11单次拌料饲喂后，血液中1h时就可以检测到噬菌体，最高效价可以达到10⁵pfu/ml，血液中噬菌体可以持续存在8h。

(二)通过腹腔注射方式给噬菌体在水貂血液中的动力学

选择1～2kg的健康水貂，试验前水貂后肢趾间静脉采血300μl，测定血液中噬菌体效价，确认无噬菌体asp11存在时，腹腔注射2ml10¹⁰pfu/ml的asp11，隔一定的时间采血，双层平板法测定血液中噬菌体的含量。

结果显示注射噬菌体asp11后2h即可检测到9.47×10⁴pfu/ml噬菌体，26h可达最高9.67×10⁵pfu/ml，34h仍可维持在5.09×10⁵pfu/ml。

(三)通过肌肉注射方式给噬菌体在水貂血液中的动力学

选择1～2kg的健康水貂，试验前水貂后肢趾间静脉采血300μl，测定血液中噬菌体效价，确认无噬菌体asp11存在时，肌肉注射1ml10¹⁰pfu/ml的asp11，隔一定的时间采血，双层平板法测定血液中噬菌体的含量。

结果显示，注射噬菌体asp11后2h即可检测到4.29×10⁷pfu/ml噬菌体，11h可达最高1.76×10⁸pfu/ml，58h仍可维持在1.06×10⁴pfu/ml。

实施例5噬菌体在体内对铜绿假单胞菌增殖的抑制试验

选择1～2kg的健康水貂，20只水貂，10只公貂，10只母貂，分为2组，每组公母各一半。试验前水貂后肢趾间静脉采血300μl，双层平板法测定血液中噬菌体效价，确认无噬菌体asp11存在时，每只貂饲喂10g拌有1ml10¹⁰pfu/ml的asp11的饲料，对照组每只水貂饲喂10g拌有1ml生理盐水的饲料，饲喂噬菌体1h后，实验组和对照组20只水貂按照4×10⁸cfu/800g的量腹腔注射铜绿假单胞菌临床分离菌株，攻菌后分别间隔2h、3h、4h、4h、4h分5次分别采血、处死、剖检，空白组单独饲喂等量的拌有噬菌体的饲料，分别利用双层平板法测定噬菌体的含量，利用平板涂布法测定铜绿假单胞菌的浓度。血液中噬菌体及铜绿假单胞菌的平均含量如表4。

表4水貂血液中噬菌体和铜绿假单胞菌的含量

结果显示，噬菌体在水貂体内存在铜绿假单胞菌时的血液中的效价高于只饲喂噬菌体的效价，其效价可以达到10⁶pfu/ml，而且处于高效价的持续时间较长，达17h。与对照组相比，噬菌体饲喂组水貂体内菌的含量明显降低达3个滴度。说明该噬菌体不仅能够进入水貂血液，还会对水貂体内的铜绿假单胞菌产生抑制杀灭作用。

实施例6噬菌体治疗铜绿假单胞菌感染水貂保护率测定

选择1～2kg的健康水貂，20只水貂，10只公貂，10只母貂，分为2组，每组公母各一半。试验前水貂后肢趾间静脉采血300μl，双层平板法测定血液中噬菌体效价，确认无噬菌体asp11存在时，每只貂饲喂10g拌有1ml10¹⁰pfu/ml的asp11的饲料，对照组每只水貂饲喂10g拌有1ml生理盐水的饲料，饲喂噬菌体1h后，实验组和对照组20只水貂按照4×10⁸cfu/800g的量腹腔注射攻毒菌株临床分离菌株。观察并记录水貂的死亡情况，连续观察7d，对疑似出血性肺炎死亡的水貂进行剖检，核实由出血性肺炎引起的死亡，统计死亡率和保护率，实验结果参见表5。

表5噬菌体对水貂出血性肺炎的控制效果

结果表明，提前饲喂噬菌体的水貂因出血性肺炎引起的死亡率为10％，噬菌体的保护率为90％，对照组的死亡率为80％，说明噬菌体对铜绿假单胞菌引起水貂出血性肺炎的具有良好的预防效果，且通过口服即可实现该效果。