一种含有人IgG1Fc和甘露聚糖结合凝集素C端的重组蛋白的制作方法

本发明公开了一种重组蛋白，属于多肽技术领域。

背景技术：

目前住院病人血液病原菌感染越来越多，而血液病原菌感染的诊断金标准仍是血培养，血培养需要的时间长，往往耽误诊断和治疗，因此发展更加快速的诊断技术是目前急需解决的问题。而不依赖培养的分子检测方法，尤其是核酸检测成为目前研究的热点。然而，血液中病原体含量低，如果直接提取全血基因组进行核酸检测，阳性率极低，这就需要对血液中的病原体进行初步的富集，才能大大提高病原体核酸的检出率。富集病原体的方法有很多，其中化学和磁捕获的方法最具有发展潜力，然而目前大部分的磁珠富集由于采用包被特异性抗体富集病原体的方法，从而不适用于未知病原体的检测。因此，目前很多实验室和公司都在研发富集能力更广的分子。如能富集多种病原体的apoh磁珠已经由apoh-technologies公司进行商业化生产，但是其富集的病原体范围还是有限，尤其是目前临床病人血液真菌(如假丝酵母菌)感染不断增加的情况下，apoh磁珠对于除了热带假丝酵母菌之外的假丝酵母菌的富集效果都不佳。因此，发展结合能力更广的病原体富集蛋白(尤其是能富集各种假丝酵母菌的蛋白)成为急需解决的问题。

甘露聚糖结合凝集素(mannan-bindinglectin,mbl)系c型凝集素超级家族中胶凝素家族代表性分子，是机体内一种重要的天然免疫分子。它可选择性识别并结合各种病原微生物如细菌、病毒、真菌、寄生虫表面的糖基，通过激活补体、调理吞噬而发挥天然抗感染免疫作用，是唯一能够激活补体的胶凝素。人类mbl基因位于10号染色体(10q11.2～q21)，只有mbl2基因编码蛋白质产物。天然mbl以多聚体形式存在，每个多聚体由2-6个亚单位相连而成，而每个亚单位又由3个相同的单体组成。研究显示，人的mbl可结合超过90种病原体。mbl结合病原体的活性与其c端(crd)形成的空间结构有密切的关系，单体的活性往往低于多聚体。

对人mbl目前的研究和应用主要集中在对其先天免疫功能的研究，如血清mbl浓度及其基因序列(尤其是n端)与感染性疾病发生的关系，其缺乏所导致的补体激活和调理功能障碍会使机体对细菌、病毒和真菌易感性的增加；而mbl高水平则会增强机体对胞内寄生物的易感性。

2014年，joohkang等首次报道用重组人mbl(人igg1fc和甘露聚糖结合凝集素c端的重组蛋白)结合磁珠实现捕获和检测血流中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母菌的作用，这为mbl在病原体检测中的应用奠定了基础。此重组蛋白的优势是通过igg1fc将两个单体连接成二聚体，从而提高表达蛋白结合病原体的能力。然而，蛋白表达量得率不高，在纯化后才能达到0.112mg/ml，仍有待提高，才能降低成本，更好地满足商业化生产的需要，同时也降低病人的诊断和治疗的费用，最终减轻全社会的医疗负担。

由于mbl是糖蛋白，必须使用哺乳动物细胞进行表达，获得的蛋白活性最接近天然状态，因此申请人选用已经商业化的thermofisher公司的pcdn3.1-hek293f细胞作为表达体系。但是此表达系统的表达效果受很多因素的影响导致不同的实验条件表达的效果差异很大，其中，核苷酸序列的差异有重要的影响。因此，对重组蛋白的核苷酸序列进行优化，使其能更高效地表达有活性的重组蛋白是商业化生产的关键。

基于目前住院病人血液病原体感染的增加，临床诊断延迟，现有检测方法的缺陷，活性蛋白表达量不高，以及现有表达体系的不确定性，本发明的目的就是通过对此重组蛋白的核苷酸序列进行优化，使其在哺乳动物细胞中的表达量明显提高，并具有更好的富集病原体的活性。

技术实现要素：

基于上述目的，本发明首先提供了一种含有人igg1fc和甘露聚糖结合凝集素c端的重组蛋白，所述重组蛋白由序列如seqidno:1所示的多核苷酸所编码，所述多核苷酸序列是得到优化的序列。

第二，本发明还提供了上述序列得到优化的，编码所述含有人igg1fc和甘露聚糖结合凝集素c端的重组蛋白的多核苷酸，所述多核酸序列如seqidno:1所示。

第三，本发明还提供了含有上述多核苷酸的载体。

在一个优选的技术方案中，所述载体为pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu。

第四，本发明提供了一种含有上述载体的宿主细胞。

在一个优选的技术方案中，所述细胞为293f细胞。

最后，本发明提供了一种制备上述重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建含有编码所述重组蛋白的多核苷酸的表达载体；

(2)将步骤(1)所述载体转染入宿主细胞；

(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；

(4)收获从步骤(3)所述细胞中表达的重组蛋白。

在一个优选的技术方案中，步骤(1)所述多核苷酸的序列如seqidno:1所示。

在另一个优选的技术方案中，步骤(2)所述载体为pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu。

在又一个优选的技术方案中，步骤(3)所述细胞为293f。

本发明提供的密码子得到优化的编码所述含有人igg1fc和甘露聚糖结合凝集素c端的重组蛋白的多核苷酸gc含量为58％，优化后通过表达载体pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu在宿主细胞293f表达量获得了大幅提升，是序列未获优化的对照菌株的3倍。本发明提供的重组蛋白mbl2-igg1fc与占血液真菌感染90％以上的5种假丝酵母菌标准株及临床株都有很好的结合活性，而且实验证明此结合是由于重组蛋白mbl的crd区介导的。良好的假丝酵母菌结合能力显示所述重组蛋白具有很好的富集病原体的能力，在微生物检测中具有很好的应用前景。

附图说明

图1.重组蛋白基因序列结构示意图；

图2.密码子调整后gc含量；

图3a-图3d.优化前后的密码子对照图；

图4.调整后的密码子使用频率；

图5a.pacdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒图谱，

图5b.pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒图谱；

图6.两种质粒转染的细胞表达上清sds-page图；

图7.转染细胞表达上清westernblotting图；

图8纯化蛋白的sds-page图；

图9.纯化蛋白的westernblotting图；

图10.用bca法检测蛋白浓度的标准曲线；

图11.westernblotting检测pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染293f细胞表达的重组蛋白与5种假丝酵母菌标准株结合情况；

图12.westernblotting检测pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染293f细胞表达的重组蛋白与5种假丝酵母菌临床株结合情况；

图13.流式细胞仪检测pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染293f细胞表达的重组蛋白与5种假丝酵母菌标准株的结合情况；

图14.用中位荧光强度值(mfi)表示的重组蛋白与5种假丝酵母菌标准株的结合情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1.人mbl-igg1fc重组蛋白基因密码子优化及合成。

首先，设计表达人mbl-igg1fc重组蛋白基因序列结构，如图1所示，在n端加入人白细胞介素-2(il-2)信号肽序列，两端加上酶切位点为nheⅰ和notⅰ。然后，对mbl-igg1fc重组蛋白的基因使用jcat(javacodonadaptationtool)工具(http://www.jcat.de/result.jsp)进行密码子优化，再按蛋白序列有效表达的工作经验进行人工调整，使其更适合在293f细胞中表达。密码子优化重组蛋白mbl-igg1fcyu基因序列见seqidno:1，氨基酸序列见seqidno:2，优化前的重组蛋白mbl-igg1fc基因序列见seqidno:3。密码子优化后，重组蛋白核苷酸序列整体变化16.5％，而氨基酸序列不变，密码子使用频率调整后如图2所示，优化前后的密码子对照见图3a-图3d，加阴影的密码子为jcat软件优化的密码子，而人工调整的密码子表示为斜体(seq1)。优化后密码子的gc含量为58％(图4)。

2.载体构建和重组蛋白mbl-igg1fc的体外表达鉴定。

2.1载体构建。

将以上合成的基因片段以及pcdna3.1质粒分别用nheⅰ和notⅰ进行双酶切，回收目的片段基因，克隆进pcdna3.1质粒。转化大肠杆菌top10感受态细胞，涂布amp^rlb平板，挑单克隆进行菌落pcr鉴定，并对pcr鉴定为阳性的克隆进行测序验证。通过摇菌中无内毒素抽提质粒，待用。未进行序列优化的质粒记为pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒，经过序列优化的质粒标记为pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒。质粒图谱如图5所示，其中图5a为pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒图谱，图5b为pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒图谱。

2.2mbl-igg1fc重组蛋白的体外表达鉴定。

转染：转染前一天，计数正常培养的293f细胞，吸取适量细胞悬液离心(1000rpm,5min)，弃上清后以新鲜expi293^tmexpressionmedium(含6mml-glutamine)重悬至1×10⁶cfu/ml(总体积180ml)，继续37℃，5％co2，125rpm过夜培养。转染时，在50ml无菌离心管中加入20mlexpi293^tmexpressionmedium和100ug质粒dna，涡旋混匀，然后加入200ullipofectin至上述稀释好的dna溶液中，再次涡旋混匀。室温孵育10min。然后将转染复合物加入至180ml的293f培养物中，37℃，5％co2，125rpm培养。

样品制备：转染四天后，将细胞转移到50ml离心管中，4℃，1000rpm，离心5分钟，上清用0.22μm滤膜过滤后用于sds-page和wb检测，分装，冻存。

sds-page检测目的蛋白表达量：使用10孔的12％sds-page胶进行sds-page，上样量每孔10μl上清。电泳条件：浓缩胶电压为80v，至蛋白进入分离胶；分离胶电压为100v，直到溴酚蓝刚好从凝胶中出来为止。然后进行考马斯亮蓝染色，使用蛋白质凝胶成像仪采集图像。结果如图6所示，其中标号分别为：1,pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染的293f细胞培养上清；2，pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染293f细胞培养细胞上清。结果显示，两种质粒转染的细胞表达的重组蛋白分子量均正确，约为58kd左右，而pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染细胞上清的表达蛋白量明显低于pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染细胞上清。

wb鉴定目的蛋白：使用10孔的12％sds-page胶进行sds-page，上样量每孔10μl。电泳条件：浓缩胶电压为80v，至蛋白进入分离胶；分离胶电压为100v，直到溴酚蓝刚好从凝胶中出来为止。将sds-page胶的蛋白质通过电转仪转移到pvdf膜上，电转条件为15v，1小时。电转完成后，将pvdf膜用含5％脱脂奶粉的tbst封闭，4℃放置过夜。将膜用wb洗涤液洗涤2-3次，每次于摇床上摇动10分钟。然后加入以1:2000稀释于5％脱脂奶粉的兔抗人mbl抗体(ab189856,abcambiotechnology,usa)，室温孵育1小时。用wb洗涤液将膜洗涤2-3次，每次于摇床上摇动10分钟。然后加入以1:4000稀释于5％脱脂奶粉的hrp标记的山羊抗兔igg抗体(ab205718,abcambiotechnology,usa)，室温孵育1小时。用wb洗涤液将膜洗涤3次，第1次于摇床上摇动30分钟，第2、3次于摇床上摇动10分钟，使用westernblotchemiluminescencehrpsubstrate进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。如图7所示，其中的标号分别表示：m,蛋白marker；1,pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染293f细胞培养上清；2,pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染293f细胞培养上清。结果说明，两种质粒转染细胞表达的蛋白与抗人mbl抗体均可结合，而pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染细胞上清的表达蛋白量明显低于pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染细胞上清。

3.293f稳转细胞筛选。转染细胞后，分成6瓶摇床培养3天后，按照100、200、300、400、500、800μg/ml梯度法加入neomycin(新霉素)10μg/ml，继续培养10-15天后，将存活细胞铺板至6孔板、24孔板，最后用96孔板筛选单克隆细胞，挑选表达量最高的单克隆细胞进行扩大培养。

4.重组蛋白纯化和鉴定。

4.1重组蛋白的镍柱亲和层析：吸取2ml树脂于柱子，再加入2ml1×chargebuffer，与树脂混匀，室温静置，形成层析柱。上柱待完全沉淀后用去离子水洗涤层析柱，每次加入1ml，洗涤两次，流速为重力作用。使用10mlbindingbuffer(0.02mna2hpo4/nah2po4(ph7.4)，0.5mnacl)平衡镍柱以至备用，流速为重力作用。将收集的细胞表达上清上样，流速控制为0.1ml/分钟左右。上样结束后，使用10mlwashingbuffer(0.02mna2hpo4/nah2po4(ph7.4)，0.5mnacl，20mmimidazole)冲洗镍柱，此时大部分杂蛋白已除去。然后使用10mlelutionbuffer(0.02mna2hpo4/nah2po4(ph7.4)，0.5mnacl，500mmimidazole)冲洗镍柱直至样品洗脱，收集样品。

4.2重组蛋白的进行sds-page检测。如图8的sds-page所示所示，其中标号分别表示：bsa0.5mg/ml，牛血清白蛋白；m，蛋白marker；1,pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染293f细胞培养上清纯化蛋白；2，pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染293f细胞培养上清纯化蛋白。结果说明两种稳转细胞表达蛋白经亲和纯化后，pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染细胞表达的蛋白浓度明显高于pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染细胞表达蛋白的浓度。

4.3重组蛋白的进行westernblotting检测。如图9的westernblotting所示，其中标号分别表示：m，蛋白marker；1，pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染293f细胞培养上清纯化蛋白；2，pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染293f细胞培养上清纯化蛋白。结果说明，pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染细胞表达的蛋白活性明显高于pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染细胞表达蛋白的活性。

4.4重组蛋白的浓度检测使用bca蛋白浓度测定(微孔酶标仪法)。配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积bca试剂加1体积cu试剂(50:1)配制成bca工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。bca工作液室温24小时内稳定；稀释标准品：取10μlbsa标准品用pbs稀释至100μl(样品一般可用pbs稀释)，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0、2、4、6、8、12、16、20μl加到96孔板的蛋白标准品孔中，加pbs补足至20μl；将样品作适当稀释(做好多做几个梯度，如作2倍，4倍，8倍稀释)，加20μl到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量样品时误差偏大，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后；各孔加入200μlbca工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定a562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。所得标准曲线结果如图10所示，根据此标准曲线，计算得出pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染细胞表达的蛋白纯化后浓度为1.50mg/ml，而pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染细胞表达蛋白纯化后浓度为0.50mg/ml。

实施例2.重组蛋白活性与病原菌的结合活性检测。

由实施例1结果可见，pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染细胞表达的蛋白纯化后浓度明显高于pcdna3.1-mbl2-igg1fc质粒转染细胞表达蛋白。为了进一步证明pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染细胞表达的蛋白具有很好的结合病原体的活性，以下将对pcdna3.1-mbl2-igg1fcyu质粒转染细胞表达的蛋白进行进一步的活性鉴定。

1.wb检测重组蛋白-假丝酵母菌结合情况。

吸取6×10⁷cfu假丝酵母菌，pbs冲洗3次，3000rpm，1分钟，室温离心，重悬在500μlpbs中，加入2ul1mcacl与10μl400μg/mlmbl重组蛋白，室温孵育30分钟。3000rpm，离心1分钟。然后用pbs洗一次，加入50ul7％sds室温孵育15分钟后，3000rpm离心3分钟。小心的吸取上清，加入蛋白上样缓冲液煮沸10分钟。使用10孔的12％sds-page胶进行sds-page，上样量每孔10μl。电泳条件：浓缩胶电压为80v，至蛋白进入分离胶；分离胶电压为100v，直到溴酚蓝刚好从凝胶中出来为止。将sds-page胶的蛋白质通过电转仪转移到pvdf膜上，电转条件为15v，1小时。电转完成后，将pvdf膜用含5％脱脂奶粉的tbst封闭，4℃放置过夜。将膜用wb洗涤液洗涤2-3次，每次于摇床上摇动10分钟。然后加入以1:2000稀释于5％脱脂奶粉的兔抗人mbl抗体，室温孵育1小时。用wb洗涤液将膜洗涤2-3次，每次于摇床上摇动10分钟。然后加入以1:4000稀释于5％脱脂奶粉的hrp标记的山羊抗兔igg抗体，室温孵育1小时。用wb洗涤液将膜洗涤3次，第1次于摇床上摇动30分钟，第2、3次于摇床上摇动10分钟，使用westernblotchemiluminescencehrpsubstrate进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。如图11、12所示，重组蛋白与占血液真菌感染90％以上的5种假丝酵母菌标准株及临床株都有很好的结合活性。其中图11所示的标号分别为1,candida.albicans(atcc10231)；2,c.tropicalis(atcc750)；3,c.parapsilosis(atcc22019)；4,c.glabrata(atcc2001)；5,c.krusei(atcc6258)。图12所示的c1-c15为假丝酵母菌临床株。

2.流式细胞术检测重组蛋白-假丝酵母菌结合能力。

稀释菌液至1×10⁸cfu/ml，吸取50μl于1.5ml离心管中，使用vbs⁺⁺缓冲液冲洗一次，1000g离心1分钟。然后将菌液重悬在500ul含5ug/ml重组蛋白的vbs⁺⁺缓冲液中，37℃孵育30分钟。孵育完成后用vbs⁺⁺缓冲液冲洗一次，然后加入100μl以5μg/ml稀释于vbs⁺⁺缓冲液的fitc标记的山羊抗6×his抗体，37℃避光孵育20分钟。孵育完成后，1000g离心1分钟，弃去上清，重悬在200μlvbs⁺⁺缓冲液中，然后加入200ul2％的多聚甲醛进行固定。

上机检测：使用bdfacscalibur流式细胞仪进行流式细胞术检测。首先调节合适的电压，使用单荧光染色样品调节染料间的荧光补偿，然后上样。通过fsc和ssc圈出假丝酵母菌细胞，设为门1。从门1出来的细胞，通过fl3(percp/cy5.5)和ssc，圈出假丝酵母菌位置，对比阳性样本与阴性样本的差异，设为门2。从门2中出来的细胞，通过fl1(fitc)作点图，分析假丝酵母菌细胞中重组蛋白-假丝酵母菌结合细胞的百分比。使用flowjo流式分析软件对检测结果进行分析。如图13所示，黑色箭头所指的曲线代表5ug/ml重组蛋白与假丝酵母菌结合后产生的荧光曲线，而图14用直方图显示的具体的中位荧光值(mfi)表明，有重组蛋白存在时酵母菌产生的荧光强度明显高于阴性对照；并且从图13及14也可见，当加入抑制剂edta后荧光强度明显降低，基本回复到阴性水平；说明重组蛋白与5种假丝酵母菌均可结合，而且此结合是由于重组蛋白mbl的crd区介导的。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120>一种含有人igg1fc和甘露聚糖结合凝集素c端的重组蛋白

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1131

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>1

atgtgcgacaagacacacacatgccccccctgtcctgcccctgagctgctgggaggccct60

tccgtgttcctgttccctcctaagcctaaggacaccctgatgatctccaggacccccgag120

gtgacatgtgtggtggtggacgtgagccacgaggaccctgaggtgaagtttaactggtac180

gtggatggcgtggaggtgcacaatgccaagacaaagcctagggaggagcagtacaacagc240

acatacagagtggtgagcgtgctgacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaggag300

tacaagtgcaaggtgtccaataaggccctgcctgcccccatcgagaagaccatctccaag360

gccaagggccagcctagagagcctcaggtgtacaccctgcctccttccagagatgagctg420

acaaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgcc480

gtggagtgggagagcaatggccagcctgagaacaattacaagaccaccccccccgtgctg540

gacagcgacggatctttctttctgtacagcaagctgacagtggataagtccagatggcag600

cagggcaacgtgttcagctgtagcgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccag660

aagtccctgagcctgtcccctggcaagagagatggcgacagctccctggccgccagcgag720

agaaaggccctgcagaccgagatggccaggatcaagaagtggctgacattcagcctgggc780

aagcaggtgggcaataagttctttctgaccaacggcgagatcatgacctttgagaaggtg840

aaggccctgtgtgtgaagtttcaggccagcgtggccacccccagaaatgccgccgagaat900

ggcgccatccagaacctgatcaaggaggaggccttcctgggcatcaccgacgagaagaca960

gagggccagtttgtggatctgacaggcaataggctgacctacacaaattggaatgagggc1020

gagcctaacaacgccggcagcgatgaggactgcgtgctgctgctgaagaatggccagtgg1080

aacgatgtgccttgcagcacatcccacctggccgtgtgcgagttccccatc1131

<210>2

<211>377

<212>prt

<213>人工序列（artificial）

<400>2

metcysasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleu

151015

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

202530

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

354045

serhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval

505560

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnser

65707580

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

859095

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproala

100105110

proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

115120125

glnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasngln

130135140

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

145150155160

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

165170175

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleu

180185190

thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser

195200205

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

210215220

leuserproglylysargaspglyaspserserleualaalaserglu

225230235240

arglysalaleuglnthrglumetalaargilelyslystrpleuthr

245250255

pheserleuglylysglnvalglyasnlysphepheleuthrasngly

260265270

gluilemetthrpheglulysvallysalaleucysvallysphegln

275280285

alaservalalathrproargasnalaalagluasnglyalailegln

290295300

asnleuilelysgluglualapheleuglyilethraspglulysthr

305310315320

gluglyglnphevalaspleuthrglyasnargleuthrtyrthrasn

325330335

trpasngluglygluproasnasnalaglyseraspgluaspcysval

340345350

leuleuleulysasnglyglntrpasnaspvalprocysserthrser

355360365

hisleualavalcysglupheproile

370375

<210>3

<211>1131

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>3

atgtgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccg60

tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag120

gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtac180

gtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagc240

acgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag300

tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaa360

gccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctg420

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gtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg540

gactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcag600

caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag660

aagagcctctccctgtctccgggtaaacgcgatggtgatagtagcctggctgcctcagaa720

agaaaagctctgcaaacagaaatggcacgtatcaaaaagtggctgaccttctctctgggc780

aaacaagttgggaacaagttcttcctgaccaatggtgaaataatgacctttgaaaaagtg840

aaggccttgtgtgtcaagttccaggcctctgtggccacccccaggaatgctgcagagaat900

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