用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置及评价方法与流程

本发明涉及微生态制剂药物的活性评价领域，具体而言，涉及一种用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置及活性评价方法。
背景技术：
：微生态活菌制品由人体正常或无害外籍微生物加工制成，用于治疗菌群失调类疾病。其作用途径主要通过抑制有害菌生长，促进益生菌生长，来实现体内环境再平衡。临床应用广泛。我国已批准上市的微生态制剂有22种，涉及13种微生物，年销售额数十亿。微生态制剂可能的作用机制包括：细菌素、多肽、蛋白、生境改变、竞争性抑制等等，作用机理复杂，且活性成分随着微生物群落的生长而呈现动态变化。因此，不同于有效成分明确的化学药，评价微生态活菌制剂的药物活性非常困难。有文献报道采用动物试验的方法，通过长期口服给药后检测受试动物体内的微生物群落的变化，并与对照组比较，评价药物的活性。该方法受到个体差异、试验时长、样本量、判定标准、经济性等因素影响，无法作为一种标准的检测方法应用于药物的质量标准中。相比而言，体外活性评价方法操作简便、结果明确。它以特定的某种或几种微生物为研究对象，消除了试验动物个体差异、样本量大小带来的不确定因素。通过动态监测培养体系中微生物群落的变化情况，与空白对照组比较，结合统计学分析，综合评价药物活性。该方法结果客观、明确。由于缺乏专业的培养体系及培养装置，目前，文献收载的微生态制剂的体外活性评价方法，多以单一微生物为研究对象，如对金黄色葡萄球菌的抑制作用或对乳酸杆菌的促生长作用等等，没有充分考虑肠道微生物之间的相互作用，评价结果有较大的局限性。随着微生态制剂制药产业的不断发展，质量控制标准也要相应提高，建立微生态制剂的体外活性评价方法，对微生态制剂产业健康发展意义重大。技术实现要素：本发明公开了一套用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置。将多种试验微生物接种至共培养装置中培养，检测药物作用下，微生物群落的变化情况，评价药物对共培养微生物的作用。一种用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置，包括纯培养管和共培养盘，所述纯培养管通过连接管和共培养盘连接，主要材质为玻璃，少量金属、橡胶、pvc等；所述共培养盘的上壁有培养基采样口和培养基回注口，所述培养基采样口和培养基回注口的上部有小透气胶塞；所述连接管上有连通阀，连通阀可关闭纯培养管和共培养盘之间的通路，关闭后纯培养管可以从连接管上取下。培养基采样口和培养基回注口直径为5mm，采用小透气胶塞密封，有效调节共培养盘中的压力，同时，由于培养基采样口和培养基回注口管道较细长，有效避免了外界空气过度进入影响共培养盘中的氧含量。所述共培养盘周围的连接管均匀分布；连接管的数量为4-14个；所述纯培养管的直径为4cm，高度为11cm，在高度为7-9cm处设置刻度线；共培养盘的直径为10cm，高度为2.5cm；连接管直径5mm，长度3cm。所述共培养系统，纯培养管和共培养盘不限于上述体积，可按比例扩大或缩小。连接管为细长设计，既可以保证培养基或微生物在两个培养容器中有效交换，又可以限制交换量，保持纯培养管中稳定的需氧或厌氧条件。所述纯培养管的上部有胶塞；所述胶塞为透气或半透气。所述纯培养管连接除氧器，所述除氧器由除氧剂室通过滤膜和纯培养管盖组成，纯培养盖上还有减压囊，在培养过程中微生物代谢产生的气体，可排放入减压囊，保证纯培养管内压力稳定。所述除氧剂室和纯培养管盖材质为pvc，除氧剂室和纯培养管盖连接处有pp材质的过滤膜，防止除氧剂颗粒进入纯培养盖同时保持除氧室和纯培养管良好的通透性。具体操作时，只需将纯培养管盖扣在需要进行厌氧培养的纯培养管上，密封橡胶圈可将两者紧密贴合，实现厌氧培养环境。所述纯培养管盖和纯培养管采用密封橡胶圈连接。一种微生物菌落共培养的评价方法，采用以下步骤：一种微生物菌落共培养的评价方法，其特征在于，采用以下步骤：(1)将上述共培养系统置于生物安全柜内，从任意纯培养管加液体培养基，设定样品组和对照组，待培养基在培养盘和纯培养管分配均匀，纯培养管中培养基达到刻度线，关闭连通阀；其中样品组为含有药物的培养基，对照组为不加药物的培养基；(2)在纯培养管中接种相应的试验微生物，将共培养装置移入培养箱中，先预培养0.5-1小时，然后打开连通阀，10～20r/min振荡培养；(3)对培养物中各试验微生物进行计数，计算样品组中各微生物的lg增加值或减少值；(4)采用χ2检验的方法检验对照组和样品组益生菌和有害菌构成比，评价药物对微生物菌群的作用效果。进一步地，步骤(1)所述的药物包括：乳酸菌素、活菌制剂、中成药和化学药物等，具有改善肠道菌群作用的药物；也可以是微生物代谢产物提取物，用本发明验证其活性。进一步地，步骤(4)所述的检验方法的具体步骤为：(1)培养结束后，计数分析对照组和样品组培养物中各微生物的含量；(2)与对照组比较，计算样品组每1ml培养物中，各微生物的对数增加值或减少值；(3)对每10ml中，样品组和对照组中有害菌、益生菌的构成比进行χ2检验。(4)根据结果判定标准进行结果判断；其中结果判定标准为：所述培养基采样口用于在培养过程中对共培养盘中的培养物进行取样，取样量为1～5ml，取样同时，自培养基回注口加入取样量同体积的无菌培养基。步骤(2)所述的接种完成后，需要厌氧条件的微生物，用透气胶塞封口纯培养管口，然后将除氧器连接纯培养管，形成厌氧条件；需要微需氧条件的微生物，用半透气胶塞封口纯培养管口，形成微需氧条件；需要有氧条件的微生物，用透气胶塞封口纯培养管口。需要厌氧条件的微生物在培养的时候除氧剂室中有厌氧指示剂。如培养过程中厌氧指示剂变色，则需更换除氧器。试验完成后，可通过除氧器底端的除氧剂室底盖，更换失效的除氧剂，除氧器可重复使用。进一步地，所述的液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆木瓜蛋白水解物3g，牛肉膏粉3g，酵母膏粉10g，葡萄糖10g，乳糖5g，麦芽糖1.5g，纤维二糖1.5g，可溶性淀粉1g，甘露醇0.5g，半胱氨酸-盐酸0.25g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，碳酸氢钠6g，氯化钙0.15g，硫酸镁0.1g，醋酸钠0.15g，柠檬酸铵0.1g，硫酸亚铁0.02g，硫酸锰0.02g，硫酸锌0.02g，硫酸铜0.01g，维生素k10.5ml，氯化钠2g，叶酸1mg，烟酸1mg，生物素2mg，加入500ml牛肠浸提液，蒸馏水500ml。所述牛肠浸提液的制备方法为：取牛小肠250g，牛结肠250g，无菌水冲洗数次，粉碎机粉碎，加入1000ml蒸馏水，搅拌均匀，置4℃存放48小时，六层医用纱布过滤，取滤液即得。步骤(2)根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，步骤(2)所述的试验微生物须同时包含益生菌、中性菌和有害菌；其中所述益生菌为长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、布氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌中的一种或几种；所述中性菌为丁酸梭菌、粪肠球菌、粪链球菌、普通拟杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、艰难梭菌和粘液真杆菌中的一种或几种；所述有害菌为乙型副伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和福氏志贺氏菌中的一种或几种；所述益生菌、中性菌和有害菌也可使用其他模式菌株或分离自人或动物肠道的非模式菌株，但必须符合益生菌、中性菌和有害菌的试验微生物组成模式。有益效果(1)本发明设计的共培养装置充分考虑肠道微生物的多样性(包括有害菌、益生菌和中性细菌)、微生物在肠壁定植区域的优势性、微生物随肠液的迁移、微生物对氧气的不同需求、微生物之间的相互作用、药物对微生物的作用、肠道的蠕动和肠液的流动性等等。评价结果更接近于真实的肠道微生物群落变化。(2)本发明设计的共培养系统，实现了需氧菌、厌氧菌和兼性菌在同一培养体系中培养，即保持相对独立，又相互连通。在缓和的振荡培养条件下，各培养腔室之间的培养液缓慢交流，相互作用，最大程度上模拟了微生物在肠道中的自然生存状态。附图说明图1为本发明的共培养装置的整体图；图2为本发明的共培养装置的俯瞰图；图3为本发明的共培养装置的纵剖图；图4为本发明的共培养装置的除氧器分解平面图；图5为实施例1中8种试验菌在纯培养条件下的生长曲线；图中：1、纯培养管、2、共培养盘、3、连接管、4、连通阀、5、培养基采样口、6、培养基回注口、7、小透气胶塞、8、透气胶塞(或半透气胶塞)、9、除氧器、10、除氧剂室、11、过滤膜、12、纯培养管盖、13、减压囊、14、氧指示剂、15、除氧室底盖、16、密封橡胶圈、17、刻度线。具体实施方式结合实施例和对比例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例1本实施例采用本发明评价乳酸菌素对肠道微生物的作用。乳酸菌素是乳酸杆菌的代谢产物，药品乳酸菌素颗粒即是以乳酸菌素为主要原料制成，其药品说明书中药理作用部分对于本品的描述——“选择性的杀死肠道致病菌，保护促进有益菌的生长”。图1所示，本发明实施例1的共培养装置的结构示意图，包括纯培养管1和共培养盘2，所述纯培养管1通过连接管3和共培养盘2连接；所述共培养盘2的上壁有培养基采样口5和培养基回注口6，所述培养基采样口5和培养基回注口6的上部有小透气胶塞7；所述连接管3上有连通阀4。所述共培养盘2周围的连接管3均匀分布，连接管的数量为8个；所述纯培养管1的直径为4cm，高度为11cm，在高度为7-9cm处设置刻度线17；共培养盘2的直径为10cm，高度为2.5cm；连接管3直径5mm，长度3cm；所述培养基采样口5和培养基回注口6直径为5mm。所述纯培养管1连接除氧器9，所述除氧器9由除氧剂室10通过滤膜11和纯培养管盖12组成，纯培养盖12上还有减压囊13。所述除氧剂室10和纯培养管盖12材质为pvc，除氧剂室10和纯培养管盖12连接处有pp材质的过滤膜11。所述纯培养管盖12和纯培养管1采用密封橡胶圈16连接。(1)本实施例乳酸菌素溶液的制备方法为：取乳酸菌素原料适量，用灭菌水稀释，制成20％的乳酸菌素原料溶液，4000r/min，离心5min，去除溶液中的细胞、纤维等，取富含活性成分的上清液备用。(2)本实施例试验菌种为长双歧杆菌(bncc3337084)、丁酸梭菌(bncc337239)、粪肠球菌(bncc186300)、鼠李糖乳杆菌(bncc134266)、普通拟杆菌(bncc186191)、地衣芽孢杆菌(bncc1326654)、金黄色葡萄球菌(cmcc26003)、乙型副伤寒沙门氏菌(cmcc50094)。将上述菌种分别接种至培养基中，37℃培养18h，后经离心富集、无菌生理盐水清洗、再稀释、浊度测定等步骤，将各试验菌制成约107cfu/ml的菌悬液，备用。(3)本实施例的浓缩培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆木瓜蛋白水解物3g，牛肉膏粉3g，酵母膏粉10g，葡萄糖10g，乳糖5g，麦芽糖1.5g，纤维二糖1.5g，可溶性淀粉1g，甘露醇0.5g，半胱氨酸-盐酸0.25g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，碳酸氢钠6g，氯化钙0.15g，硫酸镁0.1g，醋酸钠0.15g，柠檬酸铵0.1g，硫酸亚铁0.02g，硫酸锰0.02g，硫酸锌0.02g，硫酸铜0.01g，维生素k10.5ml，氯化钠2g，叶酸1mg，烟酸1mg，生物素2mg，加入500ml牛肠浸提液，115℃，灭菌30min，备用。此时培养基为2倍浓缩培养基，用灭菌纯净水或样品溶液，稀释后使用。(4)将500ml灭菌浓缩培养基和500ml20％的乳酸菌素溶液混合均匀，缓缓加入共培养装置，待培养基分配均匀，关闭连通阀。在8个纯培养管中，分别接种1ml上述107cfu/ml的菌悬液。接种长双歧杆菌、丁酸梭菌、鼠李糖乳杆菌、普通拟杆菌、地衣芽孢杆菌的纯培养管，用透气胶塞封口后，连接除氧器，形成厌氧环境；接种粪肠球菌、乙型副伤寒沙门菌的纯培养管，用半透气胶塞封口，模拟微需氧环境；接种金黄色葡萄球菌的纯培养管，用透气胶塞封口，形成需氧条件。(5)将共培养装置转移至振荡培养箱中，50～60r/min，振荡培养1小时后，打开各连通阀，将振荡速度调整至10～20r/min，继续培养。处于对数期的微生物生长、繁殖和代谢比较旺盛，对外界环境变化比较敏感，在对数期中后时间段，微生物逐渐产生次级代谢产物，此时，药物对微生物群落的作用、微生物之间的相互作用均有典型表现。因此，尽量选取各试验菌均处于对数期中、后时间段的培养物取样检测。根据8种试验菌(初始浓度为105cfu/ml)在纯培养条件下的生长曲线(见下图5)，在10小时取样，计数培养基中各微生物的含量。对照组将实施例1的步骤(4)中的灭菌浓缩培养基500ml用500ml灭菌水稀释，混匀，其余步骤均同实施例1。培养物中各试验微生物的计数选择性培养基计数法：取样后，可使用选择性培养基对培养物中的微生物进行计数。采用莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良mrs琼脂培养基计数长双歧杆菌；采用含多年菌素b和氨苄西林的梭菌强化培养基计数丁酸梭菌；采用含叠氮化钠和牛胆粉的牛肉琼脂培养基计数粪肠球菌；采用盐酸林可霉素改良mrs琼脂培养基计数鼠李糖乳杆菌；采用添加卡那霉素和万古霉素的木聚糖碳源琼脂培养基计数普通拟杆菌；采用丙酸盐培养基55℃高温培养法计数地衣芽孢杆菌；采用bp琼脂培养基计数金黄色葡萄球菌；采用sxt4沙门选择性培养基计数乙型副伤寒沙门时菌。选择性培养基可自行配制，也可选用市售成品培养基。非选择性培养基计数法：使用无选择性的琼脂培养基，例如上述“(3)”中的培养基，添加1.5％的琼脂粉，或者适宜的市售培养基，计数培养物中的微生物。选择菌落密度适宜的平板，根据试验微生物在平板上的菌落特征、染色镜检或生化试验，对其中的50～100个微生物进行鉴别，平行2个平皿，计算各试验微生物所占的比例。也可选择性平板与非选择性平板结合使用。结果判定标准微生态制剂对于肠道微生物的调节机制非常复杂，反映在体外试验,可以简单理解为三种方式:第一种，微生态制剂首先促进益生菌生长繁殖，单位时间内益生菌绝对数量增加，有害菌占比相对降低,益生菌通过生境竞争、抗菌代谢产物等抑制有害菌，续而有害菌绝对数量降低；第二种,微生态制剂直接抑制或杀灭有害菌,有害菌绝对数量降低，益生菌受到来自有害菌的竞争性抑制压力减小，大量繁殖，绝对数量增加；第三种，微生态制剂促进益生菌生长繁殖，杀灭或抑制有害菌,益生菌绝对数量增加的同时,有害菌绝对数量降低。微生态制剂对于菌群的调节过程是连续的、动态的，从口服给药到发挥药效可能要数天的时间，而体外实验在数小时内就给出结果。当然，体外试验无法模拟胃肠道的消化吸收、免疫系统的调节介入以及连续给药、药物代谢等等，只是药物直接作用于菌群，对菌群产生的快速影响，代表了菌群在体内的变化、发展方向。不同微生态制剂作用的益生菌或有害菌也不尽相同。因此，结果的判定不宜简单用某一种或几种微生物具体的变化数量来表示，应能体现菌群总体构成，向着益生菌增加有害菌减少的趋势发展。综上分析,可采用χ2检验的方法，检验对照组和样品组中，益生菌和有害菌构成比之间有无差别，分析样品组中菌群构成的变化趋势，并结合每种微生物实际的菌量变化值，评价药物对微生物菌群的作用效果。具体步骤如下：①各种因素的作用下，试验微生物的繁殖速度不同，导致不同微生物数量差异过大，造成分析过程中信息的损失放大，通过取对数值消除着这种差异；②与对照组比较，计算样品组每ml培养物中，各微生物的对数增加值或减少值；③以每1ml培养物中微生物的量进行χ2检验分析，样本量偏少，可能出现理论值1≤t≤5的格子数超过1/5的情况，可通过增大样本量的方式处理，以每10ml培养物中微生物的量进行统计学分析，即10lg；④对两组中益生菌和有害菌的构成进行χ2检验。⑤根据结果判定标准进行结果判断。表1微生态制剂体外活性试验结果判定标准乳酸菌素颗粒体外活性试验结果：表2两组培养物中微生物含量表3两组中有害菌和益生菌的构成比较组别长双歧杆菌鼠李糖乳杆菌金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌合计样品78804573276对照66757681298合计144155121154574表4试验结果当前第1页12