一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用与流程

本发明属于病毒载体疫苗技术领域，具体地说，涉及一种展示cyhv-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用。

背景技术：

cyhv-2(鲤疱疹病毒2型)是感染异育银鲫引起疱疹病毒性造血器官坏死病的病原，春季和秋季是其致病的高发季节，死亡率可高达100％，近年来给我国的鲫鱼养殖业造成了严重的经济损失。cyhv-2是双链dna病毒，基因组长达290kb，可编码150种蛋白，其中包括36种膜蛋白(journalofvirology2013；87:2908-2922)。

疫苗免疫是控制病毒感染的重要手段。研究表明，针对cyhv-2的感染，灭活疫苗可以为异育银鲫提供71.4％的相对保护率(fish&shellfishimmunology2016；49:344-350)。酵母表达系统表达纯化的cyhv-2的囊膜蛋白orf25,orf25c和orf25d可以作为亚单位疫苗，为异育银鲫提供抵抗cyhv-2感染的保护性免疫(fish&shellfishimmunology2015；47:1024-1031)。但是这些疫苗需要注射到鲫鱼体内，使用不够简便，保护率也不理想。

杆状病毒可以将外源蛋白通过gp64跨膜区展示在病毒颗粒表面、转导多种动物细胞并在转导细胞中表达所携带外源基因，还可以作为疫苗佐剂刺激动物免疫反应等特点，因此在动物疫苗的研究和生产领域有广泛的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种展示cyhv-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用，利用杆状病毒展示外源蛋白、对异育银鲫细胞具有转导能力的特点，构建了一种展示cyhv-2膜蛋白的重组杆状病毒，主要目的是为防控cyhv-2的感染提供一种简单、经济、高效的疫苗。

其具体技术方案为：

一种展示cyhv-2膜蛋白的重组杆状病毒，orf25在杆状病毒表面的展示通过将orf25的胞外区与杆状病毒acmnpvgp64的信号肽和跨膜区进行融合表达来实现，以重组杆状病毒为载体表达的orf25融合蛋白的氨基酸序列为seqidno:3。

一种展示cyhv-2膜蛋白的重组杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：a.制备cyhv-2编码的orf25胞外区基因片段；b.将上述基因片段克隆到表达载体，使orf25胞外区与acmnpvgp64的跨膜区融合表达；c.将上述表达质粒与线性化的bacmid共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒。具体为：

步骤1、从感染cyhv-2的组织匀浆中提取总dna作为模板，以seqidno:1和seqidno:2为引物，扩增orf25的胞外区基因片段。

步骤2、将获得的pcr产物用bamhi和ecori双酶切，克隆到pqbd表达载体，获得重组质粒pqbd-orf25。

步骤3、用pqbd-orf25和线性化的acmnpvbacmidqbac-iii共转染sf9昆虫细胞，转染后5天收集p0代重组病毒。继续扩增，获得高滴度重组病毒。

步骤4、将重组杆状病毒稀释至滴度为4×10³tcid50/ml，将2cm大小的异育银鲫放入其中浸浴2小时进行免疫。

本发明所述展示cyhv-2膜蛋白的重组杆状病毒在防控cyhv-2的感染疫苗制备过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明获得的展示cyhv-2膜蛋白orf25的重组杆状病毒无需注射，可以直接通过简单的浸浴方式为异育银鲫提供免疫保护，对cyhv-2感染的相对保护率优于已报道的疫苗免疫效果，说明本发明构建的重组杆状病毒可以为cyhv-2感染的防控提供一种免疫效果好而且使用方法简单、易操作的疫苗。

本分明将orf25抗原展示在重组病毒表面，使其可以作为亚单位疫苗刺激b细胞产生抗体，也可以将orf25基因转导到宿主细胞中表达，起到类似于dna疫苗的效果。免疫后7天il-11高于对照约3倍，免疫后15天ifnγ高于对照1.5倍。

附图说明

图1是本发明制备的重组杆状病毒的示意图；

图2是本发明纯化的重组杆状病毒表面展示cyhv-2orf25融合蛋白的免疫印迹图；

图3是本发明的重组杆状病毒转导鲫鱼肾细胞并在其表面表达cyhv-2orf25融合蛋白的流式细胞术检测结果；

图4是本发明的展示cyhv-2膜蛋白orf25的重组杆状病毒浸泡免疫后，经cyhv-2攻毒，异育银鲫的存活率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

1、展示cyhv-2膜蛋白orf25的重组杆状病毒的制备

从感染cyhv-2的组织匀浆中提取总dna作为模板，以seqidno:1和seqidno:2为引物，扩增orf25的胞外区基因片段。

将获得的pcr产物用bamhi和ecori双酶切，克隆到pqbd表达载体，获得重组质粒pqbd-orf25。用pqbd-orf25和线性化的acmnpvbacmidqbac-iii共转染sf9昆虫细胞，转染后5天收集p0代重组病毒。获得重组杆状病毒命名为racmnpv-orf25(重组杆状病毒携带orf25融合蛋白基因的示意图见附图1)。以该重组杆状病毒为载体表达的orf25融合蛋白的氨基酸序列为seqidno:3。

2、重组杆状病毒的纯化和表面展示蛋白的检测

p0代racmnpv-orf25病毒扩增至p1代病毒，以0.5moi感染sf9细胞，感染后第四天收集培养液上清。培养液上清加到有1ml20％蔗糖垫的离心管中，100000×g离心2h，沉淀部分用sds上样缓冲液溶解，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，用抗体进行免疫印迹检测(附图2)。结果表明，cyhv-2膜蛋白orf25展示在杆状病毒表面。

3、重组杆状病毒转导鲫鱼肾细胞并在鲫鱼细胞表面表达cyhv-2膜蛋白orf25

将上述重组杆状病毒racmnpv-orf25加到体外培养的鲫鱼肾细胞单层，以100moi转导，28℃孵育4h后换新鲜培养基，继续培养2天后收集细胞。用不表达orf25的杆状病毒作为对照病毒同样处理鲫鱼肾细胞作为对照细胞。细胞不经穿透处理，直接用抗orf25融合蛋白的抗体和fitc标记的二抗孵育，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度(附图3)。比较后发现racmnpv-orf25处理的鲫鱼肾细胞表面的荧光强度明显高于racmnpv处理的细胞，说明重组杆状病毒racmnpv-orf25能有效转导鲫鱼肾细胞并在其细胞表面表达orf25。

4、重组杆状病毒免疫异育银鲫及其对cyhv-2攻毒的保护力检测

将重组杆状病毒racmnpv-orf25稀释到5l水中(稀释后的杆状病毒滴度为4×

10³tcid50/ml)，将35条异育银鲫放入其中浸浴2小时。以相同滴度的重组杆状病毒racmnpv-gfp作为对照杆状病毒处理免疫对照组，模拟免疫组(mock)用相同体积的pbs处理。免疫后47天，每条鱼腹腔注射50μlcyhv-2病毒进行攻毒。攻毒后30天内，每天记录鱼死亡的数量，绘制异育银鲫的生存率曲线(附图4)。

根据公式：rps＝(1-免疫组死亡率/模拟免疫组死亡率)×100％，计算重组杆状病毒racmnpv-orf25免疫后异育银鲫的相对存活率达83.3％。

本发明的创新思路：本发明构建的重组杆状病毒racmnpv-orf25，不仅在感染昆虫细胞包装产生杆状病毒颗粒的过程中能将cyhv-2的膜蛋白orf25展示在重组杆状病毒表面，而且该重组杆状病毒能有效转导鲫鱼细胞，在鲫鱼细胞表达其基因组携带的orf25融合蛋白基因并将该融合蛋白展示在细胞膜上。用重组杆状病毒racmnpv-orf25对异育银鲫进行简单的浸泡免疫，就可有效地刺激鱼产生针对cyhv-2感染的免疫保护反应。

现有文献报道的cyhv-2的疫苗免疫都采用注射的方式，难以进行大规模的免疫。本发明所述的重组杆状病毒racmnpv-orf25的疫苗免疫方法简单、易操作，便于鲫鱼的大规模免疫。从免疫效果上来看，免疫后异育银鲫的相对存活率高于文献道的cyhv-2灭活疫苗(fish&shellfishimmunology2016；49:344-350)和酵母来源的orf25亚单位疫苗(fish&shellfishimmunology2015；47：1024-1031)。

总的说来，本发明构建的重组杆状病毒racmnpv-orf25具有转导鲫鱼细胞能力，也具有在杆状病毒表面及转导细胞表面展示cyhv-2抗原orf25的能力，用本发明所述的重组杆状病毒对异育银鲫进行浸泡免疫，可以对cyhv-2的感染提供高效的保护。由此说明采用上述实施例1的方法可以获取一种用于防控cyhv-2感染的重组杆状病毒载体疫苗。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种展示cyhv-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用

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