一种分离绵羊肺炎支原体的方法与流程

本发明属于兽医生物技术研究技术领域，具体涉及一种分离绵羊肺炎支原体的方法。

背景技术：

绵羊肺炎支原体是一种可引起羊呼吸系统疾病的微生物。绵羊肺炎支原体既可感染绵羊，也可感染山羊。健康羊鼻腔也可分离出该病原。该病原呈全球性分布。该病原目前在我国流行，给养羊业带来严重威胁。

绵羊肺炎支原体比较娇嫩，分离及培养需要特殊的培养基。改良thiaucourt's培养基是一种常用的绵羊肺炎支原体分离培养基，培养绵羊肺炎支原体效果较其他培养基如改良km2培养基等培养滴度高，效果较好。现有技术绵羊肺炎支原体培养基成分复杂，除含有碳源、氮源、蛋白质、无机盐等诸多营养组分外一般还需要添加10％～20％不等的动物血清。现有技术培养基配制步骤繁琐，常需要准备多达8～9种试剂，此外常需要配制新鲜酵母浸出液、1％naoh、1％的酚红等试剂，配制培养基须经灭菌或滤膜滤过除菌等步骤。现有技术培养绵羊肺炎支原体仍存在繁殖能力差等问题。此外，现有技术培养基中使用血清存在诸多问题，如血清批次差异容易导致培养基批间差异较大、成本高、生物安全、易增加免疫副反应等问题。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种分离绵羊肺炎支原体的方法。

本发明提供一种分离绵羊肺炎支原体的方法，包括以下步骤：

(1)采集样品及样品处理，得到样品接种液；

(2)鸡胚接种：将步骤(1)得到的样品接种液接种7-8日龄健康spf鸡胚，接种后，将鸡胚置于孵化箱中继续培养；

(3)绵羊肺炎支原体的分离：收集接种后死亡鸡胚和/或9d后未死亡鸡胚，取鸡胚尿囊液进行绵羊肺炎支原体进行活菌检测，若收集鸡胚尿囊液绵羊肺炎支原体阳性，进行保存；若第1代鸡胚尿囊液均为阴性，则将收集鸡胚尿囊液盲传鸡胚，方法同上，若盲传3代仍为阴性，则判定样品为绵羊肺炎支原体阴性，弃去。

作为优选，步骤(1)中，所述采集样品及样品处理的具体方法为：无菌棉签采集羊鼻拭子；鼻拭子样品中加入灭菌的0.01mph7.2pbs，用振荡器充分振荡，将棉签挤压干净，弃去棉签，用灭菌的0.01mph7.2pbs补足；取上述样品处理液经滤膜孔径为0.45μm的无菌滤器过滤除菌，取1.0ml滤过液，加入青霉素，置4℃作用12～18小时，得到样品接种液。

作为优选，步骤(2)中，所述接种的方法为鸡胚卵黄囊接种，接种量为每枚0.2ml。

作为优选，步骤(2)中，所述孵化箱中培养的温度为37.0～37.5℃，湿度为50％。

本发明还提供上述的一种分离绵羊肺炎支原体的方法在绵羊肺炎支原体分离中的应用。

与现有技术相比，本发明的方法操作简单，不需要配制成分复杂的绵羊肺炎支原体培养基，避免了现有技术分离培养基配制中常需要高压灭菌或配备大容量滤器等问题；本发明方法可获得不含动物血清的绵羊肺炎支原体。此外，该方法spf鸡胚清洁程度高，无菌，易获得、成本较低、分离率高等优点。因此，本发明方法可用于绵羊肺炎支原体的分离培养，也可用于绵羊肺炎支原体抗原的增殖生产。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为尿囊液分离绵羊肺炎支原体菌落形态。

图2为pcr产物电泳结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

一种分离绵羊肺炎支原体的方法，步骤如下：

(1)采样及样品处理：无菌棉签采集羊鼻拭子。鼻拭子样品中加入3.0ml灭菌的0.01mph7.2pbs，用振荡器充分振荡约1min，用灭菌镊子将棉签挤压干净，弃去棉签，用灭菌的0.01mph7.2pbs补足3.5ml。取上述样品处理液经滤膜孔径为0.45μm的无菌滤器过滤除菌，样品中含有的支原体可透过滤器，取1.0ml滤过液，加入终浓度为20万单位青霉素200μl，置4℃作用12～18小时，得到样品接种液。

(2)鸡胚接种：将处理好的样品接种液接种7～8日龄健康spf鸡胚，于接种前暗室照蛋弃去无精蛋、死胚及弱胚，选择血管清晰、鸡胚活力旺盛的spf鸡胚。采用鸡胚卵黄囊接种，0.2ml/枚，每个样品接种3枚spf鸡胚。接种后，鸡胚置孵化箱继续培养，孵化箱温度37.0～37.5℃，湿度50％。

(3)绵羊肺炎支原体的分离：收集接种后死亡鸡胚及9d后未死亡鸡胚，将鸡胚置于4℃保存12-24h，取鸡胚尿囊液进行绵羊肺炎支原体进行活菌检测。若收集鸡胚尿囊液绵羊肺炎支原体阳性，-70℃保存。若第1代鸡胚尿囊液均为阴性，则将收集鸡胚尿囊液盲传鸡胚，方法同上，若盲传3代仍为阴性，则判定样品为绵羊肺炎支原体阴性，弃去。

实施例1

本发明的一种分离绵羊肺炎支原体的方法，步骤如下：

(1)采样及样品处理：无菌棉签采集山羊鼻拭子。鼻拭子样品中加入3.0ml灭菌的0.01mph7.2pbs，用振荡器充分振荡1min，用灭菌镊子将棉签挤压干净，弃去棉签，用灭菌的0.01mph7.2pbs补足3.5ml。取上述样品处理液经滤膜孔径为0.45μm的无菌滤器过滤除菌，样品中含有的支原体可透过滤器。取1.0ml滤过液，加入终浓度为20万单位青霉素200μl，置4℃作用15小时，为接种液。

(2)鸡胚接种：将处理好的样品接种液接种7日龄健康spf鸡胚，于接种前暗室照蛋弃去无精蛋、死胚及弱胚，选择血管清晰、鸡胚活力旺盛的spf鸡胚。采用鸡胚卵黄囊接种，0.2ml/枚，每个样品接种3枚spf鸡胚。接种后，鸡胚置孵化箱继续培养，孵化箱温度37.0～37.5℃，湿度50％。

(3)绵羊肺炎支原体的分离：收集接种后死亡鸡胚及9d后未死亡鸡胚，将鸡胚置于4℃保存20h，取鸡胚尿囊液进行绵羊肺炎支原体活菌检测；对鸡胚尿囊液进行绵羊肺炎支原体pcr鉴定。上游引物：5’-tgaacggaatatgttagctt-3’，下游引物：5’-gacttcatcctgcactctgt-3’；pcr反应体系：pcrmix12.5μl、ddh2o8.5μl，上游引物、下游引物各1μl、dna2μl。pcr程序：95℃5min，35个循环(95℃30s，55℃30s，72℃30s)，72℃10min，4℃保存。pcr目的片段361bp。

结果显示，鼻拭子样品接种健康spf鸡胚后，接种第2天鸡胚开始出现死亡，收集接种后死亡鸡胚及9d后未死亡鸡胚尿囊液进行活菌检测。

接种后第6天死亡鸡胚尿囊液检测发现，其在mta平板菌落形态符合绵羊肺炎支原体菌落形态(图1)，接种支原体培养基后培养基颜色变黄，表明其生长；尿囊液进行pcr鉴定，绵羊肺炎支原体pcr阳性(图2)。将收集的尿囊液进行绵羊肺炎支原体抗原活菌滴度测定，结果为：10⁵ccu/ml。9d后未死亡鸡胚的检测结果为绵羊肺炎支原体阳性。病料接种无论鸡胚死亡与否，只要有分离到，即为阳性。以上结果表明，应用本发明方法可从鼻拭子样品中分离出绵羊肺炎支原体。

图1为尿囊液分离绵羊肺炎支原体菌落形态。

实施例2

本发明方法与现有技术培养基比较：

同样条件下，用本发明所提供方法与现有技术改良thiaucourt's培养基对绵羊肺炎支原体pcr阳性的鼻拭子样品进行分离。具体方法如下：无菌棉签采集的山羊鼻拭子，加入3.0ml灭菌的0.01mph7.2pbs，用振荡器充分振荡约1min，用灭菌镊子将棉签挤压干净，弃去棉签，用灭菌的0.01mph7.2pbs补足3.5ml。按本发明方法处理样品，接种鸡胚，用于分离绵羊肺炎支原体。另取0.5ml接种至4.5ml改良thiaucourt's培养基，10^-1～10^-3倍稀释，置37℃培养箱中培养，观察培养基颜色变化并做pcr鉴定，判定绵羊肺炎支原体的分离情况。

结果显示，本发明方法可从病料中分离出绵羊肺炎支原体，改良thiaucourt's培养基也可从病料中分离出绵羊肺炎支原体。本发明方法与现有技术培养基比较见表1。与现有技术相比，本发明方法操作简便，不需要配制成分复杂、步骤繁琐的支原体培养基，此外spf鸡胚易获得、避免常规支原体培养基血清使用带来的诸多问题(血清质量不稳定、易被支原体等微生物污染等)，还具有成本低等优点。

图2为pcr产物电泳结果。其中，m为dl5000dnamarker，1为鼻拭子样品收集鸡胚尿囊液pcr产物，2为鼻拭子样品支原体培养基分离物pcr产物，3为阳性对照，4为阴性对照。

表1

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。