大豆GmHsps_p23-like基因及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种大豆gmhsps_p23-like基因及其应用。

背景技术：

大豆的生长过程中，对水的需求量多，干旱严重影响大豆的产量，我国每年因为干旱对大豆产量和品质造成的损失不可估量。作为粮食主产区，东北地区大豆的种植受极端气候事件影响大，特别是高温干旱影响大豆的生产。通过转基因技术提高植物抗旱性，具备并己展现了巨大的应用价值和经济价值。克隆与抗旱性高效相关的基因，并将其转入到基因组中是培育大豆抗旱品种的最有效方法之一。

小热激蛋白(smallheatshockproteins,shsps或hsp20)是一类低分子量的热激蛋白(12-40kda)。植物中的shsps在序列相似性，细胞定位和生物学功能方面比其他hsps家族更加多样化，在外界环境不利条件下，尤其是热胁迫刺激时shsps会大量合成，结构保守的shsps具有分子伴侣的功能，在保护植物免受胁迫和重建细胞稳态方面起着至关重要的作用。植物shsps可以应对各种环境压力，包括热，冷，干旱，盐度和氧化胁迫，shsps还与类囊体膜相互作用，参与植物抗逆。在石竹中已有叶绿体shsps重要性的相关报道。研究发现玉米线粒体shsps(mshsp)在盐胁迫期间显示出保护nadh，改善线粒体电子传递的作用。过表达shsps可以减轻番茄对盐胁迫的耐受性，桑树内质网shsps的积累可以增强其对寒冷胁迫的耐受性等。越来越多的研究表明，shsps的积累与植物对压力耐受性之间存在很强的相关性]。

crispr/cas9是由细菌和古细菌进化而来的一种获得性免疫防御机制，可以应对病毒和质粒的不断攻击。近年来crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)介导的基因编辑技术日渐成熟，已成为生命科学领域表较新颖热门的技术之一。2017年，禹明森等(禹明森,李翔,高马也,etal.生菜crispr/cas9基因编辑体系的建立[j],2017,(4):736-746.)以生菜为研究对象，建立了生菜的crispr/cas9基因编辑体系。zhang等(zhangj,zhangh,botellajr,etal.generationofnewglutinousricebycrispr/cas_9-targetedmutagenesisofthewaxygeneinelitericevarieties[j],2018,60(5):369-375.)利用crispr/cas9系统对粳稻品种的waxy基因进行编辑，在不影响其他理想的农艺性状的前提下，使粳稻转化为糯稻，为改善优秀作物品种提供了一个有效和简便的策略。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种大豆gmhsps_p23-like基因及其应用，该gmhsps_p23-like基因的表达可提高大豆的抗旱能力。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供一种大豆gmhsps_p23-like基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供编码上述大豆gmhsps_p23-like基因的氨基酸序列，如seqidno.2所示。

本发明还提供含有上述大豆gmhsps_p23-like基因的植物超表达载体，所述的超表达载体命名为pcambia3301-gmhsps_p23-like。

本发明还提供含有上述大豆gmhsps_p23-like基因的植物基因编辑载体，所述的基因编辑载体命名为crispr/cas9-gmhsps_p23-like。

本发明还提供上述大豆gmhsps_p23-like基因在植物抗旱中的应用。

本发明的有益效果

本发明提供一种大豆gmhsps_p23-like基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示，本发明利用rt-pcr技术克隆大豆gmhsps_p23-like基因，成功重组了含有草铵膦筛选标记的该基因植物表达载体：pcambia3301-gmhsps_p23-like和crispr/cas9-gmhsps_p23-like。通过农杆菌介导大豆子叶节法，将两套植物表达载体对大豆进行遗传转化。pcr检测结果显示两套载体分别获得3株和2株t1代阳性植株，6株和4株t2代阳性植株。t2代转超表达载体pcambia3301-gmhsps_p23-like大豆植株经southernbloting检测结果显示，外源基因以单拷贝形式插入到基因组中，t2代转基因编辑载体crispr/cas9-gmhsps_p23-like大豆植株目的基因测序分析发现，目的基因被进行了编辑。荧光定量pcr结果显示，gmhsps-p23-like基因在转超表达载体植株中表达量有所上升，而在转基因编辑载体植株中表达量下降不显著。干旱胁迫鉴定结果表明，gmhsps_p23-like基因的表达可提高大豆的抗旱能力。

附图说明

图1为植物超表达载体的t-dna结构示意图；

图2为rna提取凝胶电泳图，1-4：大豆叶片总rna；

图3为gmhsps_p23-like基因的克隆检测图；m：dl2000分子量标准；n：阴性对照；1-4：rt-pcr产物；

图4为克隆载体pcr鉴定电泳图，m：dl2000分子量标准；n：阴性对照；1-2：pcr产物；

图5为克隆载体双酶切验证图，m：dl2000分子量标准；1：克隆载体质粒；2-3：双酶切产物；

图6为表达载体pcambia3301的酶切检测图，m：dl2000分子量标准；1：载体质粒；2-5：双酶切产物；

图7为超表达载体pcambia3301-gmhsps_p23-like的pcr鉴定电泳图，m：dl2000分子量标准；p：阳性对照；n：阴性对照；1-5：pcr产物；

图8为超表达载体pcambia3301-gmhsps_p23-like的双酶切鉴定图，m：dl2000分子量标准；1：质粒；2-3：双酶切产物；

图9为crispr/cas9-gmhsps_p23-like载体pcr鉴定电泳图，m：dl2000分子量标准；n：阴性对照；1-4：pcr产物；a：bar基因；b：启动子35s

图10为crispr/cas9-gmhsps_p23-like载体测序结果比对图；

图11为转化植株bar基因的检测图；m：dl2000分子量标准p：阳性对照n：阴性对照1-17：pcr产物；

a-1：t0代转超表达载体植株pcr检测结果；a-2：t0代转crispr/cas9载体植株pcr检测结果；

b-1：t1代转超表达载体植株及pcr检测结果；b-2：t1代转crispr/cas9载体植株pcr；

c-1：t2代转超表达载体植株pcr检测结果；c-2：t2代转crispr/cas9载体植株pcr检测结果；

图12为t2代转超表达载体pcambia3301-gmhsps_p23-like大豆植株的southernbloting检测图；m：southern标准分子量；p：阳性对照；n：阴性对照；1-2：t2代转化植株；

图13为测序峰图分析，a：cr1-1测序结果；b：cr1-2测序结果；

图14为gmhsps_p23-like基因的相对表达量；

图15为复水试验测试图，jn18：受体大豆植株；ov：转超表达载体植株；cr：转crispr/cas9基因编辑载体植株

图16为胁迫不同时间抗旱相关生理生化指标检测图，a：sod活性b：pro含量c：pod活性d：mda含量。

具体实施方式

下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，来源均为商购。

受体大豆品种材料：吉农18大豆(‘jn18’)、大肠杆菌菌株dh5α、农杆菌菌株eha105和植物表达载体pcambia3301由吉林农业大学玉米及油料作物种质资源创新与分子育种创新团队实验室保存提供。

实施例1大豆gmhsps_p23-like基因的克隆与鉴定

参照rnaisoplus(宝生物工程(大连)有限公司)说明书推荐步骤进行大豆‘jn18’七叶期叶片总rna提取。使用all-in-one^tmfirst-strandcdnasynthesis(genecopoeia)获得大豆cdna，使用primerpremier5.0软件，设计引物p23s/p23as(序列见表1，由吉林省长春库美生物科技有限公司合成)，以cdna为模板进行pcr扩增，扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃后延伸8min，4℃保存。切胶回收目的片段送至吉林省长春库美生物科技有限公司进行测序，比对测序结果。测序正确的目的片段与克隆载体pmd-18t进行连接，转化大肠杆菌dh5α。

表1

表1引物序列

2％琼脂糖凝胶电泳检测提取的大豆总rna如图2所示，对质量好的总rna进行反转录生成cdna，pcr扩增后胶回收特异性条带如图3；图2说明，大豆总rna条带亮度清晰，说明总rna质量较高，可用于下一步实验，以cdna为模板pcr扩增后的特异性条带见图3，条带大小480bp与大豆gmhsps_p23-like基因大小一致；对重组克隆载体进行pcr(图4)和双酶切鉴定(图5)，分别得到480bp的目的条带，大小与预期一致，证明目的基因克隆成功并重组了该基因的克隆载体。大豆gmhsps_p23-like基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

实施例2植物超表达载体pcambia3301-gmhsps_p23-like的构建

根据赛默飞在线双酶切设计工具doubledigestcalculator推荐的双酶切体系，利用bglii和bsteii内切酶，对植物表达载体pcambia3301质粒进行双酶切，37℃孵育4.5h，80℃5min终止酶切反应。胶回收载体大片段使用t4dnalinkingenzyme(宝生物工程(大连)有限公司)与切胶回收产物进行连接，对大肠杆菌dh5α感受态细胞进行转化，对提取的单克隆菌落质粒进行pcr和双酶切验证后，进行测序比对。植物超表达载体t区结构如图1。

pcambia3301质粒双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离(图6)，胶回收载体大片段，并通过t4dna连接酶将目的片段与之连接，提取转化后的大肠杆菌单菌落质粒，进行pcr(图7)和双酶切鉴定(图8)，所得到条带大小与预期一致，测序比对结果一致性100％，证明该基因植物超表达载体构建成功。

实施例3植物基因编辑载体crispr/cas9-gmhsps_p23-like的构建

使用百格生物的crispr/cas9载体构建试剂盒进行构建，构建过程严格按照说明书进行。构建过程包括设计oligo引物，oligo二聚体的制备，crispr/cas9载体骨架的连接和大肠杆菌的转化。提取质粒，利用该载体上筛选标记基因bar引物和启动子35s引物(序列见表1)对构建好的crispr/cas9载体进行pcr检测并测序。

提取转化后的单克隆菌落质粒，利用bar基因引物和35s启动子引物进行质粒pcr鉴定(图9)，从图中可以看出，得到552bp和500bp的特异性条带，初步证明载体构建成功。利用测序引物(cri)，对保存重建的crispr/cas9载体质粒进行测序，使用dnaman比对，一致性为100％，证明gmhsps_p23-like基因的crispr/cas9基因编辑载体构建成功。

实施例4大豆的遗传转化及检测

本试验采用吴楠农杆菌侵染大豆子叶节法，将两套植物表达载体对受体大豆品种(jn18)进行遗传转化，最终得到转化植株。

1、转基因植株的pcr检测

gmhsps_p23-like基因来源于受体大豆，因此选取bar，35s序列进行pcr检测。对转化植株叶片进行dna提取，pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃后延伸8min；4℃保存；其中bar基因扩增产物大小为552bp，35s基因扩增产物大小为500bp，胶回收扩增产物测序。

通过农杆菌介导大豆子叶节法将两套植物表达载体进行大豆(jn18)的遗传转化(图11)，对获得的转化植株进行pcr检测，结果显示获得转超表达载体t0代大豆阳性植株3株，转化率1.24％；获得转基因编辑载体t0代大豆阳性植株5株，阳性率2.11％。温室加代培养，pcr检测结果为分别得到14和21株t1代植株。人工气候室在花盆中种植部分t2代植株，pcr检测结果为分别得到17株和11株t2代阳性植株。各世代pcr检测结果见图10，扩增片段与bar基因552bp大小一致。

2、t2代植株southernbloting检测

采用sds法对pcr检测阳性的t2代转化植株和受体大豆叶片‘jn18’dna进行提取，使用hindiii限制性内切酶对提取的dna酶切过夜，以bar基因为目标制备探针，参考digdnalabelinganddetectionkiti试剂盒(罗氏公司)说明书进行southernbloting检测。结果见图12。检测的t2代转化植株中，有2株出现杂交信号，在基因组中的整合的位点不同。

3、t2代转化植株基因编辑检测

为了确定crispr/cas9基因编辑载体是否对大豆gm_hsps23-like基因靶位点进行有效编辑，以(p23s/p23as)引物对转crispr/cas9载体阳性植株基因组dna进行pcr，对产物进行测序分析，cr1-1植株测序结果如图13a，在第408bp和411bp处出现套峰，可知在该位点碱基发生了错配突变，cr1-2植株测序结果如图13b，可知在第119bp和130bp处编碱基发生了错配，证明两株转基因植株的目的基因被crispr/cas9载体进行了编辑。

4、t2代植株荧光定量pcr检测

分别提取t2代转化阳性大豆植株和未转化植株的rna进行反转录。以cdna为模板，选取大豆肌动蛋白(根据β-大豆肌动蛋白基因序列设计，genbankidnm_001252731.2)为内参基因，yp23s/yp23as为荧光定量目的基因引物，进行qrt-pcr。按照康为公司生产的qpcrmix说明书进行，在mx3000p荧光定量pcr中，采用两步法，每个样品三次重复，待程序结束，输出并保存结果。相对表达水平根据2^-△△ct方法进行计算及分析。

2^-△△ct＝2^{-[(tb目的基因-tb内参基因)-(对照目的基因-对照内参基因)]}

选择sybrgreen作为染料，对gmhsps_p23-like基因在转基因植株叶片中的表达量进行了荧光定量pcr检测，数据整理后制成柱形图，见图14。从图中可以看出，转超表达载体植株的相对表达量是对照的343％和188％，证明该基因被超量表达；而经过基因编辑的目的基因表达量是对照的74.65％和86.91％，表达量被影响有所下降。

实施例5转基因大豆抗旱性测试

1、复水试验

在人工气候室内分别将t2代转基因大豆和受体‘jn18’大豆播种在同一盆营养土中，正常浇水培养，当大豆植株生长至三出复叶期停止给水，模拟自然干旱胁迫，观察转基因材料与对照的生长情况。模拟干旱胁迫处理10d后恢复给水，记录转基因材料和对照组大豆生长恢复状态。

干旱胁迫3d后恢复浇水，观察前后大豆植株的生长状况(图15)。转超表达载体植株(ov)舒张迅速，叶片鲜绿，干旱胁迫对其生长状态影响较小。转crispr/cas9载体植株(cr)相比较对照组，叶片卷曲情况未明显改善，植株矮小，干旱胁迫对其生长状态影响较明显。说明复水后转超表达载体植株恢复正常生长迅速，干旱对植株损害程度低，而转crispr/cas9基因编辑载体的植株恢复正常生长慢，干旱胁迫对植株损害程度高。初步证明gmhsps_p23-like基因的表达可提高大豆抗旱能力。

2、抗旱相关生理生化指标的测定

选取超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、丙二醛(mda)和脯氨酸(pro)抗旱相关生理生化指标，对模拟干旱胁迫前后大豆叶片，使用试剂盒法(苏州科铭生物技术有限公司)分别对各项指标进行检测。

干旱胁迫前后各项指标检测结果整理成柱形图(图16)，从结果可知，转超表达载体植株在胁迫后sod、pod活性及pro含量上升趋势显著，mda含量上升趋势不显著，说明植株积极应对缓解干旱胁迫对其造成的不良氧化反应，有较强的抗旱性；转基因编辑载体的大豆植株各项生理生化指标变化趋势表明，植株受干旱影响程度高，细胞受损程度明显，植株抗旱能力有所下降。

本试验成功克隆得到了大豆gmhsps_p23-like基因，并构建了两套植物表达载体，分别对大豆进行遗传转化获得了转基因大豆植株，在大豆中验证了该基因的表达可提高大豆抗旱性，与前人对对热激蛋白家族基因研究成果一致。

序列表

<110>吉林农业大学

<120>大豆gmhsps_p23-like基因及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>480

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggatttcagagtgatgggtttggagtctccactgttccacacgctgcaacacatgatg60

gacatgtcagaggacggtgcaggagacaacaagacacacaatgctccaacatggtcatac120

gttcgagacgcgaaagcaatggctgcaacacctgcggatgtgaaggagtatccgaattct180

tacgtgttcgagatcgacatgccgggtttgaaatctggggacataaaggttcaagttgaa240

gacgacaacctgcttctgatatgtggggaacgaaagagggacgaagagaaagaaggggcg300

aagtatttgagaatggagagaagggttgggaagttaatgcgcaagtttgtgctgcctgag360

aatgccaacactgatgcaatctctgctgtgtgccaagatggtgtgcttagtgtaaccgtg420

cagaaattgcctccacctgagcctaagaaacctaggactattcaggttaaggttgcttga480

<210>2

<211>159

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metasppheargvalmetglyleugluserproleuphehisthrleu

151015

glnhismetmetaspmetsergluaspglyalaglyaspasnlysthr

202530

hisasnalaprothrtrpsertyrvalargaspalalysalametala

354045

alathrproalaaspvallysglutyrproasnsertyrvalpheglu

505560

ileaspmetproglyleulysserglyaspilelysvalglnvalglu

65707580

aspaspasnleuleuleuilecysglygluarglysargaspgluglu

859095

lysgluglyalalystyrleuargmetgluargargvalglylysleu

100105110

metarglysphevalleuprogluasnalaasnthraspalaileser

115120125

alavalcysglnaspglyvalleuservalthrvalglnlysleupro

130135140

proprogluprolyslysproargthrileglnvallysvalala

145150155