图案化阵列的制备的制作方法

本申请是申请日为2014年12月05日、申请号为201480074862.7、发明名称为“图案化阵列的制备”的中国专利申请(pct申请号为pct/us2014/068955)的分案申请。交叉引用本申请要求于2013年12月5日提交的美国临时申请号61/912,027、于2014年3月28日提交的美国临时申请号61/971,542、于2014年4月14日提交的美国临时申请号61/979,448以及于2014年6月13日提交的美国临时申请号62/012,238的权益，每一个申请均通过引用全文并入本文。
背景技术：
：图案化阵列在基因组学和分子诊断学中具有许多应用。然而，许多阵列制备方法产生质量差的探针、不完全的(partial)探针、对于延伸反应而言错误定向的或处于对酶促反应不是非常有效的表面上的探针。本公开内容提供了具有酶相容表面、较高质量探针以及各种朝向的探针的方法和组合物。技术实现要素：提供了用于制备图案化寡核苷酸阵列的方法、组合物和系统，其产生具有所需朝向并且低成本的高质量全长探针。在一些实施方案中，采用酶促转移制备图案化的寡核苷酸阵列，其中使来自接受体表面的引物与模板表面上的模板杂交，并且采用模板进行的聚合酶驱动延伸反应产生第二链。在两个表面分离后，接受体表面含有与第一表面图案互补的拷贝的寡核苷酸图案。或者，模板可以与含有连接体的引物杂交，该连接体可以用于将引物固定至接受体表面。然后可以使引物延伸并且例如通过在接受体表面上形成聚合物凝胶的薄层而固定至接受体表面上。可以通过扩增如桥式扩增来增强所得的拷贝的特征。可以酶处理在3’端含有衔接子的扩增的探针，以去除衔接子序列。在一个方面，本文提供了一种用于生成阵列的方法，其包括：提供包含与其偶联的至少1,000个不同寡核苷酸的模板阵列；将所述模板阵列与接受体阵列偶联，该接受体阵列具有与所述至少1,000个不同寡核苷酸的部分互补的多个寡核苷酸；以及在该模板阵列与酶阵列彼此偶联时进行酶促反应，由此生成包含接受体寡核苷酸的接受体阵列，其中至少40％的接受体寡核苷酸与来自所述至少1,000个不同寡核苷酸的全长寡核苷酸互补或相同。在一些情况下，该模板阵列包含至少100个斑点(spot)。在一些情况下，该模板阵列包含大小至多为约500μm的斑点。在一些情况下，接受体寡核苷酸相对于接受体阵列的方向性与模板寡核苷酸相对于模板阵列的方向性相同。在一些情况下，接受体寡核苷酸相对于接受体阵列的方向性与模板寡核苷酸相对于模板阵列的方向性相反。在一些情况下，生成多个接受体阵列。在一些情况下，在接受体阵列彼此之间，所述多个接受体寡核苷酸平均至少99％相同。在一些情况下，在接受体阵列彼此之间，所述接受体寡核苷酸至少99％相同。在一个方面，本文提供了一种用于生成阵列的方法，其包括：使用包含模板寡核苷酸的模板阵列合成包含接受体寡核苷酸的接受体阵列，其中在合成期间，该接受体阵列与该模板阵列偶联。在一些情况下，至少40％的接受体寡核苷酸包含全长产物。在一些情况下，至少50％的接受体寡核苷酸包含全长产物。在一些情况下，至少60％的接受体寡核苷酸包含全长产物。在一些情况下，接受体寡核苷酸相对于接受体阵列的方向性与模板寡核苷酸相对于模板阵列的方向性相同。在一些情况下，接受体寡核苷酸相对于接受体阵列的方向性与模板寡核苷酸相对于模板阵列的方向性相反。在一些情况下，生成多个接受体阵列。在一些情况下，在接受体阵列彼此之间，所述多个接受体寡核苷酸平均至少99％相同。在一些情况下，在接受体阵列彼此之间，所述接受体寡核苷酸至少99％相同。在一些情况下，在每一个接受体阵列合成之后，将所述模板阵列与每一个接受体阵列物理分离。在一些情况下，在每一个接受体阵列合成之后，通过升高温度将所述模板阵列与每一个接受体阵列分离。在一些情况下，所述模板阵列包含至少100个斑点。在一些情况下，所述模板阵列包含大小至多为约500μm的斑点。在一个方面，本文提供了一种用于生成互补阵列的方法，其包括：(a)提供与第一基底偶联的多个模板寡核苷酸，所述多个模板寡核苷酸中的每一个均包含衔接子序列，其中对于所述多个模板寡核苷酸中的每一个，所述衔接子序列均相同；(b)提供与第二基底偶联的多个接受体寡核苷酸，所述多个接受体寡核苷酸中的每一个均包含与所述衔接子序列互补的序列；(c)使所述模板寡核苷酸的所述衔接子序列与所述接受体寡核苷酸的互补于所述衔接子序列的所述序列杂交；以及(d)使用所述多个模板寡核苷酸作为模板，对所述多个接受体寡核苷酸进行延伸反应。在一些情况下，所述衔接子序列中的每一个均位于所述模板寡核苷酸的3’端或该3’端附近。在一些情况下，所述衔接子序列中的每一个均位于所述模板寡核苷酸的5’端或该5’端附近。在一些情况下，所述基底中的任一个包含聚合物。在一些情况下，所述基底中的任一个包含丙烯酰胺或聚丙烯酰胺。在一些情况下，进行步骤导致生成至少40％为全长产物的接受体寡核苷酸。在一些情况下，进行步骤导致生成至少50％为全长产物的接受体寡核苷酸。在一些情况下，进行步骤导致生成至少60％为全长产物的接受体寡核苷酸。在一些情况下，接受体寡核苷酸相对于第二基底的方向性与模板寡核苷酸相对于第一基底的方向性相同。在一些情况下，接受体寡核苷酸相对于第二基底的方向性与模板寡核苷酸相对于第一基底的方向性相反。在一些情况下，重复所述方法以产生至少2个接受体阵列。在一些情况下，所述模板阵列包含至少100个斑点。在一些情况下，所述模板阵列包含大小至多为约500μm的斑点。在一个方面，本文提供了一种用于转移阵列的方法，其包括：(a)提供包含多个连接体位点的基底；(b)提供包含多个模板寡核苷酸的阵列；(c)向所述阵列施加反应混合物，所述反应混合物包含酶、dntp以及多个连接体寡核苷酸，该连接体寡核苷酸包含与附加至所述多个模板寡核苷酸中的每一个上的衔接子序列互补的序列，并且进一步包含能够结合至所述多个连接体位点的连接体分子；(d)使用所述多个模板寡核苷酸作为模板进行所述多个所述连接体寡核苷酸的延伸反应，由此生成包含所述连接体分子的多个延伸产物；(e)使所述阵列与所述基底接触；以及(f)将所述多个延伸产物的所述连接体分子连接至所述连接体位点。在一些情况下，所述衔接子序列位于所述模板寡核苷酸的3’端或该3’端附近。在一些情况下，所述衔接子序列位于所述模板寡核苷酸的5’端或该5’端附近。在一些情况下，所述基底包含聚合物。在一些情况下，所述基底包含丙烯酰胺或聚丙烯酰胺。在一些情况下，所述模板阵列包含至少100个斑点。在一些情况下，所述模板阵列包含大小至多为约500μm的斑点。援引并入本说明书中提及的全部出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文。附图说明本发明的新特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案进行阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明特征和优点的更好的理解，附图中：图1示出了模板表面的不同形状的实例。图2a示出了通过合成的酶促转移(ets)的一般示意图。图2b示出了导致核酸相对于基底的不同朝向的酶促转移的示意图。图2c示出了导致全长链的转移的酶促转移的示意图。图3示出了在接受体表面上从模板表面合成的示意图。图4示出了寡核苷酸固定化转移(oit)的第一阶段的示意图。图5示出了寡核苷酸固定化转移(oit)的第二阶段的示意图。图6示出了用于去除衔接子序列的探针末端剪切(pec)的示意图。图7示出了在切口位点处的探针末端剪切(pec)的示意图。图8示出了非酶促凝胶转移的示意图。图9示出了采用交联剂1,4-亚苯基二异硫氰酸酯(pditc)将寡核苷酸附接至硅烷化后的玻璃表面的第一阶段的示意图。图10示出了采用pditc将寡核苷酸附接至硅烷化后的玻璃表面的第二阶段的示意图。图11示出了如图9-10所示采用pditc附接至硅烷化的玻璃表面的寡核苷酸的凝胶转移。图12示出了具有通过酶促延伸转移的簇的模板载玻片(左侧)和凝胶芯片(右侧)。图13示出了来自图12的模板(左侧)和凝胶拷贝(右侧)的放大图像。图14示出了模板(左侧)和凝胶拷贝(右侧)的强度的比较，后者具有比前者低约100倍的强度。图15示出了与不存在模板的阴性对照表面相比，向凝胶拷贝的酶促转移。图16示出了包含以棋盘样图案附接至表面的荧光标记的寡核苷酸的模板阵列。图17示出了图16中的表面的放大视图。图18示出了非酶促凝胶转移后的模板，具有来自合成链(左侧)和另一条链(右侧)的信号。图19示出了非酶促凝胶转移之前(左侧)和之后(右侧)的模板。图20示出了来自凝胶延伸的链转移(左侧)和撕下凝胶的模板链转移(右侧)的拷贝。图21示出了采用10x2s2bin(左侧)和10x0.5s10bin(右侧)的凝胶图像。图22示出了与不存在酶的阴性对照表面(右侧)相比，向凝胶拷贝(左侧)的酶促转移。图23示出了采用本文所述的面对面酶促凝胶转移过程(例如，通过合成的酶促转移或ets)进行5次酶促转移之前(左侧)和之后(右侧)的模板阵列。图24示出了酶促转移后的簇扩增。图25示出了在不使用基于pyrophage的线性pcr打印的情况下生成的打印(即，阵列)图像，在20s曝光、10x、1bin、100-600下拍摄，与cy3-compsp2杂交。图26示出了在不使用基于pyrophage的线性pcr打印的情况下生成的打印(即，阵列)图像，在20s曝光、10x、1bin、100-4095下拍摄，与cy3-compsp2杂交。图27示出了使用基于pyrophage的线性pcr打印在55℃下打印1hr生成的打印(即，阵列)图像，在20s曝光、10x、1bin、1400-4095下拍摄，与cy3-compsp2杂交。图28示出了采用基于pyrophage的线性pcr打印、从第一表面到第二表面1hr、4hr或过夜而生成的打印(阵列)图像的比较。在所有图像中拍摄的所有图像均采用10s曝光、100-2000拍摄。图29示出了通过在55℃下1hr的基于bst的打印、从第一表面到第二表面1hr、2hr、3hr、4hr、6hr和过夜而生成的图像的比较。从第一表面到第二表面的4hr基于bst的打印给出了在55℃下的最佳打印信号。在所有图像中拍摄的所有图像均采用10s曝光、100-2000拍摄。图30示出了在55℃下合成1hr、从第一表面到第二表面(5’->3’合成的)的基于bst的打印的图像。所有图像均采用10s曝光、200-2000拍摄。图31示出了在1微米下分辨的基于bst的打印。图32示出了bst过夜打印的第二表面，其作为模板用来向br-ac第三表面上进行另一个bst过夜打印，10s曝光，10x，1bin，100-600，cy3-compsp2。图33示出了从过夜打印的第二表面过夜打印的br-ac第三表面(10s曝光，10x，1bin，200-1700，与cy3-fc2杂交)。图34示出了从过夜打印的第二表面pyrophage打印并扩增的br-ac第三表面。pcr后使用user酶切割一条链(10s曝光，10x，1bin，1500-3000，cy3-am2)。具体实施方式i.概述本公开内容提供了用于制备图案化阵列以及将图案化阵列从模板阵列转移至转移阵列的方法和组合物。如本文所用的，模板阵列是指偶联有多个聚合物分子例如核酸、寡核苷酸或适体的基底。核酸可以是寡核苷酸。模板阵列上的聚合物可以视情况被称为模板聚合物、模板核酸、模板寡聚物、模板寡核苷酸或模板适体。该模板聚合物可以是双链的或者可以解链成单链的。为生成具有所需朝向(例如，5’端附接至阵列基底)的阵列的拷贝，可以采用面对面凝胶转移过程。该面对面凝胶转移过程可以显著降低单位制备成本，同时翻转寡核苷酸朝向以便将5’端固定，这可以具有如本文所述的测定优势。此外，全长寡核苷酸的选择性转移以及随后的全长寡核苷酸的扩增可以使寡核苷酸阵列含有非常长的寡核苷酸(50+或更多个碱基)而不会遭受如本文所述的低产率或部分长度产物。该转移可以包括生成与模板寡核苷酸序列互补的核酸序列。该转移过程可以通过酶复制或通过阵列组分在表面之间的非酶促物理转移而发生。转移可以包括制备已附接至接受体/转移阵列的互补序列。例如，结合至接受体/转移阵列的引物与模板阵列上的衔接子互补，并且可以采用模板阵列序列作为模板进行延伸，由此生成全长或部分长度的转移阵列。转移可包括从模板阵列制备互补序列，随后将该互补序列附接至转移阵列。转移可以保留核酸相对于其偶联的阵列表面的朝向(例如，模板核酸的3’端结合至模板阵列，并且转移的核酸互补体的3’端结合至转移阵列)。转移可以逆转核酸相对于其偶联的阵列表面的朝向(例如，模板核酸的3’端结合至模板阵列，并且转移的核酸互补体的5’端结合至转移阵列)。在一些情况下，本文所述的阵列转移方法对于生成具有增加或富集量或百分比的寡核苷酸的转移或接受体阵列是有用的，该寡核苷酸偶联至转移或接受体阵列表面，并且该寡核苷酸的长度为用作转移程序的模板的阵列(即，模板阵列)上相应寡核苷酸的长度的100％(即，相同或等同的长度)。该转移程序可以是如本文提供的面对面酶促转移。该面对面酶促转移方法还可以被称为通过合成的酶促转移或ets。阵列转移可以产生包含至少、至多、多于、少于或大约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％转移的寡核苷酸的转移或接受体阵列，该转移的寡核苷酸的长度为用于生成该转移或接受体阵列的模板阵列上相应寡核苷酸的长度的100％或与该相应寡核苷酸的长度相同或等同。长度为模板寡核苷酸的长度的100％(即，相同或等同的长度)的转移的寡核苷酸可以被称为全长产物(例如，全长产物寡核苷酸)。通过本领域已知的方法(例如，点印法或原位合成)制备的模板阵列可以包含约20％的所需长度的寡核苷酸(即，全长寡核苷酸)和约80％的非所需长度的寡核苷酸(即，部分长度寡核苷酸)。采用如本文提供的阵列转移方法(例如，ets)转移通过本领域已知的方法生成的、包含约20％全长寡核苷酸和约80％部分长度寡核苷酸的阵列可以导致生成包含至多约20％全长产物寡核苷酸的转移或接受体阵列。可使用包含与模板阵列上全长寡核苷酸的未结合端处的序列互补的引物的转移阵列进行转移；包含约20％全长寡核苷酸和约80％部分长度寡核苷酸的模板阵列上的许多或全部部分长度产物缺少在本文提供的阵列转移(例如，ets)中使用的序列的未结合端部，并因此不能被转移。在一些情况下，根据本文的方法制备的阵列具有更大百分比的具有所需长度的寡核苷酸(即，全长寡核苷酸)，使得采用本文提供的阵列转移方法(即，ets)转移根据本文的方法制备的阵列导致生成与本领域已知的制备和转移方法相比具有更高百分比的全长产物寡核苷酸的转移或接受体阵列。采用本文提供的方法制备的阵列(例如，模板阵列)上的全长寡核苷酸可以为大约、至多或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个碱基长。采用本文提供的阵列转移方法(即，ets)转移的转移或接受体阵列上的全长产物寡核苷酸可以为大约、至多或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个碱基长。如本文提供的阵列转移可以进行多次。在一些情况下，模板阵列(例如，寡核苷酸阵列)经历多次阵列转移过程。模板阵列可以经历至少、至多、多于、少于或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000次阵列转移过程。阵列转移过程可以是如本文提供的面对面酶促转移方法。可以采用相同模板阵列由多次阵列转移生成多个转移或接受体阵列。采用本文提供的阵列转移方法从单个模板阵列生成的每个转移或接受体阵列均可以与该模板阵列和/或从该模板阵列生成的每一个其他转移或接受体阵列至少、至多、大于、小于或大约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同。通过使用来自一次阵列转移的转移阵列作为随后转移的模板阵列，阵列转移可以在一系列的转移中多次进行。例如，可以从具有在其3’端处与阵列结合的寡核苷酸的模板阵列到具有在其5’端处与阵列结合的互补寡核苷酸的第一转移阵列进行第一次转移，并且可以从该第一转移阵列(现在充当模板阵列)到第二转移阵列进行第二次转移。在一些情况下，在如本文提供的一系列阵列转移反应中的每一个渐进转移或接受体阵列均产生具有富集百分比的全长产物寡核苷酸(即，长度为模板寡核苷酸长度的100％的转移的寡核苷酸)和与原始模板阵列匹配的序列的接受体或转移阵列。在一些情况下，可以通过使用在模板寡核苷酸阵列上的寡核苷酸上的衔接子序列来帮助阵列转移。寡核苷酸可以包含所需的最终序列，外加一个或多个衔接子序列。该一个或多个衔接子序列可以在模板阵列上的寡核苷酸的5’或3’端上。在一些情况下，该一个或多个衔接子序列在模板阵列上的寡核苷酸的3’端上。在一些情况下，该一个或多个衔接子序列在模板阵列上的寡核苷酸的5’端上。在接受体/转移阵列上的引物可以与衔接子序列互补，从而允许该引物与模板阵列上的寡核苷酸之间的杂交(通过与该衔接子序列的全部或一部分杂交)。这样的杂交可以帮助从一个阵列到另一个阵列的转移。可以在转移后通过例如酶切、消化或限制性处理，从转移阵列寡核苷酸中去除一些或全部衔接子序列。在一些情况下，可以通过阵列或阵列上的表面涂层的柔性或可变形性来帮助阵列转移。例如，可以在阵列转移中使用包含具有偶联的寡核苷酸的聚丙烯酰胺凝胶涂层的阵列。该凝胶涂层的可变形性可以允许阵列组分彼此接触，即使存在表面粗糙度。该可变形性可以允许酶促阵列转移方法(例如，本文提供的ets)中需要的酶与不包含聚丙烯酰胺凝胶的阵列相比更有效地与反应组分接触。这种更有效的接触可以允许与不包含聚丙烯酰胺凝胶的阵列相比更大数目的酶促转移。这种更有效的接触可以允许生成更大百分比的转移或接受体阵列，该阵列包含长度为阵列转移方法中使用的模板阵列上寡核苷酸的长度的100％的寡核苷酸。可以通过酶促反应扩增或再生阵列组分。例如，可以通过阵列组分上的衔接子序列与结合至表面的寡核苷酸引物之间的杂交，及随后的酶促延伸或扩增，来对阵列组分寡核苷酸进行桥式扩增。可以使用扩增来恢复损失的阵列组分密度或将阵列组分的密度增加至超出其原始密度。ii.核酸及其来源除非另有说明，如本文提及的“核酸分子”或“核酸”可以是脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，包括其已知的类似物或组合。本文中待测序的核酸分子可以从任何核酸来源获得。该核酸分子可以是单链或双链的。在一些情况下，该核酸分子是dna。该dna可以采用本领域的标准技术来获得和纯化，并且包括纯化或未纯化形式的dna。该dna可以是线粒体dna、无细胞dna、互补dna(cdna)或基因组dna。在一些情况下，该核酸分子是基因组dna(gdna)。该dna可以是质粒dna、粘粒dna、细菌人工染色体(bac)或酵母人工染色体(yac)。该dna可以来源于一个或多个染色体。例如，如果该dna来自人类，则该dna可以来源于染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、x或y中的一个或多个。该rna可以采用本领域的标准技术来获得和纯化，并且包括纯化或未纯化形式的rna，包括但不限于mrna、trna、snrna、rrna、逆转录病毒、小的非编码rna、微rna、多核糖体rna、前mrna、内含子rna、病毒rna、无细胞rna及其片段。非编码rna或ncrna可以包括snorna、微rna、sirna、pirna和长ncrna。供本文所述的方法和组合物使用的核酸的来源可以是包含该核酸的样品。该核酸可以从该样品中分离并通过本领域已知用于从样品中纯化核酸的任何方法纯化。该样品可以来源于包含多核苷酸的非细胞实体(例如，病毒)或来源于基于细胞的生物体(例如，古菌、细菌或真核生物域的成员)。在一些情况下，该样品从诸如门或台面等表面的拭子获得。该样品可以来自受试者，例如，植物、真菌、真细菌、古细菌、原生生物(protest)或动物。该受试者可以是生物体，无论是单细胞的还是多细胞的生物体。该受试者可以是培养的细胞，其可以是原代细胞或来自建立的细胞系的细胞，等等。样品可以最初以任何合适的形式从多细胞生物体中分离。该动物可以是鱼，例如，斑马鱼。该动物可以是哺乳动物。该哺乳动物可以是例如狗、猫、马、牛、小鼠、大鼠或猪。该哺乳动物可以是灵长类动物，例如人、黑猩猩、猩猩或大猩猩。该人可以是男性或女性。该样品可以来自人类胚胎或人类胎儿。该人可以是婴儿、儿童、少年、成人或老人。该女性可以是妊娠的、疑似妊娠的或计划妊娠的女性。在一些情况下，该样品是来自受试者的单一或单个细胞，并且该多核苷酸来源于该单一或单个细胞。在一些情况下，该样品是单个微生物，或微生物群体，或微生物和宿主细胞或无细胞核酸的混合物。该样品可以来自健康的受试者(例如，人类受试者)。在一些情况下，该样品取自妊娠至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26周的受试者(例如，待产妇女)。在一些情况下，该受试者患有遗传性疾病，是遗传性疾病的携带者，或处于遗传或发展出遗传性疾病的风险中，其中遗传性疾病是可能与遗传变异如突变、插入、添加、缺失、易位、点突变、三核苷酸重复障碍和/或单核苷酸多态性(snp)有关的任何疾病。该样品可以来自患有特定疾病、病症或病况，或疑似患有特定疾病、病症或病况(或处于患有该特定疾病、病症或病况的风险中)的受试者。例如，该样品可以来自癌症患者，疑似患有癌症的患者，或处于患有癌症的风险中的患者。该癌症可以是例如急性成淋巴细胞性白血病(all)、急性髓样白血病(aml)、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、肛门癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑癌、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、松果体实质肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、类癌瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、结肠癌、结直肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、原位导管癌、子宫内膜癌、食管癌、尤文肉瘤、眼癌、眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤、纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、唇癌、口腔癌、肺癌、非小细胞癌、小细胞癌、黑素瘤、口癌、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、髓母细胞瘤、鼻腔癌、鼻窦癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞肿瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、非黑素瘤、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、waldenstrom巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。该样品可以来自癌症患者的癌和/或正常组织。该样品可以是房水、玻璃状液、胆汁、全血、血清、血浆、乳汁、脑脊液、耵聍、内淋巴、外淋巴、胃液、粘液、腹膜液、唾液、皮脂、精液、汗液、泪液、阴道分泌物、呕吐物、粪便或尿液。该样品可以从医院、实验室、临床或医学实验室获得。该样品可以取自受试者。该样品可以是包含诸如水、土壤、空气等介质的环境样品。该样品可以是法医样品(例如，毛发、血液、精液、唾液等)。该样品可以包含在生物恐怖袭击(例如，流感、炭疽、天花)中使用的试剂。该样品可以包含核酸。该样品可以包含无细胞核酸。该样品可以是细胞系、基因组dna、无细胞血浆、福尔马林固定石蜡包埋的(ffpe)样品或快速冷冻的样品。福尔马林固定石蜡包埋的样品可以在提取核酸之前脱蜡。该样品可以来自器官，例如心脏、皮肤、肝、肺、乳房、胃、胰、膀胱、结肠、胆囊、脑等。可以通过本领域普通技术人员可用的手段从样品中提取核酸。可对样品进行处理以使其能够进行片段化、连接、变性、扩增、拉伸和/或测序或本文提供的任何方法。示例性的样品处理可以包括裂解样品的细胞以释放核酸，纯化样品(例如，以将核酸与可能抑制酶促反应的其他样品组分分离)，稀释/浓缩样品，和/或将样品与用于进一步核酸处理的试剂合并。在一些实例中，可以将样品与限制酶、逆转录酶或任何其他核酸处理酶合并。本文所述的方法可以用于对一种或多种靶核酸或多核苷酸进行测序。本文所述的多核苷酸可含有磷酸二酯键，虽然在如下所示的一些情况下(例如在引物和探针如标记探针的构建中)，也包括可具有替代骨架的核酸类似物，其包含例如磷酰胺(beaucage等人,tetrahedron49(10):1925(1993)及其中的参考文献；letsinger,j.org.chem.35:3800(1970)；sprinzl等人,eur.j.biochem.81:579(1977)；letsinger等人,nucl.acidsres.14:3487(1986)；sawai等人,chem.lett.805(1984)，letsinger等人,j.am.chem.soc.110:4470(1988)；和pauwels等人,chemicascripta26:14191986))、硫代磷酸酯(mag等人,nucleicacidsres.19:1437(1991)；和美国专利5,644,048)、二硫代磷酸酯(briu等人,j.am.chem.soc.111:2321(1989)、o-甲基亚磷酰胺(methylphophoroamidite)连接(参见eckstein,oligonucleotidesandanalogues:apracticalapproach,oxforduniversitypress)和肽核酸(此处也称为“pna”)骨架和连接(参见egholm,j.am.chem.soc.114:1895(1992)；meier等人,chem.int.ed.engl.31:1008(1992)；nielsen,nature,365:566(1993)；carlsson等人,nature380:207(1996)，其全部通过引用并入本文)。其他核酸类似物包括那些具有双环结构的核酸，包括锁定核酸(此处也称为“lna”)，koshkin等人,j.am.chem.soc.120.132523(1998)；阳性骨架(denpcy等人,proc.natl.acad.sci.usa92:6097(1995)；非离子骨架(美国专利5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；kiedrowshi等人,angew.chem.intl.ed.english30:423(1991)；letsinger等人,j.am.chem.soc.110:4470(1988)；letsinger等人,nucleoside&nucleotide13:1597(1994)；ascsymposiumseries580第2和3章,"carbohydratemodificationsinantisenseresearch",y.s.sanghui和p.dancook编；mesmaeker等人,bioorganic&medicinalchem.lett.4:395(1994)；jeffs等人,j.biomolecularnmr34:17(1994)；tetrahedronlett.37:743(1996))和非核糖骨架，包括在美国专利5.235,033和5,034,506和ascsymposiumseries580第6和7章,y.s.sanghui和p.dancook编著的"carbohydratemodificationsinantisenseresearch"中描述的那些。含有一个或更多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(参见jenkins等人,chem.soc.rev.(1995)pp169176)。一些核酸类似物描述于rawls，c&enews，1997年6月2日，第35页。“锁定核酸”也包括在核酸类似物的定义内。lna是一类核酸类似物，其中核糖环被连接2'-o原子和4'-c原子的亚甲基桥所“锁定”。全部这些参考文献均在此明确地通过引用并入本文。可以对这些核糖-磷酸骨架进行修饰以增强该分子在生理环境中的稳定性和延长其半衰期。例如，pna:dna和lna-dna杂合体能够表现出更高的稳定性，从而可以在一些情况下使用。按照说明，该核酸可以是单链或双链的，或者既含有双链序列部分又含有单链序列部分。根据应用，该核酸可以是dna(包括，例如，基因组dna、线粒体dna和cdna)、rna(包括，例如，mrna和rrna)或杂合体，其中该核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任意组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等的碱基的任意组合。如本文中提及的“核酸分子”或“核酸”可以是“寡核苷酸”、“适体”或“多核苷酸”。术语“寡核苷酸”可以指通常小于200个残基长，例如15到100个核苷酸长的核苷酸链。寡核苷酸可以包含至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个碱基。寡核苷酸可以为约3至约5个碱基、约1至约50个碱基、约8至约12个碱基、约15至约25个碱基、约25至约35个碱基、约35至约45个碱基或约45至约55个碱基。寡核苷酸(也被称为“寡核苷酸(oligo)”)可以是任何类型的寡核苷酸(例如，引物)。在一些情况下，寡核苷酸是5’-acrydite修饰的寡核苷酸。寡核苷酸可以偶联至在如本文提供的表面上的如本文提供的聚合物涂层。寡核苷酸可以包含可切割的连接。可切割的连接可以是酶可切割的。寡核苷酸可以是单链或双链的。术语“引物”和“寡核苷酸引物”可以指能够与互补核苷酸序列杂交的寡核苷酸。术语“寡核苷酸”可以与术语“引物”、“衔接子”和“探针”互换使用。术语“多核苷酸”可以指通常大于200个残基长的核苷酸链。多核苷酸可以是单链或双链的。术语“杂交”和“退火”可互换使用并可以指互补核酸的配对。术语“引物”可以指通常具有游离的3’羟基基团的寡核苷酸，其能够与模板核酸或核酸分子(诸如靶多核苷酸、靶dna、靶rna或引物延伸产物)杂交，并且还能够促进与模板互补的多核苷酸的聚合。引物可以含有构成该引物的尾部的非杂交序列。即使引物的序列可能不与靶标完全互补，该引物仍可以与该靶标杂交。例如，引物可以是可以在通过聚合酶沿着多核苷酸模板进行的延伸反应中，诸如在pcr或cdna合成中采用的寡核苷酸。寡核苷酸引物可以是单链的合成多核苷酸，在其3′端含有能够与靶多核苷酸的序列杂交的序列。通常，与靶核酸杂交的引物的3′区与序列或引物结合位点具有至少80％、90％、95％或100％的互补性。为了避免二级结构和自杂交，可以根据已知参数设计引物。不同的引物对可以在大致相同的温度下，例如，在另一个引物对的约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃内退火并解链。在一些情况下，最初使用多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10,000个或更多个引物。这样的引物可以能够与本文所述的遗传靶标杂交。在一些情况下，使用约2至约10,000、约2至约5,000、约2至约2,500、约2至约1,000、约2至约500、约2至约100、约2至约50、约2至约20、约2至约10或约2至约6个引物。可以通过多种方法制备引物，该方法包括但不限于适当序列的克隆以及采用本领域公知方法的直接化学合成(narang等人,methodsenzymol.68:90(1979)；brown等人,methodsenzymol.68:109(1979))。引物还可以从商业来源如integrateddnatechnologies、operontechnologies、amershampharmaciabiotech、sigma和lifetechnologies获得。引物可以具有相同的解链温度。引物的解链温度可以为大约、高于、低于或至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、81、82、83、84或85℃。在一些情况下，引物的解链温度为约30至约85℃、约30至约80℃、约30至约75℃、约30至约70℃、约30至约65℃、约30至约60℃、约30至约55℃、约30至约50℃、约40至约85℃、约40至约80℃、约40至约75℃、约40至约70℃、约40至约65℃、约40至约60℃、约40至约55℃、约40至约50℃、约50至约85℃、约50至约80℃、约50至约75℃、约50至约70℃、约50至约65℃、约50至约60℃、约50至约55℃、约52至约60℃、约52至约58℃、约52至约56℃或约52至约54℃。引物的长度可以在5'端或3'端处延伸或缩短，以产生具有所需解链温度的引物。引物对中的一个引物可以比另一个引物长。在引物对内，引物的3'退火长度可以不同。还可以设计每个引物对的退火位置，使得该引物对的序列和长度产生所需的解链温度。用于确定小于25个碱基对的引物的解链温度的等式为wallace法则(td＝2(a+t)+4(g+c))。还可以采用计算机程序来设计引物，该计算机程序包括但不限于arraydesignersoftware(arrayitinc.)、oligonucleotideprobesequencedesignsoftwareforgeneticanalysis(olympusopticalco.)、netprimer以及来自hitachisoftwareengineering的dnasis。每个引物的tm(解链或退火温度)均可以采用软件程序如netprimer(http://www.premierbiosoft.com/netprimer/index.html上基于网络的免费程序)来计算。在任意扩增循环后，包括但不限于约1、2、3、4、5次循环、约6次循环至约10次循环、约10次循环至约15次循环、约15次循环至约20次循环、约20次循环至约25次循环、约25次循环至约30次循环、约30次循环至约35次循环或约35次循环至约40次循环之后，引物的退火温度可重新计算并可能增加。在最初的扩增循环之后，引物的5'一半可以从每一个感兴趣的基因座并入到产物中；因此可以根据每个引物的5'一半和3'一半的序列来重新计算tm。在任意扩增循环后，包括但不限于约1、2、3、4、5次循环、约6次循环至约10次循环、约10次循环至约15次循环、约15次循环至约20次循环、约20次循环至约25次循环、约25次循环至约30次循环、约30次循环至约35次循环或约35次循环至约40次循环之后，引物的退火温度可重新计算并可能增加。在最初的扩增循环之后，引物的5'一半可以从每一个感兴趣的基因座并入到产物中，因此可以根据每个引物的5'一半和3'一半的序列来重新计算tm。“互补的”可以指与序列(例如，模板核酸)的全部或仅一部分的互补性。特定寡核苷酸引物的可杂交序列中的核苷酸的数目应该使得用于杂交该寡核苷酸引物的严格性条件将阻止过度的随机非特异性杂交。通常，寡核苷酸引物的杂交部分中的核苷酸的数目将至少与该寡核苷酸引物所杂交的靶多核苷酸(例如，模板核酸)上确定的序列一样多，即，至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少约20个，并且通常为约6个至约10个或6个至约12个或12个至约200个核苷酸，通常为约10个至约50个核苷酸。靶多核苷酸可以大于如上文所述的寡核苷酸引物或引物。如本文所用的术语“约”或“几乎”是指在指定量的+/-10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％内。例如，“几乎相同”可以意指至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，提供一组条形码。术语“条形码”可以指允许与该条形码相关联的核酸(例如，寡核苷酸)的一些特征得到鉴别的已知核酸序列。在一些情况下，待鉴别的核酸的特征是每个核酸(例如，寡核苷酸)在阵列或芯片上的空间位置。条形码可以针对精确序列性能来设计，例如，在40％到60％之间的gc含量，没有长于2的均聚物运行，没有长于3的自互补的序列段，并且包含不存在于人类基因组参照中的序列。条形码序列可以为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个碱基。条形码序列可以为至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个碱基。条形码序列可以为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个碱基。寡核苷酸(例如，引物或衔接子)可以包含大约、多于、少于或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的条形码。条形码可以具有足够的长度，并可以包含可能足够不同的序列以允许根据与每个核酸相关联的条形码鉴别每一个核酸(例如，寡核苷酸)的空间位置。在一些情况下，每个条形码与阵列中的任何其他条形码相差例如四个缺失或插入或置换。在条形码化的寡核苷酸阵列上的每个阵列斑点中的寡核苷酸可以包含相同的条形码序列，而在不同阵列斑点中的寡核苷酸可以包含不同的条形码序列。在一个阵列斑点中使用的条形码序列可以与在任何其他阵列斑点中的条形码序列不同。或者，只要两个阵列斑点不相邻，在一个阵列斑点中使用的条形码序列可以与在另一个阵列斑点中使用的条形码序列相同。可以从阵列的受控合成知晓与特定阵列斑点相对应的条形码序列。或者，可以通过对来自特定阵列斑点的材料进行提取和测序而知晓与特定阵列斑点相对应的条形码序列。作为一个示例设计了含有150万个18碱基条形码的一组候选的条形码。iii.酶供本文提供的方法和组合物使用的rna依赖性dna聚合酶可以能够根据本文提供的方法实现引物的延伸。因此，rna依赖性dna聚合酶可以是能够使核酸引物沿着至少主要包含核糖核苷酸的核酸模板延伸的聚合酶。供本文提供的方法、组合物和试剂盒使用的合适的rna依赖性dna聚合酶包括逆转录酶(rt)。rt是本领域公知的。rt的实例包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒(m-mlv)逆转录酶、人免疫缺陷病毒(hiv)逆转录酶、劳斯肉瘤病毒(rsv)逆转录酶、禽成髓细胞白血病病毒(amv)逆转录酶、劳斯相关病毒(rav)逆转录酶以及成髓细胞白血病相关病毒(mav)逆转录酶或其他禽肉瘤白血病病毒(aslv)逆转录酶，以及由其衍生的修饰的rt。参见例如us7056716。许多逆转录酶，如来自禽成髓细胞白血病病毒(amv-rt)以及莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv-rt)的逆转录酶，包含超过一种活性(例如，聚合酶活性和核糖核酸酶活性)，并且可以在双链cdna分子的形成中起作用。然而，在一些情况下，优选地使用缺少rna酶h活性或具有显著降低的rna酶h活性的rt。缺乏rna酶h活性的rt是本领域已知的，包括包含野生型逆转录酶的突变的那些rt，其中该突变消除rna酶h活性。具有降低的rna酶h活性的rt的实例在us20100203597中描述。在这些情况下，来自其他来源的rna酶h如从大肠杆菌分离的rna酶h的添加可用于起始rna样品的降解和双链cdna的形成。还可以考虑rt的组合，包括不同非突变rt的组合，不同突变rt的组合，以及一种或多种非突变rt与一种或多种突变rt的组合。供本文提供的方法和组合物使用的dna依赖性dna聚合酶可以能够根据本文提供的方法实现引物的延伸。因此，dna依赖性dna聚合酶可以是在rna模板的存在下或在选择性去除rna模板后，能够使核酸引物沿着第一链cdna延伸的聚合酶。适合用于本文提供的方法的示例性dna依赖性dna聚合酶包括但不限于有或没有3'-外切核酸酶活性的klenow聚合酶、bstdna聚合酶、bca聚合酶、phi.29dna聚合酶、vent聚合酶、deepvent聚合酶、taq聚合酶、t4聚合酶和大肠杆菌dna聚合酶1，其衍生物，或聚合酶的混合物。在一些情况下，该聚合酶不包含5'-外切核酸酶活性。在其他情况下，该聚合酶包含5'外切核酸酶活性。在一些情况下，可以采用包含强链置换活性的聚合酶例如bst聚合酶进行引物延伸。在其他情况下，可以采用包含弱链置换活性或不包含链置换活性的聚合酶进行引物延伸。本领域技术人员可以认识到在引物延伸步骤期间使用链置换活性的优势和劣势，以及哪些聚合酶预期可以提供链置换活性(参见例如，newenglandbiolabspolymerases)。例如，链置换活性可能对在随机引发和延伸步骤期间确保整个转录组覆盖是有用的。链置换活性还可能对在引发和延伸步骤期间双链扩增产物的生成是有用的。或者，包含弱链置换活性或不包含链置换活性的聚合酶可能对在引物杂交和延伸期间可以与模板核酸杂交的单链核酸产物的生成是有用的。在一些情况下，可以对通过本文所述的方法生成的任何双链产物进行末端修复，以产生用于本文所述的衔接子连接应用的平端。双链产物上的平端的生成可以通过使用单链特异性dna外切核酸酶例如外切核酸酶1、外切核酸酶7或其组合降解该双链产物的突出单链末端而实现。或者，可以通过使用单链特异性dna内切核酸酶，例如但不限于绿豆内切核酸酶或s1内切核酸酶，将通过本文提供的方法生成的任何双链产物平端化。或者，可以通过使用包含单链外切核酸酶活性的聚合酶例如t4dna聚合酶、包含单链外切核酸酶活性的任何其他聚合酶或其组合降解双链产物的突出单链末端，来将通过本文提供的方法生成的任何双链产物平端化。在一些情况下，可以将包含单链外切核酸酶活性的聚合酶在包含或不包含一种或多种dntp的反应混合物中温育。在其他情况下，可使用单链核酸特异性外切核酸酶与一种或多种聚合酶的组合将引物延伸反应的双链产物平端化。在另外的其他情况下，可以通过补平双链产物的突出单链末端而使延伸反应的产物成为平端。例如，可以在一种或多种dntp的存在下将片段与聚合酶如t4dna聚合酶或klenow聚合酶或其组合一起温育，以补平双链产物的单链部分。或者，可以通过采用外切核酸酶和/或聚合酶的单链突出端降解反应与在一种或多种dntp的存在下使用一种或多种聚合酶的补平反应的组合来使通过本文提供的方法生成的任何双链产物成为平端。在另一个实施方案中，本文所述的衔接子连接应用可以在衔接子的非连接链与双链产物的链之间留下缺口。在这些情况下，可以采用缺口修复或补平反应来为双链产物附上与衔接子的连接链互补的序列。可以采用任意数目的本文所述的dna依赖性dna聚合酶来进行缺口修复。在一些情况下，可以采用具有链置换活性的dna依赖性dna聚合酶来进行缺口修复。在一些情况下，可以采用具有弱链置换活性或不具有链置换活性的dna依赖性dna聚合酶来进行缺口修复。在一些情况下，衔接子的连接链可以充当缺口修复或补平反应的模板。在一些情况下，可以采用taqdna聚合酶进行缺口修复。多种连接方法和试剂是本领域已知的并且可用于实施本文提供的方法。例如，可以采用平端连接。相似地，可以通过缺少3′-外切核酸酶活性的聚合酶将单个da核苷酸添加至双链dna产物的3′-端，并且该da核苷酸可以与包含dt突出端的衔接子退火(或者反过来)。这一设计使得杂交的组分随后被连接(例如，通过t4dna连接酶)。本领域已知的其他连接策略和相应的试剂以及试剂盒和用于进行有效连接反应的试剂可商购获得(例如，从newenglandbiolabs,roche获得)。就两个多核苷酸如茎–环衔接子/引物寡核苷酸和靶多核苷酸而言，如本文所用的术语“联接(joining)”、“附加”和“连接(ligation)”是指两个单独的多核苷酸的共价附接以产生具有连续骨架的单个较大的多核苷酸。用于联接两个多核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括但不限于酶和非酶(例如，化学)方法。非酶促连接反应的实例包括在美国专利号5,780,613和5,476,930中描述的非酶促连接技术，该专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，通过连接酶，例如dna连接酶或rna连接酶，使衔接子寡核苷酸与靶多核苷酸联接。各自具有特征反应条件的多种连接酶是本领域已知的，并且包括但不限于nad+依赖性连接酶，包括trna连接酶、taq酶dna连接酶、丝状栖热菌(thermusfiliformis)dna连接酶、大肠杆菌dna连接酶、tthdna连接酶、水管致黑栖热菌(thermusscotoductus)dna连接酶(i和ii)、热稳定连接酶、ampligase热稳定dna连接酶、vanc型连接酶、9°ndna连接酶、tspdna连接酶以及通过生物勘测发现的新型连接酶；atp依赖性连接酶，包括t4rna连接酶、t4dna连接酶、t3dna连接酶、t7dna连接酶、pfudna连接酶、dna连接酶1、dna连接酶iii、dna连接酶iv以及通过生物勘测发现的新型连接酶；及其野生型、突变同种型及遗传工程变体。连接可以在具有可杂交序列如互补突出端的多核苷酸之间。连接还可以在两个平端之间。通常，在连接反应中采用5’磷酸。5’磷酸可以由靶多核苷酸、衔接子寡核苷酸或这两者提供。根据需要，可以将5’磷酸添加至待联接的多核苷酸或从该多核苷酸上去除。用于添加或去除5’磷酸的方法是本领域已知的，并且包括但不限于酶促和化学方法。在5’磷酸的添加和/或去除中有用的酶包括激酶、磷酸酶和聚合酶。iv.扩增方法本文所述的方法、组合物和试剂盒对生成用于下游应用如大规模平行测序(即，下一代测序方法)或杂交平台的扩增就绪产物可能是有用的。扩增的方法是本领域公知的。可以使用的pcr技术的实例包括但不限于定量pcr、定量荧光pcr(qf-pcr)、多重荧光pcr(mf-pcr)、实时pcr(rt-pcr)、单细胞pcr、限制性片段长度多态性pcr(pcr-rflp)、pcr-rflp/rt-pcr-rflp、热启动pcr、巢式pcr、原位聚合酶群落(polony)pcr、原位滚环扩增(rca)、桥式pcr、皮滴定pcr(picotiterpcr)、数字pcr、小滴数字(dropletdigital)pcr和乳液pcr。其他合适的扩增方法包括连接酶链反应(lcr)、转录扩增、分子倒置探针(mip)pcr、自动维持序列复制、靶多核苷酸序列的选择性扩增、共有序列引物聚合酶链反应(cp-pcr)、随机引物聚合酶链反应(ap-pcr)、简并寡核苷酸引物pcr(dop-pcr)以及基于核酸的序列扩增(nabsa)、单引物等温扩增(spia，参见例如，美国专利号6,251,639)、ribo-spia或其组合。可以在本文中使用的其他扩增方法包括在美国专利号5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中描述的那些。靶核酸的扩增可以在珠子上发生。在其他实施方案中，扩增不在珠子上发生。扩增可以通过等温扩增例如等温线性扩增来进行。可以进行热启动pcr，其中在添加聚合酶之前将反应加热至95℃持续两分钟，或者可以使该聚合酶保持失活，直到第1循环的第一加热步骤。可以使用热启动pcr来使非特异性扩增最小化。用于扩增的其他策略和扩增的方面在2010年7月8日公开的美国专利申请公开号2010/0173394a1中进行了描述，该专利申请通过引用并入本文。在一些情况下，可以在限制条件下进行扩增方法，使得仅较少轮次的扩增(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)例如被通常进行而用于cdna生成。扩增的轮数可以为约1-30、1-20、1-15、1-10、5-30、10-30、15-30、20-30、10-30、15-30、20-30或25-30。用于靶序列和参考序列的扩增的技术是本领域已知的，并且包括美国专利号7,048,481中描述的方法。简言之，该技术可以包括将样品分离成小液滴的方法和组合物，在一些情况下其中每个小滴平均含有少于约5、4、3、2或1个靶核酸分子(多核苷酸)，扩增每个小滴中的核酸序列并检测靶核酸序列的存在。在一些情况下，扩增的序列存在于基因组dna的探针上，而非该基因组dna自身上。在一些情况下，至少200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或0个小滴具有靶核酸的零个拷贝。pcr可以包括基于变性、寡核苷酸引物退火以及通过嗜热模板依赖性多核苷酸聚合酶进行的引物延伸的反复循环的体外扩增，这可以导致侧翼为引物的多核苷酸分析物的所需序列的拷贝呈指数式增加。在一些情况下，可以将与dna的相对链退火的两个不同的pcr引物定位，使得一个引物的聚合酶催化的延伸产物可以充当另一个引物的模板链，从而导致长度由寡核苷酸引物的5'端之间的距离限定的离散双链片段的积累。lcr采用连接酶来联接成对的预先形成的核酸探针。该探针可以与核酸分析物的每条互补链(若存在)杂交，并且可以采用连接酶来将每对探针结合在一起，从而产生可以在下一循环中用来重复特定核酸序列的两个模板。sda(westin等人2000,naturebiotechnology,18,199-202；walker等人1992,nucleicacidsresearch,20,7,1691-1696)可以包括等温扩增，该等温扩增基于限制性内切核酸酶如hincii或bsobi在其识别位点的半硫代磷酸酯形式的未修饰链上形成切口的能力，以及缺乏外切核酸酶的dna聚合酶如klenowexominus聚合酶或bst聚合酶在该缺口处延伸3'-端并置换下游dna链的能力。指数式扩增由偶联有义和反义反应导致，在该反应中由有义反应置换的链充当反义反应的靶标并且反之亦然。在一些情况下，在例如dna的特定双链序列通过聚合酶链反应(pcr)的酶促扩增中，扩增是指数式的。v.寡核苷酸阵列在一些情况下，供本文提供的方法使用的表面包含寡核苷酸。在一些情况下，该表面为阵列。在一些情况下，该阵列包含适体。在一些情况下，该阵列包含寡核苷酸，使得其为寡核苷酸阵列。在一些情况下，该寡核苷酸阵列在包含如本文提供的聚合物涂层的表面上生成。该寡核苷酸阵列可以是高密度寡核苷酸阵列。该寡核苷酸阵列可以包含至少10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、100,000,000、200,000,000、500,000,000或1,000,000,000个偶联至如本文提供的表面上的寡核苷酸。该寡核苷酸阵列可以包含至多10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、100,000,000、200,000,000、500,000,000或1,000,000,000个偶联至如本文提供的表面上的寡核苷酸。该寡核苷酸阵列可以包含约10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、100,000,000、200,000,000、500,000,000或1,000,000,000个偶联至如本文提供的表面上的寡核苷酸。如本文提供的寡核苷酸阵列可以具有以至少10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、100,000,000、200,000,000、500,000,000或1,000,000,000个寡核苷酸/平方微米的密度在其上排列的寡核苷酸。可将在如本文提供的寡核苷酸阵列上的寡核苷酸组织成斑点(特征)、区域或像素。每个斑点(特征)或区域中的寡核苷酸可以彼此相同或彼此相关(例如，全部或基本上全部都包括共有或共同序列)。每个斑点或区域中的寡核苷酸可以彼此超过55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％相同。如本文提供的寡核苷酸阵列可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000、10,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、100,000,000、200,000,000、500,000,000或1,000,000,000个斑点(特征)或区域。每个斑点或区域可以具有至多约1cm、1mm、500μm、200μm、100μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm、800nm、500nm、300nm、100nm、50nm或10nm的大小。在一些情况下，寡核苷酸偶联至表面上的如本文提供的聚合物涂层。该聚合物涂层可以是如本文提供的聚丙烯酰胺涂层。在一些情况下，如本文提供的组合物包含表面、与所述表面共价结合的聚丙烯酰胺涂层；以及偶联至所述聚丙烯酰胺涂层的至少一种寡核苷酸。可以将寡核苷酸(oligos)以5’至3’朝向或以3’至5’朝向排列在阵列(模板和/或接受体阵列)表面上。单个阵列斑点或区域可以具有至多约15μm、至多约14μm、至多约13μm、至多约12μm、至多约11μm、至多约10μm、至多约5μm、至多约3μm、至多约1μm、至多约0.3μm或至多约0.1μm的尺寸。可以将引物区域以至少100、1,000、10,000、100,000、500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、50,000,000、100,000,000、200,000,000或500,000,000个区域/cm2的密度排列在基底上。在一些情况下，寡核苷酸在聚合过程中并入至聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)中。例如，可以在丙烯酰胺聚合过程中添加5’-acrydite修饰的寡核苷酸链，以允许寡核苷酸并入至正在聚合的聚丙烯酰胺结构中。在一些情况下，寡核苷酸在5’端处偶联至聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)。在一些情况下，寡核苷酸在3’端处偶联至聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)。在一些情况下，一些寡核苷酸在3’端处偶联至聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)，而一些寡核苷酸在5’端处偶联至聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)。在一些情况下，寡核苷酸在聚合过程之后并入至聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)中。例如，可以在聚合过程中将反应性位点添加至聚合物(例如，聚丙烯酰胺)结构中。然后，可在聚合物(例如，聚丙烯酰胺)聚合后，将寡核苷酸在反应性位点处并入。该反应性位点可以包括溴乙酰基位点、叠氮基位点或与叠氮基-炔huisgen环加成相容的位点。在一些情况下，该反应性位点包含溴乙酰基位点。在一些情况下，该反应性位点包含叠氮基。在一些情况下，该反应性位点包含与叠氮基-炔huisgen环加成相容的位点。在一些情况下，将寡核苷酸以受控方式并入到聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)中，其中特定的寡核苷酸位于该聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)的特定区域。可以将寡核苷酸随机并入到聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)中，其中特定的寡核苷酸随机地分布在整个聚合物涂层(例如，聚丙烯酰胺涂层)中。用作本文提供的方法的模板阵列的寡核苷酸阵列可以通过任何合适的方法(包括但不限于点印法和原位合成)制备。该方法可包括但不限于原位合成(例如，光引导的合成)、打印(例如，喷墨打印)、点印、转移、桥式扩增或重组酶聚合酶扩增。模板阵列和转移阵列的基底可以是任何合适的材料，包括但不限于玻璃，硅，和聚合物如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)及聚二甲基硅氧烷(pdms)。模板阵列和转移阵列的基底可以是相同的或可以是不同的。在一些情况下，供本文提供的方法使用的寡核苷酸阵列(即，模板阵列)通过点印法合成。点印法可以如gao等人,2004,biopolymers,73(5):579-596中所述，该文献的公开内容通过引用以其全文并入本文。可以使用非接触或接触打印法(例如，机器人针、压电式喷墨打印机)使预合成的寡核苷酸沉积到阵列的寡核苷酸或引物区域上。然后可以例如通过经由官能团的化学附接将寡核苷酸连接或固定至表面。在一些情况下，该官能团可以与寡核苷酸的5’端结合，导致寡核苷酸的3’端远离表面。在一些情况下，采用例如如本文以及美国临时申请号61/979,448或62/012,238中所述的桥式扩增或重组酶聚合酶扩增生成寡核苷酸阵列(即，模板阵列)，每一个申请的公开内容均通过引用以其全文并入本文。寡核苷酸阵列(即，模板阵列)的基底可以包含结合的衔接子或能够与单独寡核苷酸上的区域结合的寡核苷酸，从而允许该基底上的单独寡核苷酸的桥式扩增或重组酶聚合酶扩增。可以向基底上接种具有已知条形码序列的寡核苷酸(即，引物)，随后扩增以生成寡核苷酸区域。或者，可以向寡核苷酸基底(即，模板阵列基底)上接种具有随机或未知条形码序列的寡核苷酸，随后扩增以生成寡核苷酸区域并对来自每个寡核苷酸区域的寡核苷酸进行测序以确定与每个寡核苷酸区域相对应的条形码序列。可以制备用于生成如本文提供的寡核苷酸阵列的基底。vi.转移技术本公开内容提供了用于转移模板聚合物的方法和组合物。模板聚合物阵列向第二表面的转移可以通过阵列转移步骤发生。本文的方法还可用于生成具有所需朝向的寡核苷酸阵列。在一些情况下，用于在表面上生成如本文提供的寡核苷酸阵列的方法用来生成用作模板的寡核苷酸阵列(即，模板阵列)，以用于生成一个或多个寡核苷酸阵列，该寡核苷酸阵列包含与其偶联的且与模板阵列上的寡核苷酸互补的寡核苷酸。包含与其偶联的且与模板阵列互补的寡核苷酸的寡核苷酸阵列可以被称为接受体阵列(或者可替代地，被称为转移阵列)。该转移或接受体寡核苷酸阵列可以包含具有所需朝向的寡核苷酸。可以采用阵列转移过程从模板阵列生成转移或接受体阵列。在一些情况下，使具有所需特征(“斑点”)密度(例如，特征或斑点大小为约1μm)的模板寡核苷酸阵列经历如本文提供的阵列转移过程，以便生成具有所需朝向的转移或接受体寡核苷酸阵列。该所需朝向可以是包含寡核苷酸的转移或接受体寡核苷酸阵列，其中该阵列的每个寡核苷酸的5’端均附接至阵列基底。用于生成具有所需朝向的寡核苷酸的转移或接受体寡核苷酸阵列(即，该阵列的每个寡核苷酸的5’端均附接至阵列基底)的模板寡核苷酸阵列，可使模板阵列的每个寡核苷酸的3’端均附接至该基底。该阵列转移过程可以是面对面转移过程。在一些情况下，该面对面转移过程通过酶促转移或通过合成的酶促转移(ets)发生。图2a-c和图3中总体上描绘了ets。在一些情况下，该面对面转移过程通过非酶促转移过程发生。该非酶促转移过程可以是寡核苷酸固定化转移(oit)。图4和图5中总体上描绘了oit。面对面凝胶转移过程(例如，ets或oit)可以显著降低单位制备成本，同时翻转寡核苷酸朝向(5’固定的)，这可以具有测定优势，如允许与阵列结合的寡核苷酸的3’端的酶促延伸。而且，ets或oit可以导致更大数目或更高百分比的具有所需或限定长度的寡核苷酸(即，全长寡核苷酸)从模板阵列转移至接受体阵列。随后接受体寡核苷酸阵列上的转移的全长产物寡核苷酸的扩增(例如，如本文提供的扩增特征再生或afr)可以使该接受体寡核苷酸阵列含有包含超过50个核苷酸碱基的寡核苷酸，而不会导致低产率或部分长度产物。在一些情况下，模板和/或接受体阵列包含聚合物。该聚合物可以是适体或寡核苷酸。在一些情况下，模板或接受体阵列包含寡核苷酸。模板或接受体阵列可以具有至少10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000或100,000、200,000、500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、100,000,000、200,000,000、500,000,000或十亿个与其偶联的模板聚合物(例如，寡核苷酸)。模板阵列可以具有以至少10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000或100,000个聚合物(例如，寡核苷酸)/平方毫米的密度在其上排列的模板聚合物。可将模板或接受体阵列上的聚合物(例如，寡核苷酸)组织成斑点、区域或像素。每个斑点或区域中的聚合物(例如，寡核苷酸)可以彼此相同或彼此相关(例如，全部或基本上全部都包括共有或共同序列)。每个斑点或区域中的聚合物(例如，寡核苷酸)可以彼此超过55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％相同。该模板或接受体阵列可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000、10,000、100,000、1,000,000或10,000,000个斑点或区域。每个斑点或区域可以具有至多约1cm、1mm、500μm、200μm、100μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm、800nm、500nm、300nm、100nm、50nm或10nm的大小。如本文提供的生成的接受体或转移阵列可以包含在其序列和/或数目方面与模板阵列上的寡核苷酸完全互补、完全相同、部分互补或部分相同的寡核苷酸，其中该接受体阵列从该模板阵列转移。部分互补可以指具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的序列互补性的接受体阵列。部分相同可以指具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的序列同一性的接受体阵列。接受体阵列可以具有与模板阵列相同的寡核苷酸数目，和/或具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的寡核苷酸数目作为模板阵列，其中该接受体阵列从该模板阵列转移。如本文提供的阵列制备方法可以产生具有设计的、所需的或预期的长度的、可以被称为全长产物的聚合物(例如，寡核苷酸)的阵列。例如，预期生成具有10个碱基的寡核苷酸的制备方法可以生成偶联至阵列的、具有10个碱基的全长寡核苷酸。阵列制备过程可以产生具有小于设计的、所需的或预期的长度的、可以被称为部分长度产物的聚合物(例如，寡核苷酸)。部分长度的寡核苷酸的存在可以在给定的特征(斑点)内或在特征(斑点)之间。例如，预期生成具有10个碱基的寡核苷酸的制备方法可以生成偶联至阵列的、仅具有8个碱基的部分长度寡核苷酸。也就是说，合成的寡核苷酸阵列可以包含许多核酸，这些核酸沿其长度是同源的或接近同源的，但其长度可以彼此不同。在这些同源或接近同源的核酸中，具有最长长度的那些可以被认为是全长产物。长度比最长长度短的核酸可以被认为是部分长度产物。本文提供的阵列制备方法可以产生偶联至阵列的给定特征(斑点)内的一些全长产物(例如，寡核苷酸)和一些部分长度产物(例如，寡核苷酸)。偶联至特定阵列或在给定特征内的部分长度产物在长度上可以不同。由全长产物生成的互补核酸也可以被认为是全长产物。由部分长度产物生成的互补核酸也可以被认为是部分长度产物。可以使用如本文提供的转移方法(例如，ets或oit)增加或富集偶联至接受体阵列表面的全长产物(例如，寡核苷酸)的量或百分比。阵列转移(例如，ets或oit)可以产生包含至少、至多、大于、小于或大约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％转移的寡核苷酸的转移或接受体阵列，其中该转移的寡核苷酸的长度是用于生成该转移或接受体阵列的模板阵列上相应寡核苷酸的长度的100％。长度为模板寡核苷酸的长度的100％(即，相同或等同长度)的转移的寡核苷酸可以被称为全长产物(例如，全长产物寡核苷酸)。通过本领域已知的方法(例如，点印法或原位合成)制备的模板阵列可以包含约20％的所需长度的寡核苷酸(即，全长寡核苷酸)和约80％的非所需长度的寡核苷酸(即，部分长度寡核苷酸)。采用如本文提供的阵列转移方法转移通过本领域已知的方法生成的、包含约20％全长寡核苷酸和约80％部分长度寡核苷酸的阵列可以导致生成包含至多约20％全长产物寡核苷酸的转移或接受体阵列。在一些情况下，根据本文的方法制备的阵列具有更大百分比的所需长度的寡核苷酸(即，全长寡核苷酸)，使得采用本文提供的阵列转移方法转移根据本文的方法制备的阵列导致生成与本领域已知的制备和转移方法相比具有更高百分比的全长产物寡核苷酸的转移或接受体阵列。在一些情况下，本文提供的转移方法(例如，ets或oit)包括生成与模板序列互补的核酸(例如，寡核苷酸)序列。该转移可以通过酶复制(例如，ets)或通过阵列组分在阵列表面之间的非酶促物理转移(例如，oit)而发生。该阵列表面可以是如本文提供的任何阵列表面。模板阵列和接受体阵列的基底可以是相同的或可以是不同的。该转移可以包括制备已附接至接受体阵列的互补序列；例如，结合至接受体阵列、并且与模板阵列上的衔接子互补的引物，可以采用模板阵列序列作为模板进行延伸，从而生成全长或部分长度接受体阵列。转移可包括从模板阵列制备互补序列，随后将该互补序列附接至接受体阵列。如本文提供的转移方法(例如，ets或oit)可以生成接受体阵列，使得模板核酸(例如，寡核苷酸)相对于其偶联的接受体阵列表面的朝向得以保留(例如，模板核酸(例如，寡核苷酸)的3’端结合至模板阵列，而转移的核酸(例如，寡核苷酸)互补体的3’端结合至接受体阵列)。转移可以逆转核酸相对于其偶联的阵列表面的朝向(例如，模板核酸的3’端结合至模板阵列，而转移的核酸互补体的5’端结合至接受体阵列)。阵列转移可以多次进行。可以采用相同的模板阵列多次进行阵列转移。可以使用与模板基底结合的模板聚合物的模板阵列来产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000或100,000个接受体阵列。通过使用来自一次阵列转移的转移阵列作为随后转移的模板阵列，阵列转移可以在一系列的转移中多次进行。例如，可以从具有在其3’端处与阵列结合的寡核苷酸的模板阵列到具有在其5’端处与阵列结合的互补寡核苷酸的第一转移阵列进行第一次转移，并且可以从该第一转移阵列(现在充当模板阵列)到第二转移阵列进行第二次转移，该第二转移阵列比采用本领域常用的转移技术生成的接受体阵列具有更高百分比的全长产物以及匹配原始模板阵列的序列，同时保留5’-表面结合的朝向。在一些情况下，采用本文提供的阵列转移方法(例如，ets或oit)生成的接受体阵列上的全长产物寡核苷酸进一步通过接受体阵列上的全长产物寡核苷酸的扩增而富集。可以采用本文提供的方法进行扩增。该阵列转移方法可以是如本文提供的面对面酶促转移方法(例如，ets)或非酶促(例如，oit)方法。在一些情况下，可以通过使用在模板聚合物(例如，寡核苷酸)上的衔接子序列来帮助通过ets或oit进行的阵列转移。聚合物(例如，寡核苷酸)可以包含所需的最终序列，外加一个或多个衔接子序列。例如，模板寡核苷酸可以按顺序包含具有第一衔接子序列的3’端、具有第二衔接子序列的5’端以及在中间的所需最终序列。第一和第二衔接子序列可以是相同的或可以是不同的。在一些情况下，在相同阵列斑点中的寡核苷酸包含相同的第一和第二衔接子序列以及最终序列，而在不同阵列斑点中的寡核苷酸包含相同的第一和第二衔接子序列以及不同的最终序列。在转移/接受体阵列上的引物可以与衔接子序列互补，从而允许引物与模板聚合物(例如，寡核苷酸)之间的杂交。这样的杂交可有助于从一个阵列到另一个阵列的转移。可以在转移后通过例如酶切、消化或限制性处理，从转移/接受体阵列聚合物(例如，转移的寡核苷酸)中去除一些或全部衔接子序列。可以在转移后通过例如酶切、消化或限制性处理，从转移/接受体阵列聚合物(例如，转移的寡核苷酸)中去除一些或全部衔接子序列。例如，可以经由通过双链dna酶进行的探针末端剪切(pec)将寡核苷酸阵列组分的衔接子去除。可以添加与衔接子序列互补的寡核苷酸并将该寡核苷酸与阵列组分杂交。然后可以采用对双链dna具有特异性的dna酶消化寡核苷酸(参见图6)。或者，可以将一个或多个可切割的碱基如du掺入到待去除的链的引物中。然后可以将该引物在紧挨着探针的最3’碱基的位置处形成切口，并且该切口位点可以由合适的酶如绿豆s1或p1核酸酶切割(见图7)。还可以使用许多种限制酶及其相关的限制酶切位点，包括但不限于ecori、ecorii、bamhi、hindiii、taqi、noti、hinfi、sau3ai、pvuii、smai、haeiii、hgai、alui、ecorv、ecop15i、kpni、psti、saci、sali、scai、spei、sphi、stui和xbai。在一些情况下，从第二表面(接受体表面)到含有与顶部衔接子互补的引物(例如，寡核苷酸)的新的第三表面重复上述转移过程。因为只有全长寡核苷酸可以具有完整的顶部衔接子，所以只有这些寡核苷酸可以被拷贝到第三阵列表面(即，新的或第三受体或转移阵列)上。该过程可以从部分产物中纯化或富集全长寡核苷酸，由此产生高特征密度、高质量的全长寡核苷酸阵列。纯化或富集可以意指接受体阵列的生成，使得所述接受体阵列比用作生成所述接受体阵列的模板的阵列具有更大百分比或数目的所需长度(即，全长)的寡核苷酸。该全长寡核苷酸可以是含有所有所需特征(例如，衔接子、条形码、靶核酸或其互补体，和/或通用序列等)的寡核苷酸。在一些情况下，转移通过酶促转移或通过合成的酶促转移(ets)发生。转移阵列或接受体阵列表面可以包含表面固定的寡聚物、核苷酸或者与模板核酸或寡核苷酸至少部分互补的引物。在一些情况下，转移阵列或接受体阵列包含与模板阵列上的适体选择性杂交或结合的寡聚物。固定的寡聚物、核苷酸或引物可以与模板聚合物上的衔接子区域互补。在一些情况下，可以通过阵列(例如，模板阵列)的或阵列(例如，模板阵列)上表面涂层的柔性或可变形性来帮助阵列转移。例如，可以在阵列转移(例如，ets、oit)中使用包含具有偶联的寡核苷酸的聚丙烯酰胺凝胶涂层的阵列(例如，模板阵列)。该凝胶涂层的可变形性可以允许阵列组分(寡核苷酸、试剂(例如，酶))彼此接触，即使存在表面粗糙度。表面粗糙度可以是表面的形貌的变化性。可以通过被称为扩增特征再生(afr)的酶促反应扩增或再生阵列组分。afr可以在模板阵列和/或接受体阵列上进行。可使用afr在阵列(例如，模板和/或接受体)上再生全长寡核苷酸，以便确保阵列(例如，模板和/或接受体阵列)上的特征(斑点)中的每个寡核苷酸均包含所需组分(例如，衔接子、条形码、靶核酸或其互补体，和/或通用序列等)。可以对包含衔接子和/或引物结合位点(pbs)的寡核苷酸进行afr，使得寡核苷酸各自包含第一衔接子(或第一pbs)、探针序列和第二衔接子(或第二pbs)。优选地，阵列(例如，模板和/或接受体阵列)上的每个特征中的寡核苷酸均包含两个或更多个引物结合位点(或衔接子序列)。可以采用本领域已知的核酸扩增技术进行afr。该扩增技术可以包括但不限于等温桥式扩增或pcr。例如，可以通过阵列(例如，模板和/或接受体阵列)组分上的衔接子序列与结合至表面的寡核苷酸引物之间的杂交，及随后的酶促延伸或扩增，来对阵列(例如，模板和/或接受体阵列)组分寡核苷酸进行桥式扩增。可以使用扩增来恢复损失的阵列(例如，模板和/或接受体阵列)组分密度或将阵列(例如，模板和/或接受体阵列)组分的密度增加至超过其原始密度。如本文提供的阵列(例如，模板和/或接受体阵列)上的固定的寡核苷酸、核苷酸或引物可以在长度上彼此相等，或可以具有不同的长度。固定的寡核苷酸、核苷酸或引物可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200个碱基。在一些情况下，固定的寡核苷酸、核苷酸或引物为71个碱基长(71-聚体)。可以使转移阵列的接受体表面与模板阵列的模板表面紧密靠近或接触。在一些情况下，可以通过可变形的涂层如聚合物凝胶(例如，聚丙烯酰胺)的存在来帮助模板阵列与转移阵列之间的接触。该涂层的可变形性可以允许偶联的聚合物(例如，寡核苷酸或引物)进行足够紧密的接触，以使杂交发生。该涂层的可变形性可以帮助克服由于表面粗糙度(例如，表面形貌变化性)或其他特征导致的间隙，否则该间隙将会阻止用于杂交的足够紧密的接触。阵列之一或两者可以包含具有偶联有聚合物分子的凝胶涂层的基底。例如，转移阵列可以包含与聚丙烯酰胺凝胶偶联的基底，其中寡核苷酸引物偶联至该凝胶。表面和涂层在本公开内容的其他地方进一步讨论。通过合成的酶促转移(ets)ets可以包括如图2a-c和图3中描绘的面对面聚合酶延伸反应，该反应用于将一个或多个模板寡核苷酸(例如，dna寡核苷酸)从模板寡核苷酸阵列拷贝到第二表面(例如，接受体阵列)上。可以按压第二表面(例如，接受体阵列)，使其与模板寡核苷酸(例如，dna寡核苷酸)阵列接触，其中该第二表面均匀覆盖有与模板寡核苷酸阵列中的寡核苷酸上的序列(例如，包含衔接子序列的寡核苷酸阵列中的底部衔接子序列)互补的固定的引物。接受体阵列表面可以包含表面固定的寡聚物(寡核苷酸)、核苷酸或者与模板寡核苷酸阵列上的模板核酸或寡核苷酸至少部分互补的引物。在一些情况下，转移或接受体阵列包含与模板阵列上的适体选择性杂交或结合的寡核苷酸。转移或接受体阵列上的固定的寡核苷酸、核苷酸或引物可以与模板聚合物(例如，寡核苷酸)上的衔接子区域互补。图2a-c中示出了如本文提供的ets阵列转移过程的实例。模板核酸(寡核苷酸)可以与接受体表面上的固定的引物或探针杂交，该引物或探针也被称为接受体引物或探针，或者转移引物或探针。可以例如通过dna聚合酶对杂交的复合物(例如，双链体)进行酶促延伸(见图2a)，该dna聚合酶包括但不限于poli、polii、poliii、klenow、t4dnapol、修饰的t7dnapol、突变的修饰的t7dnapol、tdt、bst、taq、tth、pfu、pow、vent、pab、pyrophage。转移过程可以保留寡核苷酸的朝向，即，如果5’端结合至模板表面，则合成的寡核苷酸的5’端将结合至接受体表面，或者反之亦然。如图2a所示，在其5’端结合的转移引物可以在其3’端与模板核酸结合，随后进行酶促延伸以产生与模板寡核苷酸互补并在其5’端与接受体阵列表面结合的核酸。在一些情况下，仅使用全长模板核酸产物在接受体阵列上生成互补体。图2c示出了仅采用全长模板核酸产物的酶促转移(即，ets)的实例，该产物包含第一衔接子区域a、中间区域b和第二衔接子区域c。在图2c中，接受体阵列表面包含与在模板核酸末端处的第二衔接子序列c互补的引物。模板阵列上的全长产物包含整个序列(即，第一衔接子a-中间区域b-第二衔接子c)，而部分长度产物不包含整个序列(即，第一衔接子a-中间区域b)。在图2c中，模板阵列上的部分长度产物没有被转移，因为它们缺少第二衔接子c，因此不能被包含与第二衔接子c互补的序列的接受体阵列上的引物(寡核苷酸)结合。在一些情况下，模板阵列上的模板核酸寡核苷酸的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％是全长产物(寡核苷酸)。在一些情况下，在接受体阵列上生成的转移或接受体核酸产物(寡核苷酸)的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％是全长产物。ets期间接受体阵列上部分长度产物的生成可能是由于全长模板寡核苷酸在聚合酶驱动的合成期间的不完全延伸而引起的。接受体阵列上全长产物的生成可以采用如本文提供的afr来实现。在一些情况下，接受体阵列上包含与模板聚合物(例如，寡核苷酸)的一部分杂交的引物，使得发生延伸反应，直到所有的模板聚合物(例如，寡核苷酸)都用作互补阵列(或接受体阵列)上互补接受体寡核苷酸合成的模板。在一些情况下，发生接受体阵列的合成，使得平均至少100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％或50％的模板聚合物(例如，寡核苷酸)用于在该接受体阵列上生成互补序列。换句话说，转移后，接受体阵列可以包含采用至少100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％或50％的模板寡核苷酸作为模板合成的接受体核苷酸(例如，寡核苷酸)。阵列转移过程(例如，ets)可以逆转模板核酸的朝向(见图2b、图3)。也就是说，如果5’端结合至模板表面，则合成的寡核苷酸的3’端将结合至接受体表面，或者反之亦然。例如，图2b示出了模板阵列表面上的模板核酸(例如，寡核苷酸)的酶促转移(即，ets)，该模板核酸可以包含第一衔接子区域a、中间区域b和第二衔接子区域c中的一些或全部。在图2b中，与位于模板核酸的基底端处并被指定为a的衔接子序列互补的接受体表面引物(a')用于进行酶促转移。在这种情况下，部分长度和全长互补产物(寡核苷酸)均被转移，并且其相对于模板阵列的基底表面的朝向得到逆转。如图3所示，在其3’端与模板阵列表面(模板表面)结合的模板核酸(例如，寡核苷酸)可以与接受体阵列上、在其5’端与接受体阵列表面结合的转移引物杂交。转移引物的酶促延伸产生与模板核酸(例如，寡核苷酸)互补并在其5’端与接受体阵列表面结合的核酸(例如，寡核苷酸)。可以在转移引物在其3’端与接受体阵列表面结合时，对在其5’端与模板表面结合的模板核酸进行相同的过程。这些转移引物的延伸产生与模板核酸(例如，寡核苷酸)互补并在其3’端与接受体阵列表面结合的核酸(例如，寡核苷酸)。在一些情况下，利用模板阵列的特征(斑点)中的部分长度寡核苷酸在接受体阵列上生成互补的部分长度寡核苷酸。在一些情况下，利用模板阵列的特征(斑点)中的全长寡核苷酸在接受体阵列上生成互补的全长寡核苷酸。模板和接受体表面可以是可生物相容的，如聚丙烯酰胺凝胶、修饰的聚丙烯酰胺凝胶、pdms或任何其他生物相容的表面(例如，二氧化硅、硅、coc和金属如金或铬)。如果表面包含聚合物凝胶层，则厚度可影响其可变形性或柔性。凝胶层的可变形性或柔性可以使其对保持表面之间的接触是有用的，即使存在表面粗糙度。在本文中进一步讨论了表面的细节。试剂和其他化合物，包括酶、缓冲液和核苷酸，可以放置在表面上或包埋在相容的凝胶层中。该酶可以是聚合酶、核酸酶、磷酸酶、激酶、解旋酶、连接酶、重组酶、转录酶或逆转录酶。在一些情况下，在表面上或包埋在相容的凝胶层中的酶包括聚合酶。聚合酶可以包括但不限于poli、polii、poliii、klenow、t4dnapol、修饰的t7dnapol、突变的修饰的t7dnapol、tdt、bst、taq、tth、pfu、pow、vent、pab、phusion、pyrophage及其他聚合酶。在本文中进一步讨论了表面的细节。在一些情况下，在表面上或包埋在相容的凝胶层中的酶包括连接酶。连接酶可以包括但不限于大肠杆菌连接酶、t4连接酶、哺乳动物连接酶(例如，dna连接酶i、dna连接酶ii、dna连接酶iii、dna连接酶iv)、热稳定连接酶以及快速连接酶。图12、图13和图14中示出了模板表面以及通过酶促延伸生成的转移后的接受体表面。接受体阵列的表面可以是在模板阵列的顶部上形成的凝胶。图15示出了在反应混合物(例如，如本文概述的引物、酶、缓冲液)和模板的存在下，如本文所述的、从模板阵列表面向接受体表面(即，凝胶拷贝(具有模板))的酶促延伸反应以及阴性对照的实例，在该阴性对照中，在存在反应混合物(例如，如本文概述的引物、酶、缓冲液)但没有模板核酸的情况下，模板阵列经历如本文所述的、向接受体表面(凝胶拷贝(没有模板))的酶促延伸反应。阴性对照(即，凝胶拷贝(无模板))中荧光的缺乏证明了在不存在模板核酸的情况下生成的产物的缺乏。图22示出了另外的对照实验的结果，其中模板阵列表面(左侧)与接受体转移表面在存在反应混合物(即，引物、缓冲液)(右侧)但不存在酶的情况下接触。图22中的接受体阵列(右侧)上的荧光缺乏证明了转移的缺乏。可以将反应混合物放置在接受体阵列的表面上或包埋在接受体表面中。在一些情况下，将反应混合物放置在接受体阵列的表面上。在一些情况下，将反应混合物包埋在接受体表面中。该接受体表面可以是相容的凝胶层。该反应混合物可以包含进行通过合成的酶促转移(ets)所必需的任何试剂。该试剂可以包含模板阵列通过ets的酶促转移可以如下进行：1.)制备酶混合物(例如，37μlh2o，5μl10xthermopol缓冲液，5μl10mg/mlbsa，1μl10mmdntp以及2μl8u/μlbst酶)；2.)将酶混合物施加到接受体阵列(例如，如本公开内容其他地方所述制备的、偶联有寡核苷酸引物的丙烯酰胺凝胶涂覆的载玻片)；3.)将模板阵列与接受体阵列面对面放置并使其反应(例如，在55℃下在湿度室内夹紧在一起持续2小时)；4.)将模板阵列与接受体阵列分开(例如，通过施加4xssc缓冲液而松开并在剃须刀片的辅助下拉开)；5.)将模板阵列漂洗(例如，在去离子水中)并干燥(例如，用n2)；以及6.)漂洗接受体阵列(例如，用4xssc缓冲液和2xssc缓冲液)。在一些情况下，模板阵列上的寡核苷酸包含衔接子，使得底部衔接子位于邻近该模板阵列表面的位置，而顶部衔接子位于远离该模板阵列表面的位置。当将该夹心结构加热至55℃时，thermopolpcr缓冲液中的bst聚合酶可以延伸来自接受体阵列的、与该模板阵列的底部衔接子杂交的引物，这可以在模板与接受体阵列表面之间产生dsdna分子桥。一经物理分离，第二表面(即，接受体阵列)可以含有互补ssdna条形码阵列，其中寡核苷酸的5’端附接至该表面并且3’端可用于聚合酶延伸。由于模板阵列上的均匀分散的引物和接受体阵列上的条形码寡核苷酸都可以栓系至其各自的表面，因此可以保持转移的特征的相对位置(以镜像形式)。为了实现密切接触并因此在整个芯片区域上均匀转移，可以使用宽范围的表面材料(pdms、聚丙烯酰胺)、厚度和工艺条件。寡核苷酸固定化转移(oit)在一些情况下，通过非酶促转移来进行接受体阵列的生成。非酶促转移的一种形式是寡核苷酸固定化转移(oit)。在oit中，模板阵列上的模板核酸(例如，寡核苷酸)可以是单链的。包含与模板寡核苷酸的一部分互补的序列的引物可以与该模板寡核苷酸杂交并通过引物延伸而延伸，以便生成并可以在模板阵列上制备成双链模板寡核苷酸。用于引物延伸的引物可以在溶液中。许多聚合酶可以用于oit，包括poli、polii、poliii、klenow、t4dnapol、修饰的t7dnapol、突变的修饰的t7dnapol、tdt、bst、taq、tth、pfu、pow、vent、pab、phusion及其他。在一些情况下，用于引物延伸的引物包含连接体，该连接体用于固定或结合接受体阵列表面上通过引物延伸(见图4)生成的双链模板寡核苷酸的链。该接受体阵列表面可以是如本文提供的平坦表面、珠子或凝胶。在一些情况下，该接受体阵列表面是在oit期间形成的聚丙烯酰胺凝胶(如图5中所示)。在一些情况下，在延伸后，该连接体可以结合至接受体阵列表面。该接受体阵列表面可以是如本文提供的任何阵列表面，如聚合物凝胶或修饰的玻璃表面。在oit中，随后可以将该模板和接受体阵列表面分离。可以在分离前使dna(即，双链模板寡核苷酸)解链。在一些情况下，oit中使用的引物是5’-acrydite修饰的引物。5’-acrydite修饰的引物可以能够在如本文提供的聚合期间并入到聚合物凝胶(例如，聚丙烯酰胺)中。然后可以采用该acrydite引物生成来自模板核酸(例如，寡核苷酸)的延伸产物，使该延伸产物与经结合处理(例如，未聚合的聚丙烯酰胺涂料前体)的基底接触，在聚合期间并入，并分离(说明见图8)。该引物可以是5'-己炔基-聚t-dna。在一些情况下，通过互补的5'-己炔基-聚t-dna引物的结合和延伸生成来自模板核酸的引物延伸产物。在延伸后，可以将该5'-己炔基-聚t-dna引物：1.)与经结合处理的基底(如采用硅烷处理的玻璃)接触，2.)与交联剂例如同双功能连接体如1,4-亚苯基二异硫氰酸酯(pditc)连接，3.)使用peg连接体与n3结合基团连接(例如，图9)，4.)在n3基团处键合至基底(例如，图10)，以及5.)在oit的第二阶段期间分离(图11)。图9和图10示出了核酸的pditc-n3附接的实例。该表面可以是如本文讨论的任何表面。可以代替pditc使用的其他交联剂可以包括辛二亚氨酸二甲酯(dms)、二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)和/或二琥珀酰亚胺基草酸酯(dso)。该过程可以保留寡核苷酸的朝向，即，如果5’端结合至模板阵列表面，则合成的寡核苷酸的5’端将结合至接受体阵列表面，或者反之亦然。尽管可以在转移之前使用酶促延伸，但转移自身可以在没有酶促反应的情况下进行。图16示出了荧光标记的模板阵列的图片，其中模板分子具有结构5'cagaagacggcatacgagat_gactggagttcagacgtgtgctcttcc_gtgtagatctcggtggtcgccgta-3't*―(heg)2―(基底表面)。在成像前，使该阵列与在4xssc缓冲液中的500nmqcfc2-cy3在55℃下杂交60分钟。图17示出了同一模板阵列的区域的放大视图。图18示出了同一模板阵列以及非酶促转移后的接受体转移阵列。模板核酸与acr-fc1引物杂交并用bst聚合酶延伸，然后并入到接受体转移阵列基底上的聚合物凝胶中并与模板阵列分离。该模板阵列的转移后的信号没有显示明显下降，而转移阵列在10x曝光下显示小信号。图19示出了转移前后模板阵列的并排比较。可以看出，模板阵列的转移后的信号没有明显下降。图20示出了采用凝胶延伸链转移的非酶促转移与采用撕下凝胶的模板链转移的非酶促转移之间的比较。图21示出了凝胶图像之间的曝光设置的比较，其中一个采用10x2s2bin而另一个采用10x0.5s10bin。在一些情况下，可以在没有酶促转移的情况下生成具有5’至3’朝向的寡核苷酸阵列。例如，模板寡核苷酸阵列上的合成核酸序列的未结合端可以包含与在该寡核苷酸的阵列结合端处或该结合端附近的序列互补的连接体序列，从而使该寡核苷酸环化。该寡核苷酸可以进一步在相同末端处包含限制性序列。环化的寡核苷酸上的限制性序列的消化起到翻转含有连接体序列的全长寡核苷酸并切断该阵列上缺乏连接体序列的任何部分长度的寡核苷酸产物的作用。可以使用许多限制酶及其相关的限制酶切位点，包括但不限于ecori、ecorii、bamhi、hindiii、taqi、noti、hinfi、sau3ai、pvuii、smai、haeiii、hgai、alui、ecorv、ecop15i、kpni、psti、saci、sali、scai、spei、sphi、stui和xbai。vii.表面用于如本文提供的转移方法的表面(例如，模板表面和/或接受体表面)可以包含一系列可能的材料。在一些情况下，该表面包含在基底上的聚合物凝胶或涂层，如聚丙烯酰胺凝胶或pdms凝胶。在一些情况下，该表面包含没有基底支持物的凝胶。在一些情况下，该表面包含在基底上的薄涂层，如聚合物的200nm以下的涂层。在一些情况下，该表面包含未涂覆的基底，如玻璃或硅。该聚合物涂层可以形成聚合物刷薄膜。该聚合物涂层可以包含一定的交联。该聚合物涂层可以形成接枝结构。该聚合物涂层可以形成网络结构。该聚合物涂层可以形成支化结构。该聚合物可以包含均匀的聚合物。该聚合物可以包含嵌段聚合物。该聚合物可以包含梯度共聚物。该聚合物可以包含周期共聚物。该聚合物可以包含统计共聚物。该聚合物涂层可以具有一定范围的厚度或宽度。该聚合物涂层可以具有约0.0001、0.00025、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175或200mm的厚度或宽度。该聚合物涂层可以具有小于0.0001、0.00025、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175或200mm的厚度或宽度。该聚合物涂层可以具有大于0.0001、0.00025、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175或200mm的厚度或宽度。该聚合物涂层可以具有至少0.0001、0.00025、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175或200mm的厚度或宽度。该聚合物涂层可以具有至多0.0001、0.00025、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175或200mm的厚度或宽度。该聚合物涂层可以具有0.0001至200mm、0.01至20mm、0.1至2mm或1至10mm的厚度或宽度。该聚合物涂层可以具有约0.0001至约200mm、约0.01至约20mm、约0.1至约2mm或约1至约10mm的厚度或宽度。在一些情况下，该聚合物涂层包含约10微米的宽度或厚度。该聚合物涂层可以为至少1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、40μm厚。该聚合物涂层可以为至少50μm厚。该聚合物涂层可以为至少75μm厚。该聚合物涂层可以为至少100μm厚。该聚合物涂层可以为至少150μm厚。该聚合物涂层可以为至少200μm厚。该聚合物涂层可以为至少300μm厚。该聚合物涂层可以为至少400μm厚。该聚合物涂层可以为至少500μm厚。该聚合物涂层可以为约1μm至约10μm厚。该聚合物涂层可以为约5μm至约15μm厚。该聚合物涂层可以为约10μm至约20μm厚。该聚合物涂层可以为约30μm至约50μm厚。该聚合物涂层可以为约10μm至约50μm厚。该聚合物涂层可以为约10μm至约100μm厚。该聚合物涂层可以为约50μm至约100μm厚。该聚合物涂层可以为约50μm至约200μm厚。该聚合物涂层可以为约100μm至约30μm厚。该聚合物涂层可以为约100μm至约500μm厚。凝胶和涂层可以另外包含用于修饰其物理化学性质例如疏水性的组分。例如，聚丙烯酰胺凝胶或涂层可以在其聚合物结构中包含修饰的丙烯酰胺单体，如乙氧基化的丙烯酰胺单体、磷酰胆碱丙烯酰胺单体和/或甜菜碱丙烯酰胺单体。该涂层可以是疏水或亲水的。该涂层可以包含聚合物涂层或聚合物刷，如聚丙烯酰胺或修饰的聚丙烯酰胺。该涂层可以包含凝胶，如聚丙烯酰胺凝胶或修饰的聚丙烯酰胺凝胶。该涂层可以包含金属，如图案化的电极或电路。该涂层或功能化可以包含结合剂，如链霉亲和素、亲和素、抗体、抗体片段或适体。该涂层或功能化可以包含多种要素，例如聚合物或凝胶涂层以及结合剂。凝胶和涂层可以另外包含标志物或允许标志物并入的反应性位点。标志物可以包括寡核苷酸。例如，可以在聚丙烯酰胺凝胶或涂层的聚合过程中添加5’-acrydite修饰的寡核苷酸。用于并入标志物的反应性位点可以包括溴乙酰基位点、叠氮基、与叠氮基-炔huisgen环加成相容的位点或其他反应性位点。可以将标志物以受控的方式并入到聚合物涂层中，其中特定的标志物位于该聚合物涂层的特定区域。可以将标志物随机并入到聚合物涂层中，由此特定的标志物可以随机地分布在整个聚合物涂层中。在一些情况下，对本文的聚合物涂层的物理化学性质进行修饰。该修饰可以通过在聚合过程中并入修饰的丙烯酰胺单体来实现。在一些情况下，在聚合过程中并入乙氧基化的丙烯酰胺单体。该乙氧基化的丙烯酰胺单体可以包含ch2＝ch-co-nh(-ch2-ch2-o-)nh形式的单体。该乙氧基化的丙烯酰胺单体可以包含羟乙基丙烯酰胺单体。该乙氧基化的丙烯酰胺单体可以包含乙二醇丙烯酰胺单体。该乙氧基化的丙烯酰胺单体可以包含甲基丙烯酸羟乙酯(hema)。乙氧基化的丙烯酰胺单体的并入可以导致更加疏水的聚丙烯酰胺表面涂层。在一些情况下，在聚合过程中并入磷酰胆碱丙烯酰胺单体。该磷酰胆碱丙烯酰胺单体可以包含其他磷酰胆碱丙烯酰胺单体。在一些情况下，在聚合过程中并入甜菜碱丙烯酰胺单体。该甜菜碱丙烯酰胺单体可以包含其他甜菜碱丙烯酰胺单体。在一些情况下，具有凝胶涂层的表面可以如下制备：将载玻片清洗(例如，用nanostrip溶液)、漂洗(例如，用去离子水)并干燥(例如，用n2)；将该载玻片表面用丙烯酰胺单体功能化；制备硅烷化溶液(例如，在乙醇和水中的5体积％(3-丙烯酰氨基丙基)三甲氧基硅烷)；将该载玻片浸没在硅烷化溶液中(例如，在室温下5小时)，漂洗(例如，用去离子水)，并干燥(例如，用n2)；制备12％丙烯酰胺凝胶混合物(例如，5mlh2o，1mg明胶，600mg丙烯酰胺，32mg双丙烯酰胺)；制备6％丙烯酰胺凝胶混合物(例如，50μl12％丙烯酰胺凝胶混合物，45μl去离子水，5μl5’-acrydite修饰的寡核苷酸引物(1mm)，涡旋混合)；使6％丙烯酰胺凝胶混合物活化(例如，每100μl凝胶混合物分别添加1.3μl的5％过硫酸铵和1.3μl的5％temed并涡旋)；将凝胶混合物施加至表面(例如，硅烷化功能化的载玻片表面)，使其均匀分布(例如，通过用盖玻片按压或通过旋涂)，并使其聚合(例如，在室温下20分钟)。viii.阵列扩增和再生每个阵列部分中的阵列组分(例如，核酸、寡聚物)的数目可以扩增或再生。如果模板阵列上的阵列组分已经变得耗尽(例如，由于转移过程中的损失)，则对于该模板阵列，扩增可能是期望的。如果转移阵列上的阵列组分的数目较低(例如，由于从具有低密度或小数目的阵列组分的模板阵列转移)，则对于该转移阵列，扩增可能是期望的。例如，图24示出了在酶促转移中使用并随后通过50-70次扩增循环扩增的模板阵列。可以通过在模板聚合物上使用衔接子序列来辅助扩增。除了一种或多种衔接子序列之外，聚合物还可以包含所需的最终序列。例如，模板寡核苷酸可以按顺序包含具有第一衔接子序列的3’端、具有第二衔接子序列的5’端以及在中间的所需最终序列。第一和第二衔接子序列可以是相同的或可以是不同的。在一些情况下，在同一阵列斑点中的寡核苷酸包含相同的第一和第二衔接子序列以及最终序列，而在不同阵列斑点中的寡核苷酸包含相同的第一和第二衔接子序列以及不同的最终序列。在转移阵列上的引物可以与衔接子序列互补，这可以允许引物与模板聚合物之间的杂交。这样的杂交可有助于阵列的扩增或再生。偶联至阵列的引物可以是一般的引物，例如，通用或随机引物，或靶标特异性引物。阵列组分的扩增可以酶促发生(例如，桥式扩增或rpa)。例如，如果该阵列组分包含寡核苷酸，则扩增可以通过核酸扩增反应如聚合酶链反应(pcr)、桥式扩增、桥式pcr、等温pcr、等温桥式扩增、等温桥式pcr、连续流pcr、重组酶聚合扩增(rpa)或其他反应而发生。所用的酶可以包括多种酶，如poli、polii、poliii、klenow、t4dnapol、修饰的t7dnapol、突变的修饰的t7dnapol、tdt、bst、taq、tth、pfu、pow、vent、pab或其他聚合酶；解旋酶；重组酶；或其他酶。阵列上偶联的聚合物(例如，核酸)的强度或密度可以通过扩增来恢复。阵列上偶联的聚合物(例如，核酸)的强度或密度可以通过扩增而增加至超过其初始值。阵列斑点可以在扩增期间扩大。例如，在28次扩增循环期间，桥式扩增或桥式pcr可以导致核酸分子扩大或移行50-100nm。阵列表面可以包含障碍物，以防止阵列组分扩增超出其单独的特征边界。障碍物可以包含物理边界、反应边界或其他边界。可以通过表面偶联的特征(例如，核酸或其他聚合物)的激光消融来制备边界。可以通过光激活的保护性基团来制备边界；例如，可以将光激活的保护性基团与整个阵列上的核酸偶联，随后可仅将所需的区域去保护。ix.应用和优势本公开内容中描述的组合物和方法可以用于一系列应用。例如，可以通过标准手段生成模板阵列，并可以从该模板生成作为互补或接受体阵列的多个接受体转移阵列。这可以导致制备成本降低。在一些情况下，可以从每个模板阵列生成至少5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、100,000、200,000、500,000个互补阵列或接受体阵列。例如，图23示出了转移前(左侧)和五次转移后(右侧)的模板阵列的图像。每个互补阵列可以产生与该模板阵列上的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的模板分子互补的寡核苷酸探针。接受体转移阵列可以包含比通过标准手段制备的阵列更加酶促有利的环境，因此使得更宽范围的反应能够在该阵列表面之上或附近进行。例如，接受体转移阵列可以包含聚合物凝胶或涂层如聚丙烯酰胺，其比未涂覆的表面如玻璃或硅更加有利于酶活性。可以制备包含3’端朝上的寡核苷酸的接受体转移阵列。这可以为杂交提供降低的空间位阻。这还可以提供对包括合成测序或基因分型(例如，snp检测)在内的进一步延伸有用的构型的寡核苷酸。可以生成具有非常长的寡核苷酸的接受体转移阵列。虽然非常长的寡核苷酸的合成可能导致非常少的全长寡核苷酸产物，但本公开内容中描述的组合物和方法可以生成主要包含或仅包含全长寡核苷酸的接受体转移阵列。在一些情况下，本公开内容中描述的组合物和方法可以提供具有高分辨率、5’至3’朝向的限定(即，非随机)序列并在酶相容表面上的阵列。对于酶促转移方法，寡核苷酸的固定化可以减少阵列特征之间的交叉污染。此外，对于单链模板，可以消除转移前制备互补链的需要。本发明提供了包括但不限于以下实施方案：1.一种用于生成阵列的方法，其包括：提供包含与其偶联的至少1,000个不同寡核苷酸的模板阵列，将所述模板阵列与接受体阵列偶联，该接受体阵列具有与所述至少1,000个不同寡核苷酸的部分互补的多个寡核苷酸，以及在所述模板阵列与酶阵列彼此偶联时进行酶促反应，由此生成包含接受体寡核苷酸的接受体阵列，其中至少40％的接受体寡核苷酸与来自所述至少1,000个不同寡核苷酸的全长寡核苷酸互补或相同。2.如实施方案1所述的方法，其中所述模板阵列包含至少100个斑点。3.如实施方案1所述的方法，其中所述模板阵列包含大小至多为约500μm的斑点。4.如实施方案1所述的方法，其中所述接受体寡核苷酸相对于所述接受体阵列的方向性与所述模板寡核苷酸相对于所述模板阵列的方向性相同。5.如实施方案1所述的方法，其中所述接受体寡核苷酸相对于所述接受体阵列的方向性与所述模板寡核苷酸相对于所述模板阵列的方向性相反。6.如实施方案1所述的方法，其中生成多个接受体阵列。7.如实施方案6所述的方法，其中在接受体阵列彼此之间，所述多个接受体寡核苷酸平均至少99％相同。8.如实施方案6所述的方法，其中在接受体阵列彼此之间，所述接受体寡核苷酸至少99％相同。9.一种用于生成阵列的方法，其包括：使用包含模板寡核苷酸的模板阵列合成包含接受体寡核苷酸的接受体阵列，其中在合成期间，所述接受体阵列与所述模板阵列偶联。10.如实施方案9所述的方法，其中至少40％的接受体寡核苷酸包含全长产物。11.如实施方案9所述的方法，其中至少50％的接受体寡核苷酸包含全长产物。12.如实施方案9所述的方法，其中至少60％的接受体寡核苷酸包含全长产物。13.如实施方案9所述的方法，其中所述接受体寡核苷酸相对于所述接受体阵列的方向性与所述模板寡核苷酸相对于所述模板阵列的方向性相同。14.如实施方案9所述的方法，其中所述接受体寡核苷酸相对于所述接受体阵列的方向性与所述模板寡核苷酸相对于所述模板阵列的方向性相反。15.如实施方案9所述的方法，其中生成多个接受体阵列。16.如实施方案15所述的方法，其中在接受体阵列彼此之间，所述多个接受体寡核苷酸平均至少99％相同。17.如实施方案15所述的方法，其中在接受体阵列彼此之间，所述接受体寡核苷酸至少99％相同。18.如实施方案15所述的方法，其中在每一个接受体阵列合成之后，将所述模板阵列与每一个接受体阵列物理分离。19.如实施方案15所述的方法，其中在每一个接受体阵列合成之后，通过升高温度将所述模板阵列与每一个接受体阵列分离。20.如实施方案9所述的方法，其中所述模板阵列包含至少100个斑点。21.如实施方案9所述的方法，其中所述模板阵列包含大小至多为约500μm的斑点。22.一种用于生成互补阵列的方法，其包括：(a)提供与第一基底偶联的多个模板寡核苷酸，所述多个模板寡核苷酸中的每一个均包含衔接子序列，其中对于所述多个模板寡核苷酸中的每一个，所述衔接子序列均相同；(b)提供与第二基底偶联的多个接受体寡核苷酸，所述多个接受体寡核苷酸中的每一个均包含与所述衔接子序列互补的序列；(c)使所述模板寡核苷酸的所述衔接子序列与所述接受体寡核苷酸的互补于所述衔接子序列的所述序列杂交；以及(d)使用所述多个模板寡核苷酸作为模板，对所述多个接受体寡核苷酸进行延伸反应。23.如实施方案22所述的方法，其中所述衔接子序列中的每一个均位于所述模板寡核苷酸的3’端或该3’端附近。24.如实施方案22所述的方法，其中所述衔接子序列中的每一个均位于所述模板寡核苷酸的5’端或该5’端附近。25.如实施方案22所述的方法，其中所述基底中的任一个包含聚合物。26.如实施方案22所述的方法，其中所述基底中的任一个包含丙烯酰胺或聚丙烯酰胺。27.如实施方案22所述的方法，其中进行步骤导致生成至少40％为全长产物的接受体寡核苷酸。28.如实施方案22所述的方法，其中进行步骤导致生成至少50％为全长产物的接受体寡核苷酸。29.如实施方案22所述的方法，其中进行步骤导致生成至少60％为全长产物的接受体寡核苷酸。30.如实施方案22所述的方法，其中所述接受体寡核苷酸相对于所述第二基底的方向性与所述模板寡核苷酸相对于所述第一基底的方向性相同。31.如实施方案22所述的方法，其中所述接受体寡核苷酸相对于所述第二基底的方向性与所述模板寡核苷酸相对于所述第一基底的方向性相反。32.如实施方案22所述的方法，其中重复该方法以产生至少2个接受体阵列。33.如实施方案22所述的方法，其中所述模板阵列包含至少100个斑点。34.如实施方案22所述的方法，其中所述模板阵列包含大小至多为约500μm的斑点。35.一种用于转移阵列的方法，其包括：(a)提供包含多个连接体位点的基底；(b)提供包含多个模板寡核苷酸的阵列；(c)向所述阵列施加反应混合物，所述反应混合物包含酶、dntp以及多个连接体寡核苷酸，该连接体寡核苷酸包含与附加至所述多个模板寡核苷酸中的每一个上的衔接子序列互补的序列，并且进一步包含能够结合至所述多个连接体位点的连接体分子；(d)使用所述多个模板寡核苷酸作为模板进行所述多个所述连接体寡核苷酸的延伸反应，由此生成包含所述连接体分子的多个延伸产物；(e)使所述阵列与所述基底接触；以及(f)将所述多个延伸产物的所述连接体分子连接至所述连接体位点。36.如实施方案35所述的方法，其中所述衔接子序列位于所述模板寡核苷酸的3’端或该3’端附近。37.如实施方案35所述的方法，其中所述衔接子序列位于所述模板寡核苷酸的5’端或该5’端附近。38.如实施方案35所述的方法，其中所述基底包含聚合物。39.如实施方案35所述的方法，其中所述基底包含丙烯酰胺或聚丙烯酰胺。40.如实施方案35所述的方法，其中所述模板阵列包含至少100个斑点。41.如实施方案35所述的方法，其中所述模板阵列包含大小至多为约500μm的斑点。实施例实施例1-模板通过单次延伸的酶促转移凝胶芯片表面的硅烷化将载玻片在nanostrip溶液中清洗过夜，用去离子(di)水漂洗并用n2干燥。然后，用丙烯酰胺单体将表面功能化，这将使聚丙烯酰胺凝胶结合至表面。用475ml乙醇、25ml去离子水和26ml(3-丙烯酰氨基丙基)三甲氧基硅烷制备硅烷化溶液，使硅烷的最终浓度为5％v/v。将一架(arackof)清洗和干燥后的载玻片浸没在硅烷化溶液中，并在室温下轻轻地搅拌5小时。随后将载玻片放置在新鲜的乙醇浴中，重复五次。然后，将载波片在去离子水浴中漂洗并用n2干燥。将载玻片储存在干燥室中直到进一步使用。丙烯酰胺凝胶混合物的制备用5.00mlh2o、1.00mg明胶、600.00mg丙烯酰胺和32.00mg双丙烯酰胺制备12％的丙烯酰胺凝胶混合物。将组分溶解并混合在一起，得到最终浓度为12％的丙烯酰胺凝胶混合物。对于6％的凝胶芯片，将50μl的12％丙烯酰胺凝胶混合物、45μl的去离子水以及μl的5’-acrydite-fc1(1mm浓度)功能化的寡核苷酸合并以得到50μl的总体积并涡旋。薄凝胶的聚合对于以上制备的6％凝胶芯片的混合物，每100μl反应混合物添加1.3μl的5％过硫酸铵和1.3μl的5％temed作为活化剂，最终活化剂浓度各为0.065％。然后将混合物涡旋。将15μl的凝胶混合物用移液管移到干净的平坦表面例如载玻片或硅晶片上。用如上制备的凝胶-芯片载玻片表面面朝下覆盖表面上的凝胶混合物。向下按压该玻璃芯片以实现凝胶混合物的更加均匀的分布。使凝胶在室温下聚合20分钟。将凝胶结合至该芯片，并将该凝胶-芯片基底从干净的平坦表面上去除，如需要，在剃须刀片或其他器具的辅助下进行。将凝胶芯片在去离子水中漂洗，并从芯片边缘去除过量的凝胶。凝胶芯片可以立即使用或储存在4x盐水-柠檬酸钠(ssc)缓冲液中。酶混合物的制备用37μlh2o、5μl10xthermopol缓冲液、5μlbsa(10mg/ml)、1μldntp(10mm)和2μlbstdna聚合酶(8u/μl)制备酶混合物。模板通过单次延伸的酶促转移将如上制备的18μl酶混合物放置在制备的凝胶芯片的顶部。使该酶混合物溶液向凝胶内渗透30秒。然后，将该凝胶芯片面朝下放置在模板芯片上。将一片pdms放置在两个芯片的顶部作为顺应层，并将芯片堆叠放置在夹具如铝制夹具中。将该芯片堆叠在湿度室中在55℃下温育2小时。然后，在该芯片堆叠的边缘周围添加额外的4x盐水-柠檬酸钠(ssc)缓冲液，并使其被吸入以使凝胶芯片松开。然后将凝胶芯片表面与模板芯片表面拉开，如需要，在剃须刀片或其他器具的辅助下进行。凝胶仍结合至凝胶芯片，并具有转移的寡核苷酸。将模板芯片在去离子水中洗涤并用n2干燥。将凝胶芯片用4xssc缓冲液洗涤三次并用2xssc缓冲液洗涤三次。转移的图案的成像将fc2qc-cy3寡核苷酸与如上文中使用的模板芯片在55℃下杂交35分钟。杂交后，将该模板芯片漂洗并成像。将sp2-cy3寡核苷酸与如上制备的具有转移寡核苷酸的凝胶芯片在55℃下杂交30分钟。随后将该凝胶芯片用4xssc缓冲液漂洗两次并用2xssc缓冲液漂洗两次，并让其在4xssc缓冲液中浸泡3小时以降低背景信号。可以备选地将该凝胶芯片在4xssc缓冲液中摇动20分钟，而非浸泡3小时。然后，在落射荧光显微镜下，在所需放大倍数如10x和40x下对该凝胶芯片进行成像。然后，将该凝胶芯片剥离并与针对模板芯片的fc2qc-cy3寡核苷酸杂交。然后，将该凝胶芯片再成像，并且观察指示模板分子的物理转移的信号。按成分体积制备用于模板扩增的反应缓冲液用1.5ml的10xtaq缓冲液、750μl100％dmso、3ml5m甜菜碱、120μl25mmdntp、75μl5000u/mltaq聚合酶和9.555ml无核酸酶h2o制备反应缓冲液。按最终浓度制备用于模板扩增的反应缓冲液在无核酸酶h2o中以1xtaq缓冲液、5％dmso、1m甜菜碱、0.2mmdntp、25u/mltaq聚合酶的最终浓度制备反应缓冲液。通过热循环的模板扩增将具有寡核苷酸的凝胶芯片用添加有0.1％吐温-20的0.3xssc缓冲液洗涤。然后使该凝胶芯片经历50个浸没于溶液浴中的循环，该循环如下：a)在94℃下在具有0.1％吐温-20的0.3xssc缓冲液中45秒；b)在60℃下在具有0.1％吐温-20的5xssc缓冲液中2分钟；以及c)在72℃下在按照上文制备的反应缓冲液中1分钟。该凝胶芯片上的模板得到扩增。芯片上的探针杂交将具有双链dna(dsdna)的待成像的芯片放置在0.1nnaoh溶液中3分钟以使该dna变性。洗涤后，用4xssc缓冲液洗涤该芯片。然后该芯片与20ml的100nm荧光标记的杂交探针溶液在章动器(nutator)上在55℃下温育40分钟。温育后，将该芯片用4xssc缓冲液洗涤两次并用2xssc缓冲液洗涤两次，每个洗涤步骤持续20分钟。然后对该芯片进行成像。实施例2-从光引导的3’-5’阵列到5’-3’全长阵列通过标准的光引导合成，制备具有3’-5’寡核苷酸特征的模板微阵列，其中该寡核苷酸含有衔接子1序列、在特征之间不同的探针序列以及衔接子2序列。将寡核苷酸与还含有可固定的连接体的、与衔接子1互补的引物杂交。用聚合酶进行引物延伸反应。使第一接受体阵列表面与模板阵列接触，并将该连接体结合至其表面。将两个表面分开，并且该接受体阵列含有5’-3’朝向的部分长度和全长产物两者。将寡核苷酸与还含有可固定的连接体的、与衔接子2互补的引物杂交。用聚合酶进行引物延伸反应。使第二接受体阵列表面与模板阵列接触，并将该连接体结合至其表面。将两个表面分开，并且该第二接受体阵列主要含有5’-3’朝向的全长产物。实施例3-阵列转移方案(bio3d)聚丙烯酰胺凝胶灌制(第二表面)以下溶液的制备和过滤：a.具有50μmacryd-fc2的6％丙烯酰胺凝胶混合物(第二表面)表1.丙烯酰胺混合物b.2.6％过硫酸铵(aps，w/v)：13mgaps加入到500μlmilli-q水中。c.2.6％temed(v/v)：7.8μltemed加入到292.2μlmilli-q水中。丙烯酰胺凝胶(最终浓度0.13％)的活化，以及向丙烯酰基-硅烷化的固体表面如玻璃和熔融二氧化硅上的灌制a.取出预先切块的1x1英寸的硅烷化的熔融二氧化硅，用氮气吹扫表面。b.取新鲜的1.5mleppendorf管，按照以下顺序添加溶液：9μl6％凝胶混合物、0.5μl2.6％aps和0.5μl2.6％temed。将溶液彻底涡旋并快速旋转至底部。c.将9μl活化的凝胶混合物溶液以一滴添加至硅烷化的玻璃表面上，立即取出新的盖玻片(圆形，直径18mm)，用氮气吹扫盖玻片表面，并将该盖玻片小心地放在凝胶混合物的顶部。该凝胶混合物将散开并填充盖玻片与硅烷化的玻璃表面之间的整个区域。d.在30分钟的丙烯酰胺凝胶聚合后，添加milli-q水以漂洗盖玻片的边缘。采用剃须刀片小心地将盖玻片从一侧抬起。用milli-q水漂洗凝胶。现在凝胶已准备好进行打印。凝胶打印(第一至第二表面)打印溶液的制备(每次打印100μl)：表2.打印溶液配制bst(8u/ul)：最终0.32u/μl4μldntp(10mm)：最终0.2mm2μl10xthermopol10μl无核酸酶h2o84μl总计100μlbst、dntp、bsa和10xthermopol均制成保持在-20℃下的小等份。用50μl打印溶液预浸泡凝胶10分钟打印盒的设置：从底部到顶部：1x1英寸的丙烯酸树脂、1x1英寸的pdms、在1x1英寸的硅烷化的熔融二氧化硅上的丙烯酰胺凝胶、打印溶液(向该凝胶上添加50μl打印溶液)、模板芯片(通过双面胶带胶粘至1x1英寸的丙烯酸树脂)。在55℃下在湿度室中温育4hr热变性：将打印盒解离，并将模板和凝胶(仍然在一起)留在低盐溶液(具有0.1％吐温-20的0.3xssc，在80℃水浴中加热)中10分钟。然后，小心地从模板上分离凝胶。将凝胶留在4xssc中。凝胶打印(第二至第三表面)第二表面上的寡核苷酸的3’端的双脱氧核苷酸加帽用末端转移酶(tdt)处理第二表面：0.5μltdt、0.4μl25mmddctp(或任何ddntp)、5ul10xtdt缓冲液、44ul水。37℃持续30分钟。然后，将tdt在70℃下灭活10分钟。打印溶液的制备(每次打印100μl)：表3.打印溶液配制bst(8u/ul)：最终0.32u/μl4μldntp(10mm)：最终0.2mm2μl10xthermopol10μl无核酸酶h2o84μl总计100μlbst、dntp、bsa和10xthermopol均制成保持在-20℃下的小等份。用50μl打印溶液预浸泡第二表面10分钟打印盒的设置从底部到顶部：1x1英寸的丙烯酸树脂、1x1英寸的pdms、在1x1英寸的硅烷化的熔融二氧化硅上的丙烯酰胺凝胶、打印溶液(向该凝胶上添加50μl打印溶液)、第三表面(1x1cm2，通过双面胶带胶粘至1x1英寸的丙烯酸树脂)。注意：第三表面目前由meng制备。基本上，将1x1cm2大小的熔融二氧化硅用于丙烯酰胺凝胶灌制(丙烯酰胺：溴乙酰基-丙烯酰胺＝40:1)。将200μm硫代磷酸酯-compsp2接种到凝胶表面上，在室温下过夜。在55℃下在湿度室中温育4hr(第二至第三表面打印的准确最佳条件有待确定)热变性将打印盒解离，并将模板和凝胶(仍然在一起)留在低盐溶液(具有0.1％吐温-20的0.3xssc，在80℃水浴中加热)中10分钟。然后，小心地从模板上分离凝胶。将凝胶留在4xssc中。实施例4：从合成的芯片向聚丙烯酰胺第二表面上的打印基于pyrophage的线性pcr打印可以有效地增加打印信号：与1hrbst打印相比，通过30个pcr循环信号增加10倍。在整个打印过程中保持冲压对维持打印分辨率很关键。无论采用bst还是pyrophage，无论使用3’->5’还是5’->3’合成的芯片，较长的打印时间均极大地改善了打印信号(可达18倍)。对于基于bst的打印，4hr是最佳的。图25示出了在不使用基于pyrophage的线性pcr打印的情况下生成的打印图像(在20s曝光、10x、1bin、100-600下拍摄，与cy3-compsp2杂交)，并且显示了一些信号，而图26示出了在不使用基于pyrophage的线性pcr打印的情况下生成的打印图像(在20s曝光、10x、1bin、100-4095下拍摄，与cy3-compsp2杂交)，并且显示几乎没有信号。相比之下，图27示出了使用基于pyrophage的线性pcr打印在55℃下打印1hr生成的打印图像，在20s曝光、10x、1bin、1400-4095下拍摄，与cy3-compsp2杂交。图28示出了采用基于pyrophage的线性pcr打印、从第一表面到第二表面1hr、4hr或过夜而生成的打印(阵列)图像的比较。在所有图像中拍摄的所有图像均采用10s曝光、100-2000拍摄。图28显示在恒定的曝光时间下，从第一到第二表面较长的基于pyrophage的打印也极大地改善了信号。图29示出了通过基于bst的打印、在55℃下从第一表面到第二表面1hr、2hr、3hr、4hr、6hr和过夜而生成的图像的比较。从第一表面到第二表面的4hr基于bst的打印给出了在55℃下的最佳打印信号。在所有图像中拍摄的所有图像均采用10s曝光、100-2000拍摄。图30示出了在55℃下合成1hr、从第一表面到第二表面(5’->3’合成)的基于bst的打印的图像。图30显示与在55℃下打印1hr相比，从第一表面到第二表面(5’->3’合成)的较长的基于bst的打印也极大地改善了打印信号。所有图像均采用10s曝光，200-2000拍摄。总之，将打印信号与在55℃下打印1hr进行比较，并且与在55℃下打印1hr相比，打印信号也得到极大的改善，在20s曝光、10x、1bin、1400-4095下拍摄，与cy3-compsp2杂交。第二表面(4hr打印的)上的全长特征的强度为第一表面上全长特征的强度的约10％。通过比较凝胶中交联的引物与全长延伸的寡核苷酸之间的杂交信号，估计14.3％的引物在4hr打印中被用于生成全长产物。如果全长产物是总合成寡核苷酸的35.8％(假设光合成的每一步的效率为约95％，总共20个碱基)并且全长寡核苷酸和部分长度寡核苷酸与引物退火的几率相同，则总引物的40.1％在4hr期间被使用/延伸。可以在如图31所示的打印的第二表面上可靠地分辨出1微米的特征。实施例5：从聚丙烯酰胺第二表面向br-ac第三表面上的打印使用bst过夜打印的第二表面作为模板，进行另一个向br-ac第三表面上的bst过夜打印。在减去背景信号后，第二表面(过夜打印的，图32)和第三表面上的全长特征的强度分别为第一表面上全长特征的强度的5％-10％和2％-3％。图32示出了10s曝光，10x，1bin，100-600，cy3-compsp2。作为进行过夜打印的替代方式，从过夜打印的第二表面通过pcr对br-ac第三表面进行扩增和打印(见图33)。图33示出了从过夜打印的第二表面过夜打印的br-ac第三表面(10s曝光，10x，1bin，200-1700，与cy3-fc2杂交)。在该方法中，打印和扩增的全长寡核苷酸的密度为第一表面上全长寡核苷酸的密度的5％-7％。在两种第二到第三打印方法的一些情况下看到了不均匀的打印信号，这可能是由于不均匀的引物接种和/或打印及分离期间的破坏。图34示出了从过夜打印的第二表面pyrophage打印和扩增的br-ac第三表面。在pcr后，使用user酶切割一条链。(10s曝光，10x，1bin，1500-3000，cy3-am2)。虽然本文已经显示和描述了本发明优选的实施方案，但是对于本领域技术人员而言显然这些实施方案仅仅是作为示例提供的。本领域技术人员在不偏离本发明的前提下将会想到大量的变化、改变和替换。应当理解，在本发明的实践中可以使用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，由此覆盖在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。当前第1页12