一种培养基及其用于检测大肠杆菌的应用的制作方法

本发明涉及大肠杆菌检测技术领域，具体涉及一种培养基及其用于检测大肠杆菌的应用。

背景技术：

传统的大肠杆菌(e.coli)检测方法主要包括多管发酵、滤膜法和平板计数法(gb4789.3-2016替代gb/t4789.32-2002)，这些方法都具有操作繁琐、耗时长和灵敏度低的缺点。近年来，科学工作者发展了很多快速检测方法，主要分为三类：分子生物学方法、免疫分析技术和代谢学技术。其中，分子生物学方法是基于遗传物质的检测，准确性有保障。但是该方法需要专业仪器和技术，不能实现在线监测；且检测信号基于遗传物质扩增(pcr等)，检测限一般在10²以上。免疫分析技术能够实现快速检测，但是该技术只针对表面抗原、抗体已知菌的检测，如大肠杆菌o157：h7试剂盒，是针对某一血清型大肠杆菌的检测，不能完成水体中所有大肠杆菌的广谱检测。基于代谢学检测的技术能够检测水中大部分类型的大肠杆菌。目前最有效的是利用e.coli产生β-葡萄糖醛酸酶的特点，能分解4-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(mug)生成具有荧光的4-甲基伞形酮(4-mu)进行检测，94-97％的大肠杆菌具有该代谢途径。

现有技术1已被列入国标法(hj1001-2018)，该方法使用minimalmediumonpg-mug(mmo-mug)培养基，采用97孔板，计数反应终点时具有荧光的格子(存在大肠杆菌将mug转化为4-mu的格子)，然后根据有荧光格子的数量查表得出样品中大肠杆菌的最大可能数(mpn)。该方法存在不足为：1、反应时间要大于24h，才能使培养基中mug绝大部分转化为4-mu，积累到肉眼可见的量；2、每个格子里面含有大肠杆菌的数量差异无法体现，都被记作一个“有荧光的格子”后查表，所以不能得到样品中大肠杆菌的具体浓度值；即该方法给出的结果为最大可能数mpn，不是具体浓度值；3、检出限为10mpn/l，并且因不区分单个格子中大肠杆菌数量，不具备线性。4、配置为溶液后需要立即使用，对于在线监测仪器的运维难以实现。现有技术2申请号为200410051350.7的中国专利申请公开了一种快速测定大肠杆菌的检测方法，该方法将配制好的mug培养液，分装于试管，接种样品到培养液中，35-44℃下培养6-12h后用荧光分光光度计测定366nm处培养液的荧光强度，根据该条件下荧光强度与菌浓度的对应关系，测得样品中大肠杆菌数。该方法存在不足为：1、低于10个大肠杆菌样品检测时间大约需20-24h；2、配置为溶液后需要立即使用，在实验室操作可以实现，但是对于在线监测仪器的运维难以实现。基于代谢学检测大肠杆菌的培养基组成可归纳为三种成分：酶底物，如mug等；营养物，如蛋白胨、牛肉膏和酵母浸膏等；盐溶液，目前本领域多沿用mmo-mug的盐溶液。在这三种成分中，酶底物的作用是指示剂；营养物提供大肠杆菌分裂增生的底物；盐溶液是影响大肠杆菌活性和代谢活性的有效因素。因此，对盐溶液的研究可以加快反应，提升检测速度。

技术实现要素：

本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种培养基及其用于检测大肠杆菌的应用。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：

本发明提供一种培养基，包括：酶底物1、营养物2、和贮存液3；

所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(4-methylumbelliferyl-β-d-glucuronide，缩写mug)；

所述营养物2为胰蛋白胨或蛋白胨；

所述贮存液3为盐溶液，其组成成分如下：

磷酸盐缓冲溶液：每升含量包括磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钾25g、磷酸氢二钠20g和氯化铵2g；

硫酸镁溶液，每升含量11g；

氯化钙溶液，每升含量28g；

氯化铁溶液，每升含量0.15g。

在上述技术方案中，优选的是：所述培养基，包括：

所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷，其质量浓度为0.25-150mg/l；

所述营养物2为胰蛋白胨，其质量浓度为0-10g/l；

所述贮存液3的各组成成分的用量为0.2-5ml/l。

在上述技术方案中，进一步优选的是：所述培养基，包括：

所述酶底物1为4-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(mug)，其质量浓度为75mg/l；

所述营养物2为胰蛋白胨，其质量浓度为10g/l；

所述贮存液3的组成成分各1ml/l。

在上述技术方案中，优选的是：当检测的实际样品中存在真菌或革兰氏阳性菌时，所述培养基还可以添加两性霉素b(amphotericinb)或茄属植物萃取物(solanum萃取物)或胆盐。

在上述技术方案中，进一步优选的是：1l培养基中添加两性霉素b(amphotericinb)1mg，或茄属植物萃取物(solanum萃取物)500mg，或胆盐1.5g。

本发明提供一种所述培养基用于检测大肠杆菌的应用。

使用本发明的培养基用于检测大肠杆菌，包括以下步骤：

步骤1、按照配方配制培养基。

步骤2、以无菌操作接种大肠杆菌于纯培养基中，培养至稳定期，经过系列稀释后用于制备标准曲线。

步骤3、将步骤2的菌液用标准平板计数法(cfu)定量得到纯培养大肠杆菌的真实浓度。

步骤4、接种步骤2的稀释为系列浓度的各菌液于步骤1制备的培养基中，由步骤3的cfu定量结果计算各菌液中含有大肠杆菌数量；

步骤5、接种实际待测样品于步骤1制备的培养基中并添加两性霉素b或茄属植物萃取物或胆盐；

步骤6、将步骤4和步骤5的培养基于35-44℃温育6-19h，测量荧光强度，激发366nm，读取450nm处发射峰峰值；

步骤7、根据步骤4测得的大肠杆菌数量、及步骤6测得的发射峰峰值，绘制标准曲线；将步骤5和步骤6测得的峰值带入标准曲线，计算得出实际待测样品中大肠杆菌的浓度。

在上述技术方案中，优选的是：步骤5中1l培养基中添加两性霉素b(amphotericinb)1mg，或茄属植物萃取物(solanum萃取物)500mg，或胆盐1.5g。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的培养基用于检测大肠杆菌的方法具有以下优点：

1)缩短检测时间，突出的是针对低浓度大肠杆菌检测，本发明的培养基的贮存液3盐溶液，有利于加速大肠杆菌产生酶分解底物，通过与现有技术对比检测低浓度大肠杆菌提速5小时，实现当天出结果；而现有技术1和2，需要大于24h出检测结果；

2)检测结果为大肠杆菌的具体浓度值，而不是最大可能数mpn值；

3)灵敏度高，可实现反应体系中低至1个大肠杆菌的检测。

2、本发明提供的培养基的贮存液3为独立的盐溶液，此溶液可在0-4℃稳定保存6个月以上，方便实现在线监测。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

图1为使用本发明实施例1的培养基与现有技术2的培养基，荧光信号产生对应时间图。

图2为本发明实施例2的培养基检测大肠杆菌的cfu与荧光强度曲线。

图3为本发明实施例3的培养基检测大肠杆菌的cfu与荧光强度曲线。

图4为本发明实施例4的培养基检测大肠杆菌的cfu与荧光强度曲线。

图5为本发明实施例5的培养基检测大肠杆菌的cfu与荧光强度曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作详细说明，不能认定本发明具体实施例仅限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干推演或替换，都应当视为属于本发明保护的范围。

实施例1

1、按照本发明的培养基配方配制溶液1(标记为this)

本发明的培养基配方：酶底物14-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(mug)7.5mg/l，营养物2胰蛋白胨10.0g/l，加入贮存液3各1ml/l；

贮存液3为盐溶液，其组成成分如下：

磷酸盐缓冲溶液：每升含量包括磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钾25g、磷酸氢二钠20g和氯化铵2g；

硫酸镁溶液，每升含量11g；

氯化钙溶液，每升含量28g；

氯化铁溶液，每升含量0.15g。

2、按照现有技术2公开的配方配制溶液2(标记为other)；

现有技术2培养基购买市售商品，1l培养基含有以下成分：

4-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(mug)75.0mg；

胰蛋白胨10.0g；

硫酸铵[(nh4)2so4]5.0g；

硫酸锰(mnso4)0.5mg；

硫酸锌(znso4)0.5mg；

硫酸镁(mgso4)100.0mg；

氯化钠(nacl)10.0g；

氯化钙(cacl2)50.0mg；

亚硫酸钠(na2so3)40.0mg；

kh2po40.9g；

na2hpo46.2g。

3、以无菌操作接种e.colidh5α于lb培养基中，培养至稳定期，37℃，220转/分钟条件下大约需要12h。将培养后的e.coli离心清洗3次，定量od600＝0.2为菌液a，将菌液a稀释10²为菌液b，稀释10⁴为菌液c，稀释10⁵为菌液d，稀释10⁶为菌液e。

4、将上述菌液用标准平板计数法(cfu)定量，接种50μl菌液c于平板，平均含有174cfu大肠杆菌，其他菌液浓度由此推算。

5、分别将接种菌液e115μl于5ml溶液1和溶液2中。由cfu定量结果计算菌液e115μl中含有大肠杆菌数量为4cfu。

6、37℃温育0-24h，每小时测量一次荧光强度。激发366nm，读取450nm处发射峰峰值。

7、根据测得的大肠杆菌数量与荧光强度绘制标准曲线，结果参见图1：使用本实施例的培养基配方的荧光产生信号比使用现有技术2的培养基配方提前5小时，大大缩短低浓度大肠杆菌检测时间。

实施例2

1、按照本发明的培养基配方配制溶液

本发明的培养基配方：酶底物14-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(mug)0.25mg/l，营养物2胰蛋白胨10.0g/l，加入贮存液3各5ml/l；

贮存液3为盐溶液，其组成成分同实施例1的第1步中贮存液3。

2、以无菌操作接种e.coliatcc25922于lb培养基中，培养至稳定期，37℃，220转/分钟条件下大约需要12h。将培养后的e.coli离心清洗3次，定量od600＝0.2为菌液a，将菌液a稀释10²为菌液b，稀释10⁴为菌液c，稀释10⁵为菌液d，稀释10⁶为菌液e。

3、将上述菌液用标准平板计数法(cfu)定量，接种50μl菌液d于平板，平均含有32.5cfu大肠杆菌，其他菌液浓度由此推算。

4、分别接种菌液e15μl，30μl，60μl，90μl，120μl，150μl于5ml培养基中。由cfu定量结果计算依次含有大肠杆菌1，2，4，6，8，10cfu。

5、35℃温育19h，测量荧光强度。激发366nm，读取450nm处发射峰峰值。

6、根据测得的大肠杆菌数量与荧光强度绘制标准曲线，结果参见图2。

实施例3

1、按照本发明的培养基配方配制溶液

本发明的培养基配方：酶底物14-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(mug)7.5mg/l，营养物2胰蛋白胨1.0g/l，加入贮存液3各1ml/l。

贮存液3为盐溶液，其组成成分同实施例1的第1步中贮存液3。

2、以无菌操作接种e.coliatcc25922于lb培养基中，培养至稳定期，37℃，220转/分钟条件下大约需要12h。将培养后的e.coli离心清洗3次，定量od600＝0.2为菌液a，菌液a稀释10²为菌液b，稀释10⁴为菌液c，稀释10⁵为菌液d，稀释10⁶为菌液e。

3、将上述菌液用标准平板计数法(cfu)定量，接种50μl菌液d平板，平均含有32.5cfu大肠杆菌，其他菌液浓度由此推算。

4、接种一定量的e.coli于培养基。本次实验分别接种菌液e15μl，150μl，300μl，450μl，600μl于5ml培养基中，由cfu定量结果计算依次含有大肠杆菌1，10，20，30，40cfu。

5、37℃温育16h，测量荧光强度。激发366nm，读取450nm处发射峰峰值。

6、根据测得的大肠杆菌数量与荧光强度绘制标准曲线，结果参见图3。

实施例4

1、按照本发明的培养基配方配制溶液

本发明的培养基配方：酶底物14-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(mug)150.0mg/l难溶，营养物2蛋白胨1.0g/l，加入贮存液3各0.2ml/l；

贮存液3为盐溶液，其组成成分同实施例1的第1步中贮存液3。

2、以无菌操作接种e.coliatcc25922于lb培养基中，培养至稳定期，37℃，220转/分钟条件下大约需要12h。将培养后的e.coli离心清洗3次，定量od600＝0.2为菌液a，菌液a稀释10²为菌液b，稀释10⁴为菌液c，稀释10⁵为菌液d，稀释10⁶为菌液e。

3、将上述菌液用标准平板计数法(cfu)定量，接种50μl菌液d平板，平均含有32.5cfu大肠杆菌，其他菌液浓度由此推算。

4、接种一定量的e.coli于培养基。本次实验分别接种菌液c15μl，30μl，60μl，90μl，120μl，150μl于5ml培养基中，由cfu定量结果计算依次含有大肠杆菌100，200，400，600，800，1000cfu。

5、44℃温育8h，测量荧光强度。激发366nm，读取450nm处发射峰峰值。

6、根据测得的大肠杆菌数量与荧光强度绘制标准曲线，结果参见图4。

实施例5

1、按照本发明的培养基配方配制溶液

本发明的培养基配方：酶底物14-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(mug)150.0mg/l难溶，营养物2蛋白胨10.0g/l，加入贮存液3各0.2ml/l；

贮存液3为盐溶液，其组成成分同实施例1的第1步中贮存液3。

2、以无菌操作接种e.colidh5α于lb培养基中，培养至稳定期，37℃，220转/分钟条件下大约需要12h。将培养后的e.coli离心清洗3次，定量od600＝0.2为菌液a，菌液a稀释10²为菌液b，稀释10⁴为菌液c，稀释10⁵为菌液d，稀释10⁶为菌液e。

3、将上述菌液用标准平板计数法(cfu)定量，接种50μl菌液d平板，平均含有17.4cfu大肠杆菌，其他菌液浓度由此推算。

4、接种一定量的e.coli于培养基。本次实验分别接种菌液c14.3μl，28.6μl，57.5μl，86μl，115μl，143μl于5ml培养基中，由cfu定量结果计算依次含有大肠杆菌50，100，200，300，400，500cfu。

5、37℃温育10h，测量荧光强度。激发366nm，读取450nm处发射峰峰值。

6、根据测得的大肠杆菌数量与荧光强度绘制标准曲线，结果参见图5。

实施例6

1、培养基

1)实施例1配制的溶液1，添加两性毒素b1mg/l或茄属植物萃取物500mg/l。

2)现有技术1，购买市售商品，按照说明书操作并查表得出结果；

现有技术1培养基配方如下：

采用minimalmediumonpg-mug(mmo-mug)培养基，1l培养基含有以下成分：

硫酸铵[(nh4)2so4]5.0g；

硫酸锰(mnso4)0.5mg；

硫酸锌(znso4)0.5mg；

硫酸镁(mgso4)100.0mg；

氯化钠(nacl)10.0g；

氯化钙(cacl2)50.0mg；

亚硫酸钠(na2so3)40.0mg；

两性霉素b(amphotericinb)1.0mg；

邻硝基苯-β-d-吡喃半乳糖苷(onpg)500.0mg；

4-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷(mug)75.0mg；

茄属植物萃取物(solanum萃取物)500.0mg；

n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸钠盐(hepes钠盐)5.3g；

n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸(hepes)6.9g；

3)现有技术2，购买市售商品，即实施例1中配制的溶液2。

2、参照实施例2至5所述方法，分别绘制溶液1和溶液2的标准曲线。

3、实际样品

样品1：实验室下水道水样。

样品2：冰雪融水。

样品3：湖水。

样品4：擦拭某社区医院桌椅的卫生棉球，用100ml无菌生理盐水浸润。

上述样品取样后调节ph中性，不做其他任何处理，但保证采样后即刻测量。均分4份，分别用于本发明的培养基、现有技术1培养基、现有技术2培养基、标准平板计数法检测大肠杆菌数量。取以上样品各100ml，按照本发明的培养基、现有技术1培养基、现有技术2培养基的配方用量配制。另一份用无菌滤纸片浓缩后进行平板计数。

4、37℃温育16h，激发366nm，读取450nm处发射峰峰值，将峰值带入标准曲线，计算得出大肠杆菌浓度。

5、结果见下表：

现有技术1及其同类方法是利用在反应的终点判读，即反应终点判读一个格子的培养基中“有”或者“没有”大肠杆菌，不区分数量。现有技术1给出结果为最大可能数mpn，准确性差。现有技术2与本发明利用反应过程中特定产物与大肠杆菌浓度建立关系。由于盐溶液配方不同使得反应速度不同，针对低浓度样品，本发明比现有技术2快5小时。即在16h时，本发明的培养基配方成功检测出样品1和样品2中大肠杆菌的数量，但是现有技术2不能达到。标准平板计数法结果准确，但误差大，而且平板培养耗时长和不利于制备在线监测仪器。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。