本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体t171a及其应用，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase，简称cgtase，ec2.4.1.19)是α-淀粉酶家族(gh13)中的主要成员。它作为一种多功能酶，可催化四种不同的反应，包括三种转糖基(transfructosylation，又称转糖苷)反应-歧化反应、环化反应和偶合反应以及一种水解反应。其中，歧化反应占据主导地位，该反应是将直链低聚糖被切断的部分转移到另一受体上，是一种分子外转糖基反应；环化反应作为一种分子内转糖基反应，这是cgtase的特征反应，其原理是将直链麦芽低聚糖上非还原端的o4或c4上的糖苷转移到同一直链还原端的c1或o1上。环化反应的逆反应就是偶合反应，它可以打开环糊精的环，将糖苷转移到直链麦芽低聚物上。cgtase同时具备催化环化反应和耦合反应的活性，是导致其在催化淀粉发生反应的过程中，随着时间延长，产物逐渐由α-环糊精向β-环糊精转变的原因。cgtase催化淀粉发生水解反应时，是将直链淀粉分子切断以后，将断开的两端分子都转移到水分子上，完成水解反应；cgtase催化水解反应的活性较弱。
cgtase的应用比较广泛，最常见的就是通过环化反应把淀粉转化为环糊精。根据生成的环糊精种类的不同，可以把cgtase分为α-cgtase、β-cgtase、γ-cgtase，此外，还有报道显示cgtase能催化淀粉生产8个葡萄糖单元以上的环糊精。通过歧化和耦合反应，cgtase可以将转化淀粉或环糊精生成的单糖或低聚糖作为供体提供给各种受体分子，以改善其特性。例如，通过cgtase的歧化和偶合反应将小分子糖转移到蔗糖或果糖上而生产抗龋齿功能偶合糖；对甜菊苷、芸香苷、鼠李糖等物质进行糖基化修饰，显著改善其性能，使之可更加广泛地应用于食品、医药、化工等领域。
bacilluscirculans251来源的cgtase是一种典型的β-cgtase，其优秀的转糖基性能可被应用多个领域。但是，该cgtase歧化活力(约40u/ml)较其他来源的cgtase低，提高该酶歧化活力势在必行。
技术实现要素：
发明所要解决的一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的一个或多个氨基酸位点进行突变；这些位点包括：第6位的缬氨酸(val)、90位的丝氨酸(ser)、168位的苏氨酸(thr)、171位的苏氨酸(thr)、383位的苏氨酸(thr)、608位的甘氨酸(gly)。所述突变体催化歧化反应的活力有所提高。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于环状芽孢杆菌(b.circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。编码所述来源于环状芽孢杆菌(b.circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第6位的缬氨酸(v)突变为天冬氨酸，命名为v6d。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第90位的丝氨酸(t)突变为甘氨酸，命名为s90g。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第168位的苏氨酸(t)突变为丙氨酸，命名为t168a。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第171位的苏氨酸(t)突变为丙氨酸，命名为t171a。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第383位的苏氨酸(t)突变为丙氨酸，命名为t383a。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第608位的甘氨酸(g)突变为丙氨酸，命名为g608a。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第228位的第6位的缬氨酸(v)突变为天冬氨酸，同时将第90位的丝氨酸(t)突变为甘氨酸，第168位的苏氨酸(t)突变为丙氨酸，第171位的苏氨酸(t)突变为丙氨酸，第383位的苏氨酸(t)突变为丙氨酸，第608位的甘氨酸(g)突变为丙氨酸，命名为v6d/s90g/t168a/t171a/t383a/g608a。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)在bacilluscirculans251来源的环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化环糊精葡萄糖基转移酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为puc系列，pet系列，或pgex中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌和真菌细胞，其也为本发明的保护范围。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
本发明的有益效果：
本发明得到了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，突变体v6d、s90g、t168a、t171a、t383a、g608a和v6d/s90g/t168a/t171a/t383a/g608a的摇瓶发酵酶歧化活力分别为野生酶的1.89倍、1.21倍、1.21倍、1.22倍、1.32倍、2.03倍、3.16倍。本发明对环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义，并提高了该酶的在食品、医药、化工行业中的应用潜力。
具体实施方式
本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。
下述实施例中涉及的培养基和检测方法如下：
lb培养基(g·l-1)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
tb培养基(g·l-1)：胰蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，kh2po42.31，k2hpo4·3h2o16.43，甘氨酸7.5。
环糊精葡萄糖基转移酶催化歧化反应的活力的测定方法：以50mmol/lph5.5的磷酸盐缓冲液为溶剂，分别配置12mm的eps(4,6-亚乙基-对硝基苯-α-d-麦芽七糖苷)和20mm麦芽糖溶液，各取300μl的12mmeps和20mm麦芽糖溶液置于50℃水浴锅中预热，加入100μl稀释后的酶液，精确反应10min后，立刻煮沸10min终止反应，加入30μl稀释后的粗酶液，精确反应75min，于沸水中煮沸10min，冷却，加入100μlα-葡萄糖苷酶和100μl去离子水，混匀，于60℃水浴锅反应60min以上，加入100μl1mna2co3溶液，混匀，最后于400nm测定吸光值。环糊精葡萄糖基转移酶催化歧化反应的活力定义为每分钟转化一微摩尔eps的酶量。(歧化活力测定方法参见vanderveenba,leemhuish,kraljs,etal.hydrophobicaminoacidresiduesintheacceptorbindingsitearemaindeterminantsforreactionmechanismandspecificityofcyclodextrin-glycosyltransferase[j].journalofbiologicalchemistry,2001,276(48):44557-44562)
实施例1：野生型环糊精葡萄糖基转移酶的表达
从实验室前期保藏的甘油管中，接种cgt/pet20b(+)/bl21(de3)(杨玉路,王蕾,陈晟,等.重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化[j].生物技术通报,2014,8:175-181.)于lb液体培养基(含100mg/l氨苄青霉素)生长8h，按5％接种量将种子液接入tb液体发酵培养基(含100mg/l氨苄青霉素)。大肠杆菌在25℃摇床培养发酵48h后，将一定体积发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取发酵上清，即为野生酶的粗酶液。
实施例2：环糊精葡萄糖基转移酶单突变体的制备及表达
(1)环糊精葡萄糖基转移酶的单突变制备
根据bacilluscirculans环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，分别设计并合成引入单突变的引物，对环糊精葡萄糖基转移酶基因cgt进行定点突变，分别测序确认环糊精葡萄糖基转移酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变环糊精葡萄糖基转移酶。
定点突变体编码基因的pcr扩增：利用快速pcr技术，以携带编码野生型环糊精葡萄糖基转移酶的基因的表达载体cgt/pet-20b(+)为模板。
引入v6d突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如seqidno.3所示的正向引物：
5’-ccggataccagcgatagcaacaagcag-3’(下划线为突变碱基)
核苷酸序列如seqidno.4所示的反向引物：
5’-ctgcttgttgctatcgctggtatccgg-3’(下划线为突变碱基)
引入s90g突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如seqidno.5所示的正向引物：
5’-ctatagcattatcaactacggcggtgtgaataatacgg-3’(下划线为突变碱基)
核苷酸序列如seqidno.6所示的反向引物：
5’-ccgtattattcacaccgccgtagttgataatgctatag-3’(下划线为突变碱基)
引入t168a突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如seqidno.7所示的正向引物：
5’-ctgggcggttatgccaatgacaccc-3’(下划线为突变碱基)
核苷酸序列如seqidno.8所示的反向引物：
5’-ctgggcggttatgccaatgacaccc-3’(下划线为突变碱基)
引入t171a突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如seqidno.9所示的正向引物：
5’-cggttataccaatgacgcccaaaatctgtttc-3’(下划线为突变碱基)
核苷酸序列如seqidno.10所示的反向引物：
5’-gaaacagattttgggcgtcattggtataaccg-3’(下划线为突变碱基)
引入t383a突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如seqidno.11所示的正向引物：
5’-ccaagttttagcgcgagcacgacgg-3’(下划线为突变碱基)
核苷酸序列如seqidno.12所示的反向引物：
5’-ccgtcgtgctcgcgctaaaacttgg-3’(下划线为突变碱基)
引入g608a突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如seqidno.13所示的正向引物：
5’-caaaatgtgtatctgacggccagcgtgagcgaactggg-3’(下划线为突变碱基)
核苷酸序列如seqidno.14所示的反向引物：
5’-cccagttcgctcacgctggccgtcagatacacattttg-3’(下划线为突变碱基)
pcr反应体系均为：20μm正向引物和反向引物各0.5μl，dntpsmix4μl，5×psbuffer10μl，2.5u/μl的primestar聚合酶0.5μl，模板0.5μl，加双蒸水补齐50μl。
pcr条件为：94℃预变性4min；随后进行25个循环(94℃10s，55℃5s，72℃7min50s)72℃延伸10min；最后4℃保温。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
将上述验证正确的pcr产物进行dpni消化，转入大肠杆菌jm109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/l氨苄青霉素的lb平板上，经37℃过夜培养，平板上挑取2个单菌落，接入lb液体培养基，8h后提取质粒并测序，结果正确。将测序正确的质粒转入大肠杆菌bl21(de3)得到表达单突变体的重组大肠杆菌。
(2)突变体的表达
将本实施例步骤(1)制备得到的表达单突变体的重组大肠杆菌分别接种于lb液体培养基(含100mg/l氨苄青霉素)，培养生长8h，按5％接种量将种子接入tb液体发酵培养基(含100mg/l氨苄青霉素)。大肠杆菌在25℃摇床培养发酵48h后，将一定体积发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取发酵上清，即为单突变体的粗酶液。
实施例3：环糊精葡萄糖基转移酶六突变体的制备及表达
(1)环糊精葡萄糖基转移酶的六突变制备
以实施例2构建的携带编码突变体v6d的基因的质粒作为六突变的模板，并根据实施例2设计的s90g、t168a、t383a、g608a定点突变的引物，使用快速pcr技术，对携带编码突变体v6d的基因的质粒进行定点突变，得到环糊精葡萄糖基转移酶v6d/s90g/t168a/t383a/g608a五突变体。之后，以v6d/s90g/t168a/t383a/g608a五突变体的质粒为模板，设计新的引物，引入t171a突变，构建环糊精葡萄糖基转移酶v6d/s90g/t168a/t171a/t383a/g608a六突变体。
引入t171a突变的定点突变引物变更为：
核苷酸序列如seqidno.15所示的正向引物：
5’-cggttatgccaatgacgcccaaaatctgtttc-3’(下划线为突变碱基)
核苷酸序列如seqidno.16所示的反向引物：
5’-gaaacagattttgggcgtcattggcataaccg-3’(下划线为突变碱基)
(2)突变体的表达
将本实施例步骤(1)制备得到的表达突变体的重组大肠杆菌分别接种于lb液体培养基(含100mg/l氨苄青霉素)，培养生长8h，按5％接种量将种子接入tb液体发酵培养基(含100mg/l氨苄青霉素)。大肠杆菌在25℃摇床培养发酵48h后，将一定体积发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取发酵上清，即为六突变体的粗酶液。
实施例4：环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力分析
将实施例1、实施例2和实施例3所得的发酵上清粗酶液分别进行歧化活力测定。野生型环糊精葡萄糖基转移酶(wt)和突变体瓶培养48h的od600nm及酶歧化活力列于表1，结果表明，所有突变体的酶歧化活力均高于野生型。突变体v6d、s90g、t168a、t171a、t383a、g608a和v6d/s90g/t168a/t171a/t383a/g608a的摇瓶发酵酶歧化活力分别为野生酶的1.89倍、1.21倍、1.21倍、1.22倍、1.32倍、2.03倍、3.16倍。
表1环糊精葡萄糖基转移酶的野生及突变体酶的摇瓶od600nm和酶歧化活力
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体t171a及其应用
<160>16
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>2061
<212>dna
<213>bacilluscirculans251
<400>1
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