一种多功能寡营养纤维素降解菌复配菌剂及其应用的制作方法

本发明涉及一种多功能寡营养纤维素降解菌复配菌剂及其应用，具体涉及多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10的复配菌剂及其应用，属于农产品加工及微生物腐熟剂制备领域。

背景技术：

近年来，农业迅速发展，在自然环境中秸秆含量巨大，全球每年产生大量干秸秆约7.4×10⁷吨。秸秆中主要成分为纤维素，自然条件下纤维素不易被降解。但是被利用的秸秆资源只占少量，大批秸秆直接被焚烧，严重造成了资源浪费与环境污染。秸秆焚烧对人类生活存有极大影响，导致局部大气环境恶化，造成雾霾及酸雨等恶劣影响，诱发呼吸系统疾病，影响车辆行驶安全与飞机正常起降，诱发交通事故，引发高压线路及通讯线路损坏且易诱发火灾。秸秆来自农作物，含有磷、钾等多种作物生长所必需的微量元素。目前，使纤维素快速降解的方法主要有酸水解、酶水解和微生物降解，酶水解与微生物降解都与高效纤维素降解菌有极大关系。酶水解方式与微生物降解方式优点为反应条件温和、无多余副产物和污染小等。但是酶水解方法所存在的缺点为纤维素酶活力偏低、成本较高等，导致更充分的利用纤维素较困难。筛选出优质纤维素降解菌成为降解纤维素可以有效进行的重要途径。

纤维素降解菌可加速秸秆降解，使秸秆资源得以较充分利用，减少秸秆焚烧所造成的不良影响。目前筛选纤维素降解菌所使用传统培养基营养成分丰富所筛选出来的纤维素降解菌无法在酶的活化剂和营养素匮乏的自然环境中应用时发挥其降解纤维素的最大能力，在降解纤维素时放出大量的热，使纤维素降解菌周围温度升高，具耐高温功能的菌株可提高腐熟过程最高温，杀死农作物的致病菌。且我国土壤以盐碱地为主，耐盐碱的菌株更有利于纤维素的降解。秸秆中有丰富的磷元素与钾元素且农作物正常生长需要磷元素与钾元素，解磷解钾功能可使磷元素与钾元素更有效的被农作物利用。现有腐熟剂功能单一且不具耐高温耐盐碱解磷解钾多功能，导致纤维素降解不彻底，降解纤维素所得磷元素与钾元素无法被农作物利用。为农作物补充磷元素与钾元素的常规方法是施加磷肥与钾肥，直接导致水质富营养化与土壤理化性质恶化。因此，研制出具有耐高温耐盐碱解磷解钾多功能，并且在寡营养的自然环境中也可正常发挥其各项功能的腐熟剂对解决上述问题具有重要意义。

技术实现要素：

本发明针对上述问题，提供了一种多功能寡营养纤维素降解菌复配菌剂及其应用，具体涉及多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10的复配菌剂及其应用。本发明复配菌剂对纤维素具有很强的降解功能。

多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13489，保藏日期为2016年12月23日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

多功能寡营养纤维素降解菌链霉菌lzh-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13486，保藏日期为2016年12月23日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明还包括多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10的复配菌剂在制备微生物腐熟剂中的应用。

本发明微生物腐熟剂的制备方法，步骤如下：

(1)固体发酵培养基的制备：

mgso40.25g；k2hpo40.5g；nacl5g；秸秆粉粒100g，加入去离子水30％～40％，搅拌混合均匀,灭菌温度121℃30min。

(2)种子液的制备：

解淀粉芽孢杆菌lzh-x14种子液：菌种斜面保藏管中取一环解淀粉芽孢杆菌lzh-x14菌株的菌胎接种于10ml液体lb培养基中，30℃180rpm摇床培养24h。将活化好的菌种按1％的接种量接种至液体lb培养基摇瓶中，30℃180rpm摇床培养24h；所得即为解淀粉芽孢杆菌lzh-x14种子液。

链霉菌lzh-10种子液：菌种斜面保藏管中取一环链霉菌lzh-10菌株的菌胎接种于10ml液体高氏一号培养基中，30℃180rpm摇床培养24h。将活化好的菌种按1％的接种量接种至液体高氏一号培养基摇瓶中，30℃180rpm摇床培养24h；所得即为链霉菌lzh-10种子液。

(3)复配微生物腐熟剂的制备：

将步骤(2)获得的解淀粉芽孢杆菌lzh-x14发酵液和链霉菌lzh-10发酵液按体积比3:1的比例混合即得复配种子液；复配种子液以4％(v/v)的接种量接种至已灭菌的固体发酵培养基中混合均匀，装入发酵瓶中，环境温度维持在27℃-30℃，物料高度为发酵瓶的1/3-1/2，湿度维持在60％-70％；发酵7d-10d，待菌含量不低于50亿cfu/g时即可；风干至含水量大约30％时可包装贮存，即为耐高温耐盐碱解磷解钾的多功能寡营养复配微生物腐熟剂。

本发明还包括多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10的复配菌剂在降解纤维素方面中的应用。

本发明还包括多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10的复配菌剂在防治根腐病方面中的应用。

本发明还包括多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10的复配菌剂在制备防治根腐病药物中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10对纤维素具有很强的降解功能；

(2)多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10具有拮抗根腐病病原菌的作用，能够防治根腐病；

(3)多功能寡营养纤维素降解菌复配菌剂具有耐高温耐盐碱解磷解钾多功能，可更充分的降解秸秆，并充分利用秸秆降解所得磷元素与钾元素，在寡营养的自然环境中也可正常发挥各项功能；

(4)本发明微生物腐熟剂可有效腐熟秸秆充分利用秸秆资源。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10的十字交叉拮抗实验结果图；其中，a为链霉菌lzh-10，b为解淀粉芽孢杆菌lzh-x14；

图2为解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10对串珠镰刀菌的拮抗效果图；其中，图a为解淀粉芽孢杆菌lzh-x14与串珠镰刀菌对峙培养试验，图b为链霉菌lzh-10与串珠镰刀菌对峙培养试验，图c为对照串珠镰刀菌生长情况；

图3为堆肥过程中秸秆堆温变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实例1：

实施例1菌株lzh-x14和lzh-10的筛选及鉴定

菌株lzh-x14和lzh-10是两株从山东省德州市大田中分别分离得到的具有高效降解纤维素功能且具有耐高温耐盐碱解磷解钾多功能的寡营养菌株。

(1)纤维素降解菌初筛

使用稀释涂布法将稀释液涂布至寡营养细菌筛选培养基(蛋白胨1g；酵母提取物0.5g；nacl1g；琼脂20g，溶解于去离子水1000ml。灭菌121℃30min。)将所得菌落使用挑菌环挑取并接种于寡营养纤维素刚果红培养基(羧甲基纤维素钠1.88g；刚果红0.25g；mgso40.025g；k2hpo40.05g；琼脂20g混匀，溶解于去离子水1000ml。灭菌121℃30min。)，选取可在使此培养基上产生透明圈的菌落使用三区划线法纯化菌种。

(2)筛选耐高温耐盐碱菌株

将上述所得菌株接种至lb液体培养基(蛋白胨10g；酵母提取物5g；nacl5g；去离子水1000ml，灭菌121℃30min。)中，培养12h后将菌液在60℃的条件下水浴加热60分钟，冷却后涂布至改良lb平板培养基(蛋白胨10g；酵母提取物5g；nacl40g；琼脂20g溶解于去离子水1000ml，添加na2co3调节培养基的ph值至8～9，灭菌121℃30min。)上。挑取长势良好菌株即为耐高温耐盐碱菌株。

(3)筛选解磷菌株

将上述所得菌株在nbrip培养基(葡萄糖10g；mgcl2·6h2o5.0g；mgso4·7h2o0.25g；kcl0.2g；(nh4)2so40.1g；ca3(po4)25.0g；加蒸馏水至1000ml，ph7.0，灭菌115℃15min)上接种，选取在培养基上可产生溶磷圈的菌株，将所得菌种接种于解有机磷固体培养基(葡萄糖10g；(nh4)2so40.5g；nacl0.3g；kcl0.2g；feso4·7h2o0.03g；mnso4·h2o0.03g；蛋黄液10ml；琼脂20g；去离子水1000ml，ph6.0-6.5，115℃下灭菌30min)，选取可产生溶磷圈的菌株。

(4)筛选解钾菌株

将上述所得菌株在亚历山鲍罗夫培养基(蔗糖5.0g；na2hpo42.0g；mgso4·7h2o0.5g；fecl35.0mg；caco30.1g；琼脂20.0g；钾长石粉1.0g(使用去离子水清洗5次)；ph7.0；去离子水1000ml。灭菌121℃30min。)上接种，选取大型、透明凸起很高、且粘着有弹性的菌株；所得即为耐高温耐盐碱解磷解钾功能的多功能寡营养纤维素降解菌。

发明人经过大量筛选试验分别筛选出解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10。

解淀粉芽孢杆菌lzh-x14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13489，保藏日期为2016年12月23日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌种的16srrna基因在genbank中的登录号是ky049891。

通过形态观察、染色、16srrna基因序列分析等方法对菌株lzh-x14进行鉴定，结果为：菌株lzh-x14为革兰氏阳性菌，在lb固体平板上为乳白色圆形菌落，菌落扁平，边缘齿状，表面湿润而易挑取。经16srrna基因序列分析和同源性比较，其与genbank中某解淀粉芽孢杆菌菌株(genbank登录号ku179334.1)有99％的同源性，故鉴定为解淀粉芽孢杆菌属，命名为解淀粉芽孢杆菌lzh-x14。

链霉菌lzh-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13486，保藏日期为2016年12月23日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌种的16srrna基因在genbank中的登录号是kx865135。

通过形态观察、染色、16srrna基因序列分析等方法对菌株lzh-10进行鉴定，结果为：菌株lzh-10为革兰氏阳性菌，在高氏一号固体平板上菌落扁平，质地疏松干燥，产生大量的灰色菌丝。经16srrna基因序列分析和同源性比较，其与genbank中某链霉菌(genbank登录号kp893387.1)有99％的同源性，故鉴定为链霉菌，命名为链霉菌lzh-10。

实施例2本发明中解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10的拮抗作用

将菌株解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10按照十字交叉的方式接种于高氏一号固体培养基上，30℃培养24h。若存在抑菌带说明两株菌具有拮抗作用，若两株菌出现交叉生长，则两株菌没有拮抗作用。图1显示解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10无相互拮抗作用，可用于制备复合菌剂。

采用平板对峙法检测解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10的拮抗作用，将病原菌串珠镰刀菌接种到pda固体培养基上(去皮的马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然ph)，30℃培养48h后备用。将菌株lzh-x14接种到lb固体培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph＝7.4-7.6)上30℃培养48h后接种到病原菌两侧，30℃继续培养48-72h，观察是否产生抑菌带。结果表明本发明菌株lzh-x14和链霉菌lzh-10对于根腐病病原菌串珠镰刀菌(fusariummoniliformesheld)具有很强的拮抗作用，如图2所示。

实施例3纤维素降解菌酶活测定

使用dns法测纤维素酶酶活，选取酶活力较大的菌株。

实验方法：dns法测纤维素酶酶活：使用接菌环将所得菌株接菌至通用液体培养基120r/min培养12～24h，至菌液浑浊，4000r/min离心10min取上清液为粗酶液，取酶液1.0ml放入15ml试管中加入37℃放置30min的羧甲基纤维素钠溶液震荡均匀后在45℃水浴锅中反应30min，准确加入3.0mldns试剂，沸水煮7min冲水冷却，振荡均匀后使用722分光光度计在540nm波长下比色，记录吸光度对照标准曲线，计算酶活，选取酶活力较大的菌株为优质寡营养纤维素降解菌。结果显示菌株lzh-x14和lzh-10的纤维素酶酶活可达15.967u/ml和13.283u/ml，表明本发明解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10具有较高的降解纤维素能力。

实施例4一种微生物腐熟剂及其制备方法

微生物腐熟剂的制备步骤如下：

一种微生物腐熟剂，包括多功能寡营养纤维素降解菌解淀粉芽孢杆菌lzh-x14和链霉菌lzh-10复配菌剂。

本发明微生物腐熟剂的制备方法，步骤如下：

(1)固体发酵培养基的制备：

mgso40.25g；k2hpo40.5g；nacl5g；秸秆粉粒100g，加入去离子水30％～40％，搅拌混合均匀,灭菌温度121℃30min。

(2)种子液的制备：

解淀粉芽孢杆菌lzh-x14种子液：菌种斜面保藏管中取一环解淀粉芽孢杆菌lzh-x14菌株的菌胎接种于10ml液体lb培养基中，30℃180rpm摇床培养24h。将活化好的菌种按1％的接种量接种至液体lb培养基摇瓶中，30℃180rpm摇床培养24h。所得即为解淀粉芽孢杆菌lzh-x14种子液。

链霉菌lzh-10种子液：菌种斜面保藏管中取一环链霉菌lzh-10菌株的菌胎接种于10ml液体高氏一号培养基中，30℃180rpm摇床培养24h。将活化好的菌种按1％的接种量接种至液体高氏一号培养基摇瓶中，30℃180rpm摇床培养24h。所得即为链霉菌lzh-10种子液。

(3)复配微生物腐熟剂的制备：

将解淀粉芽孢杆菌lzh-x14发酵液和链霉菌lzh-10发酵液按体积比3:1的比例混合即得复配种子液。复配种子液以4％(v/v)的接种量接种至已灭菌的固体发酵培养基中混合均匀,装入发酵瓶中，环境温度维持在27℃-30℃，物料高度为发酵瓶的1/3-1/2，湿度维持在60％-70％。发酵7d-10d，待菌含量不低于50亿cfu/g时即可。风干至含水量大约30％时可包装贮存，即为耐高温耐盐碱解磷解钾的多功能寡营养复配微生物腐熟剂。

实施例5复配微生物腐熟剂应用效果检测

秸秆的处理方法：将秸秆剪成长7cm左右后使用去离子水浸泡一昼夜，目的是使秸秆中的速效碳与速效氮溶于水中并且同时调节秸秆的含水量。将处理好的秸秆置于发酵箱中，加入1.25％的尿素调节c/n为30:1左右，按5％(质量分数)加入复配多功能寡营养腐熟剂，以不加入秸秆腐熟剂的发酵箱作为对照组，搅拌均匀，每天观察并记录秸秆颜色、拉力、堆温和气味等变化情况，每2d翻堆一次。直至实验组发酵箱内的秸秆变成深褐色。取出10g腐熟后的秸秆，加入10倍体积的去离子水，振荡半小时后得到深黄色浸出液，测其ph值为7左右且并无刺鼻味道，认为已腐熟完成即秸秆有机肥。结果如表1所示。

表1秸秆颜色变化

由表1可以看出，秸秆堆肥开始前为黄色，随着腐熟过程的进行，10天后，复配菌剂发酵箱内秸秆变的松软，且颜色为深褐色，到第12天时完全变黑，秸秆腐熟基本彻底。由图3可以看出，腐熟过程中实验组与对照组总体温度呈先上升后下降的趋势。腐熟初期实验组比对照组温度上升迅速。实验组翻堆一次后温度上升减缓，在第10d到达最高温75℃，其后温度有下降趋势，翻堆五次后，实验组温度下降。对照组于第15d到达最高温57℃。总体来说，加入多功能寡营养腐熟剂处理的实验组比对照组高温期出现早且持续时间长。总之，复配微生物腐熟剂可以加快纤维素的降解。