本发明涉及生物技术领域中一株植物乳杆菌及其制备方法。
背景技术：
近年来，抗生素在人和动物中的普遍使用甚至是滥用所带来的弊端日益彰显。长期使用抗生素会使人和动物肠道内的正常菌群失调，影响机体免疫功能的形成，甚至因长期滥用抗生素产生了具有多重抗药性的“超级细菌”。因此，寻找抗生素的替代品成为人类未来生存和发展的紧迫任务。
植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)是目前已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌。植物乳杆菌对肠黏膜具有很强的黏附能力和优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人体肠道中定植并繁殖，可改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患肠道疾病；植物乳杆菌能够产生一种被称为“植物乳杆菌素”的多肽类广谱抗菌物质，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，有助于其在动物胃肠道内的定植。植物乳杆菌作为益生菌制剂可显著增加肠黏膜iga的含量，提高机体免疫力从而维护肠道生态平衡，促进动物健康。植物乳杆菌作为国际上公认的新型益生乳酸菌，具有很高的理论研究和生产应用价值。但是，植物乳杆菌不能形成具有强抗逆性的休眠体，如芽孢，温度耐受性较差，这也大大限制了其在饲料加工中的应用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何制备能够产酸，又兼具芽孢菌的产酶和抗逆性、耐高温性的植物乳杆菌。
为解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一株植物乳杆菌，所述植物乳杆菌是植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)sg-03，其在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为gdmccno：61035。该菌株已于2020年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)，保藏地址为广州市先烈中路100号大楼59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编510070。下文简称植物乳杆菌sg-03。
植物乳杆菌sg-03菌体形状为短杆状，菌体平均大小为0.9-1.2μm×4.0-9.0μm，革兰氏染色为阳性，不产芽孢，无鞭毛，但能运动，无荧光特性。植物乳杆菌sg-03在mrs培养基上菌落呈乳白色，粘稠，表面光滑，平板上常显示为不透明的圆形凸起。能够发酵戊糖或葡萄糖酸盐，产酸不产气。通常不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。植物乳杆菌sg-03的生长温度范围在15-45℃，最适宜生长温度为30-35℃，生长ph值在3.5-8.5，最适宜ph值为4.5-6.5。植物乳杆菌sg-03具有序列表中序列1所示的16srdna。
本发明的另一个目的是提供制备上述植物乳杆菌的方法，其为以植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)和地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)为亲本菌株，通过灭活的双亲原生质体融合，并针对产酸、抑菌和耐高温性进行筛选，获得融合菌株。
本发明制备融合菌株的方法，具体包含如下步骤：
s1、培养植物乳杆菌获得植物乳杆菌菌悬液，将植物乳杆菌菌悬液酶解破壁得到植物乳杆菌原生质体悬液，灭活植物乳杆菌原生质体悬液得到灭活的植物乳杆菌原生质体悬液；培养地衣芽孢杆菌获得地衣芽孢杆菌悬液，将地衣芽孢杆菌悬液酶解破壁得到地衣芽孢杆菌原生质体悬液，灭活地衣芽孢杆菌原生质体悬液得到灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液；
s2、以聚乙二醇(peg)配制促融剂，将灭活的植物乳杆菌原生质体悬液和灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液融合、再生，获得融合子；
s3、按照能够产生乳酸，能够代谢酪蛋白，具备抑制部分革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的能力，同时能够耐高温的标准筛选融合子，获得融合菌株。
上述方法中，所述植物乳杆菌菌悬液酶解破壁采用溶菌酶和蜗牛酶。
上述方法中，所述灭活植物乳杆菌原生质体悬液可为60℃热灭活15min。
上述方法中，所述地衣芽孢杆菌悬液酶解破壁采用溶菌酶和溶壁酶。
上述方法中，所述灭活地衣芽孢杆菌原生质体悬液采用功率为30w的紫外照射120s。
上述方法中，所述灭活的植物乳杆菌原生质体悬液，灭活前植物乳杆菌原生质体浓度达到2.0×107个/ml；所述灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液，灭活前地衣芽孢杆菌原生质体浓度达到1.1×108个/ml。
上述方法中，所述促融剂的配制方法如下：向smm高渗溶液中加入聚乙二醇(peg-6000)，使其质量百分含量为40％，得到促融剂；所述smm高渗溶液的配制方法如下：向蒸馏水中加入蔗糖、mgcl2·6h2o和顺丁烯二酸，使它们的含量分别为蔗糖0.5mol/l、mgcl2·6h2o0.02mol/l、顺丁烯二酸0.02mol/l，调整ph值为7.0，121℃灭菌22min，得到smm高渗溶液，4℃保存备用。
上述方法中，所述植物乳杆菌可为植物乳杆菌cicc20265；所述地衣芽孢杆菌可为地衣芽孢杆菌cicc10092。
原生质体融合是一项十分有用的育种技术，与其他育种技术相比具有以下优点：
(1)能克服有性杂交的不亲和性,冲破种属的界限，而达到种间、属间乃至界间的融合，实现远缘杂交；(2)重组频率高、受结合型或致育型限制小，以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制；(3)避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求比基因工程简单，投资少；(4)去除了细胞壁的阻碍，两亲株融合后整套基因组相互接触，从而构建集双亲优良遗传性状于一体的融合子。植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌都是对动物肠道健康有益的益生菌，将此两种菌进行融合，可实现融合子既具备了地衣芽孢杆菌较强的产蛋白酶、产淀粉酶能力以及形成芽孢可耐高温的能力，也具有了乳酸菌耐受胃部的低酸环境以及肠道前段高胆盐环境的能力，肠道定殖能力大大增强，同时还能够克服其不易培养和制剂化的缺陷，融合子在厌氧和有氧环境中都能很好生长，并具有高抗逆性的能力。开展植物乳杆菌与地衣芽孢杆菌的融合选育研究，以获得兼具两亲本菌株优良性状的融合菌株，实现一菌多效，是获得乳酸菌和芽孢菌优势互补的一个全新课题，具有极高的现实意义与应用价值。
本发明的植物乳杆菌原生质体悬液和地衣芽孢杆菌原生质体在融合前通过紫外或加热方式灭活，主要是为了便于后续融合子的筛选。原生质体融合目的是将双亲的遗传物质进行转化和互补，从而获得兼具双亲优良性状的新菌株，而灭活的亲本可大大减少后续融合子筛选的干扰，同时又能定向筛选双亲互补的“真实”融合子。根据亲本菌株植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌的生理特点，经热灭活的植物乳杆菌原生质体与经紫外灭活的地衣芽孢杆菌生质体进行融合，在双亲原生质体融合过程中，两个菌株的遗传物质发生了不同程度的变化，某些遗传物质在基因重组后在融合株中表达出来，使得两个亲本菌株能够在一定程度上的实现互补，达到融合子筛选的目的。
实验证明，本发明制备融合菌株的方法可制备得到能够产酸，又兼具芽孢菌的产酶和抗逆性、耐高温性的融合菌株。以本发明的方法制备得到的植物乳杆菌sg-03，乳酸产量较高，且具有较好的抑菌活性，能耐高温，有较好的可加工性，对人、畜安全，没有环境污染问题，培养条件简单，容易保存适合开发应用。植物乳杆菌sg-03发酵后高温喷雾干燥所制备的活菌剂产品可以促进肉鸡生长，提高肉鸡的产能。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：植物乳杆菌
生物材料的拉丁文学名：lactobacillusplantarum
生物材料的菌株编号：sg-03
保藏单位全称：广东省微生物菌种保藏中心
保藏单位简称：gdmcc
地址：广州市先烈中路100号大楼59号楼5楼广东省微生物研究所；邮编：510070
保藏日期：2020年5月27日
保藏编号：gdmccno：61035
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的定量试验，若无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
1、菌株
下述实施例中的植物乳杆菌(lactobacilusplantarum)cicc20265已于2006年03月31日收藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(chinacenterofindustrialculturecollection，简称cicc)，自该收藏日起公众可从cicc获得该菌株。以下简称植物乳杆菌cicc20265。
下述实施例中的地衣芽胞杆菌(bacilluslicheniformis)cicc10092已于1979年08月08日收藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(chinacenterofindustrialculturecollection，简称cicc)，自该收藏日起公众可从cicc获得该菌株。以下简称地衣芽孢杆菌cicc10092。
2、酶
下述实施例中，溶菌酶、蜗牛酶均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。
下述实施例中，溶壁酶为广东省微生物研究所产品。
3、培养基和试剂
下述实施例中，mrs琼脂培养基、mrs肉汤培养基均为广东环凯生物科技有限公司产品。
下述实施例中，含有甘氨酸浓度为10g/l的mrs肉汤培养基为向mrs肉汤培养基中加入甘氨酸得到的液体培养基；该液体培养基中甘氨酸浓度为10g/l。
下述实施例中，含有碳酸钙的mrs琼脂培养基为向mrs琼脂培养基中加入碳酸钙，得到的固体培养基；该固体培养基中碳酸钙浓度为3.0％(w/v)。
下述实施例中，dy固体培养基的配制方法如下：向1000ml自来水中加入酵母膏20g、氯化钠5g、葡萄糖5g、琼脂15-20g，调ph值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌22min，获得的固体培养基。
下述实施例中，dy液体培养基的配制方法如下：向1000ml自来水中加入酵母膏20g、氯化钠5g、葡萄糖5g，调ph值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌22min，获得的固体培养基。
下述实施例中，含有甘氨酸浓度为10g/l的dy液体培养基为向dy液体培养基中加入甘氨酸得到的液体培养基；该液体培养基中甘氨酸浓度为10g/l。
下述实施例中，融合子再生培养基rm的配制方法如下：向蒸馏水中加入葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、吐温80、乙酸钠、k2hpo4、mgso4、mnso4、蔗糖、mgcl2·6h2o和顺丁烯二酸，使它们的浓度分别为葡萄糖20g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母膏5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、吐温801ml/l、乙酸钠5g/l、k2hpo42g/l、mgso40.6g/l、mnso40.25g/l、蔗糖171g/l、mgcl2·6h2o4.066g/l、顺丁烯二酸2.32g/l，121℃高压灭菌20min，获得融合子再生培养基rm。
下述实施例中，种子培养基的配制方法如下：向蒸馏水中加入玉米浆、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、硫酸铵、轻质碳酸钙、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和豆油，使它们的质量体积百分含量(g/100ml)分别为玉米浆3.0％、葡萄糖1.0％、酵母膏1％、蛋白胨1％、乙酸钠0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、硫酸铵0.1％、轻质碳酸钙0.6％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.005％、吐温800.1％、豆油0.1％，调ph值为6.0-6.5，121℃高压灭菌20min，得到种子培养基。
下述实施例中，液体发酵培养基的配制方法如下：向自来水中加入黄豆饼粉、玉米淀粉、蔗糖、玉米浆、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、柠檬酸氢二铵、吐温80、乙酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸锰、琼脂粉，添加的质量体积百分含量(g/100ml)为黄豆饼粉3％、玉米淀粉2％、蔗糖2％、玉米浆2.0％、葡萄糖0.5％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、吐温800.1％、乙酸钠0.5％、硫酸铵0.2％、硫酸镁0.01％、硫酸锰0.01％，余量为自来水。
下述实施例中，lb固体培养基(货号l1015)为北京索莱宝科技有限公司产品。
下述实施例中，smm高渗溶液的配制方法如下：向蒸馏水中加入蔗糖、mgcl2·6h2o和顺丁烯二酸，使它们的含量分别为蔗糖0.5mol/l、mgcl2·6h2o0.02mol/l、顺丁烯二酸0.02mol/l，调整ph值为7.0，121℃灭菌22min，得到smm高渗溶液，4℃保存备用。
下述实施例中，促融剂的配制方法如下：向smm高渗溶液中加入聚乙二醇(peg-6000)，使其质量百分含量为40％，得到促融剂。
下述实施例中，恩拉霉素具体为4％的恩拉霉素预混剂，为杭州金越动物保健品有限公司产品。
实施例1、新型耐高温乳酸菌——植物乳杆菌sg-03的选育
一、植物乳杆菌原生质体悬液的制备
1、制备植物乳杆菌的活化及菌悬液
本实施例所用的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)为植物乳杆菌cicc20265，购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
将植物乳杆菌cicc20265的甘油菌接种至含有mrs琼脂培养基的斜面(18×180mm试管斜面)，在30℃条件下培养24h，此为f1代斜面，然后从f1代斜面中取一环至新鲜的空斜面，继续30℃培养16h，即得到活化的植物乳杆菌cicc20265菌株。
然后，用无菌水将活化斜面中的菌体洗下制备菌悬液，菌落数控制在106cfu/ml。将菌悬液按2％(v/v)的接种量接种于含有甘氨酸浓度为10g/l的mrs肉汤培养基中，250ml三角瓶内装液量为50ml，以30℃，200r/min在恒温振荡器培养12h，获得对数期细胞培养液，8000rpm离心10min，收集菌体。
接着，采用smm高渗溶液对上述离心获得的菌体洗涤两遍，去上清，并最终取10ml的smm溶液重悬细胞，至此，获得植物乳杆菌cicc20265菌悬液，植物乳杆菌cicc20265菌落数约为107cfu/ml。
2、酶解破壁制备植物乳杆菌原生质体悬液
采用溶菌酶和蜗牛酶进行组合消化，在步骤1获得的植物乳杆菌cicc20265菌悬液中分别加入过滤除菌后的酶的母液，制备含有酶的菌悬液，其中溶菌酶最佳使用浓度为0.7％(w/v)，蜗牛酶最佳使用浓度为0.5％(w/v)。将含有酶的菌悬液置于摇床，80r/min酶解，每隔10min镜检一次，观察原生质体形成情况，最佳酶解温度为30℃；最佳酶解时间为1.5h；最佳酶解ph值为6.5。当90％左右的细胞转化为原生质体时，3000rpm离心收集细胞，用smm高渗溶液洗涤离心两次，用5ml的smm高渗溶液重悬，制得植物乳杆菌原生质体悬液，植物乳杆菌原生质体浓度达到2.0×107个/ml，原生质体形成率达到91.3％。
3、灭活植物乳杆菌原生质体悬液
取步骤2获得的植物乳杆菌原生质体悬液进行60℃热灭活处理，时间分别设置为5min、10min、15min和20min，每隔5min轻轻振荡1次，使原生质体受热均匀，处理完毕后分别涂布再生平板(以融合子再生培养基rm制作的平板)，30℃培养72h，计算活菌数。结果显示，热灭活15min，灭活率达到100％，达到亲本灭活的需要。
采用60℃热灭活15min的条件灭活，获得灭活的植物乳杆菌原生质体悬液。
二、地衣芽孢杆菌原生质体悬液的制备
1、制备地衣芽孢杆菌的活化及菌悬液
本实施例所用的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)为地衣芽孢杆菌cicc10092，购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
将地衣芽孢杆菌cicc10092的甘油菌接种至dy固体培养基制作的18×180mm试管斜面，在30℃条件下传代两次进行活化，每代培养24h，然后用无菌水将活化斜面中的菌体洗下，活菌数108cfu/ml。按2％的接种量接种于含有甘氨酸浓度为10g/l的dy液体培养基中，250ml三角瓶内装液量为50ml，以30℃，200r/min在恒温振荡器培养6h后，加入氨苄青霉素使其终浓度为5u/ml，继续振荡培养2h，获得对数生长期培养液，8000rpm离心10min，然后以smm高渗溶液洗涤两次，最后重悬于10ml的smm高渗溶液中，获得地衣芽孢杆菌cicc10092菌悬液，菌落数为108cfu/ml。
2、酶解破壁制备地衣芽孢杆菌原生质体悬液
采用溶菌酶和溶壁酶进行组合消化，在步骤1获得的地衣芽孢杆菌cicc10092菌悬液中分别加入过滤除菌后的酶的母液，制备含有酶的菌悬液，其中溶菌酶最佳酶解浓度为1.0％，溶壁酶最佳酶解浓度为0.3％；最佳酶解温度为30℃；最佳酶解时间为1.5h；最佳酶解ph为7.0。将含有酶的菌悬液置于摇床，80r/min酶解，每隔10min镜检一次，观察原生质体形成情况，当90％左右的细胞转化为原生质体时，3000rpm离心收集细胞，用smm高渗溶液洗涤离心两次，用5ml的smm高渗溶液重悬，制得地衣芽孢杆菌原生质体悬液，最终地衣芽孢杆菌原生质体浓度达到1.1×108个/ml，原生质体形成率达到93.7％。
3、灭活地衣芽孢杆菌原生质体悬液
取步骤2获得的地衣芽孢杆菌原生质体悬液进行紫外灭活：采用功率为30w的紫外灯，照射距离为20cm，在避免白光干扰的环境中进行紫外照射灭活，分别垂直照射30s、60s、90s、120s和150s，处理结束后，分别涂布再生平板，避光培养至72h，计算活菌数。结果显示，紫外照射120s，地衣芽孢杆菌cicc20265灭活率达到100％，达到亲本灭活的需要。
采用紫外照射120s的条件灭活，获得灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液。
三、灭活双亲的细胞融合
取步骤一中灭活的植物乳杆菌原生质体悬液和步骤二中灭活的地衣芽孢杆菌原生质体悬液各3ml，混合，3000r/min离心15min，加入3ml促融剂重悬，置于35℃水浴保温融合30min。
在细胞融合结束之后，2500r/min离心15min，弃上清液，再用smm高渗溶液洗涤离心三次，去除聚乙二醇。将得到的原生质体沉淀用smm高渗溶液稀释至105个/ml浓度，取其稀释液涂布于融合子再生培养基rm上，置于30℃恒温培养箱中，避光培养至长出再生融合单菌落。获得的再生融合单菌落共计1652个，每个单菌落作为一个融合子。
四、融合子的筛选
1、一次初筛
将上述步骤三获得的1652个融合子分别点值于含有碳酸钙的mrs琼脂培养基中，30℃培养48h，根据融合子是否具备产酸能力进行一轮次的初筛，选择具有明显透明圈的单菌落，共获得190株，即选择得到190个融合子。
2、二次筛选
将一次初筛具备产酸能力的融合子190个进行96孔板(孔径6.0mm)发酵培养二次筛选，培养基为mrs肉汤培养基，培养条件为:初始ph值为6.5，30℃，220r/min，发酵48h。发酵结束后，进行如下检测：
2.1、分别以植物乳杆菌cicc20265和地衣芽孢杆菌cicc10092为对照菌株，检测不同融合子发酵产酸能力，发酵液乳酸含量测定采用生物传感分析仪sba-40(济南拜尔森瑟生物技术有限公司产品)。
2.2、采用琼脂扩散法分别检测各个融合子发酵液对革兰氏阳性菌(检菌为金黄色葡萄球菌atcc25923)及革兰氏阴性菌(检菌为大肠杆菌atcc25922)的抑菌活性，具体方法如下：
1)革兰氏阳性菌抑菌活性测定：使用lb固体培养基，加热后放置室温冷却至45-55℃，加入适量金黄色葡萄球菌atcc25923，混匀后倒平板，用直径6.0mm无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50ul不同融合子的发酵液分别加入点样孔中点样，放入4℃冷藏吸收2h后于30℃培养箱中培养24h，取出平板测量不同融合子的抑菌圈直径。
2)革兰氏阴性菌抑菌活性测定：使用lb固体培养基，加热后放置室温冷却至45-55℃，加入适量大肠杆菌atcc25922，混匀后倒平板，用直径6.0mm无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50ul不同融合子的发酵液分别加入点样孔中点样，放入4℃冷藏吸收2h后于30℃培养箱中培养24h，取出平板测量不同融合子的抑菌圈直径。
2.3、检测不同融合子酪蛋白水解圈，测定方法如下：酪素1％，琼脂粉1.5％，121℃灭菌20min，冷却后倒平板，用直径6.0mm无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50ul不然融合子的发酵液分别加入点样孔中点样，放入4℃冷藏吸收2h后于30℃培养箱中培养24h，取出平板测量不同融合子的酪蛋白水解圈直径。
2.4、根据步骤2.1、2.2、2.3的检测结果评估不同融合子的产酸、抑菌和水解酪蛋白性能，部分融合子的测定结果见表1，据此选出具备较好产酸和抑菌活性能力的菌株4株：sg-03、sg116、sg169和sg333。
表1.不同融合子96孔板发酵结果(部分)
3、摇瓶复筛
将步骤2选出的具备较好产酸和抑菌活性能力的4株菌株(sg-03、sg116、sg169和sg333)进行摇瓶发酵复筛，所用的培养基为液体发酵培养基；250ml摇瓶装液量为50ml，30℃发酵48h。发酵结束，8000r/min离心收集发酵上清液。
测定上清液对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的抑菌活性以及乳酸含量，测定方法同步骤2，实验重复3次。试验数据采用spss13.0统计软件进行单因素方差分析，结合邓肯氏多重比较分析。p＜0.01为差异极显著，p＜0.05为差异显著，p＞0.05为差异不显著，结果用平均数±标准差(mean±sd)表示。
测定结果见表2。
表2.摇瓶发酵复筛验证
结果显示，sg-03菌株无论是在乳酸的代谢方面还是抑菌活性和蛋白酶的代谢活性方面较其它融合子要好。sg-03融合子的乳酸含量较sg116、sg169以及sg333融合子分别要高6.7％(p＜0.05)、17.3％(p＜0.01)和14.5％(p＜0.01)，差异均达到显著水平；在抑菌活性方面也差异显著，分别较sg116(g-，35.1％，p＜0.05；g+，17.1％，p＜0.05)、sg169(g-，42.9％，p＜0.05；g+，11.4％，p＜0.05)以及sg333(g-，22.0％，p＜0.05；g+，22.5％，p＜0.05)都要好；在酪蛋白水解能力方面也同样较其它融合子要好，但差异不显著(p＞0.05)。
与出发菌株相比，sg-03菌株的g+抑菌活性较两株母本都要好，较cicc20265亲本提高76.2％(p＜0.01)，差异极显著，较cicc20265亲本提高12.1％(p＞0.05)，但差异不显著；在乳酸与蛋白酶的代谢能力方面，sg-03融合子也展现了较好的亲本融合特性，融合了亲本的优良特征。
同时，对上述收集的发酵上清液进行60℃、80℃和沸水浴处理10min，以未处理的发酵上清液为对照，检测活菌数，考察融合菌株的耐高温能力，检测方法为：吸取1ml发酵液经10倍系列稀释至104倍，分别取不同温度处理的菌液0.1ml涂布mrs琼脂平板(以mrs琼脂培养基制作的平板)，30℃恒温箱中培养48h，计算平板上的菌落数，每个温度处理取三个平板，重复三次，观察并记录平板上的菌落数，计算菌株的温度耐受性。试验数据采用spss13.0统计软件进行单因素方差分析，结合邓肯氏多重比较分析。p＜0.01为差异极显著，p＜0.05为差异显著，p＞0.05为差异不显著，结果用平均数±标准差(mean±sd)表示。
测定结果见表3。
表3.复筛菌株的温度耐受性
结果显示，sg-03融合子具备非常好的温度耐受性，在初始活菌数基本一致的情况下，60℃处理10min，活菌数保持94.4％，而sg116、sg169以及sg333融合子的活菌数分别为1.6％、3.6％和0.5％，差异极显著(p＜0.01),；80℃处理10min，sg-03融合子仍然保持有61.1％的存活率，而其它融合子的存活率都在0.1％以下；而100℃处理10min，sg-03融合子仍然有50.0％的存活率，而其它融合子存活率都在0.001％以下，差异极显著(p＜0.01)。
根据表2、表3，最终筛选获得具备较好产酸能力，而且能够代谢产生较高含量抑菌活性的耐高温菌株sg-03。
sg-03具备较好的乳酸菌发酵特性，同时具备较好的产蛋白酶的能力，对金黄色葡萄球菌atcc25923的抑菌活性较出发菌株地衣芽孢杆菌cicc1009和植物乳杆菌cicc20265都要好，对大肠杆菌atcc25922的抑菌活性也较出发菌株之一的地衣芽孢杆菌cicc1009大幅度提高，略低于另一出发菌株植物乳杆菌cicc20265；酪蛋白的水解能力也在两株亲本菌株之间，更值得注意的是，融合菌株sg-03体现了非常优秀的温度耐受性，100℃处理，活菌数仍然保持50％，体现了较好的高温耐受性，非常适应于饲料的高温制粒过程，确保饲料制粒的高温的活菌数。
五、sg-03的鉴定及保藏
sg-03菌体形状为短杆状，菌体平均大小为0.9-1.2μm×4.0-9.0μm，革兰氏染色为阳性，不产芽孢，无鞭毛，但能运动，无荧光特性。sg-03在mrs培养基上菌落呈乳白色，粘稠，表面光滑，平板上常显示为不透明的圆形凸起。能够发酵戊糖或葡萄糖酸盐，产酸不产气。通常不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。sg-03的生长温度范围在15-45℃，最适宜生长温度为30-35℃，生长ph值在3.5-8.5，最适宜ph值为4.5-6.5。sg-03具有序列表中序列1所示的16srdna。
经16srdna测序，sg-03的16srdna序列如序列表的序列1所示。根据16srdna序列及blast分析，sg-03的16srdna序列与植物乳杆菌cicc20265的16srdna序列的同一性为99.97％，与地衣芽孢杆菌cicc10092的16srdna序列的同一性为84.16％。将获得的耐高温融合菌株sg-03鉴定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，植物乳杆菌sg-03已于2020年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc；地址：广州市先烈中路100号大楼59号楼5楼广东省微生物研究所；邮编：510070)，保藏编号为gdmccno：61035。
六、植物乳杆菌sg-03的遗传稳定性
将植物乳杆菌sg-03进行传代培养以考察其遗传稳定性，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵(采用液体发酵培养基)抑菌活性、乳酸产量以及温度耐受性。结果显示植物乳杆菌sg-03传代过程中的各个指标含量均无明显变化，显示良好的遗传稳定性。
实施例2、植物乳杆菌sg-03的发酵应用
一、植物乳杆菌sg-03的发酵
1、种子活化培养
1.1、接种植物乳杆菌sg-03甘油菌至mrs琼脂培养基斜面(18×180mm)，培养箱中于30℃培养48h。
1.2、再用5ml无菌生理盐水洗下分生孢子，转接于mrs茄瓶培养基(装有mrs琼脂培养基的茄瓶)，于培养箱中30℃培养24h，此即为菌株的活化培养，得到活化的茄瓶菌种，即为活化的植物乳杆菌sg-03菌种。
2、摇瓶种子培养
取步骤1活化的植物乳杆菌sg-03菌种，加入20ml无菌水洗脱制备菌悬液，转接于装有500ml的mrs肉汤培养基的2l的摇瓶中，于恒温振荡培养器，120r/min，30℃培养24h，进一步提高菌落总数，同时强化菌株活力，得到摇瓶种子。
3、种子扩大培养
采用种子罐进行摇瓶种子的扩大培养，将步骤2所得摇瓶种子按接种量2％(可适当在2-10％的范围内调整接种量)移接含有种子培养基的种子罐，培养获得种子。控制工艺如下：罐压0.06mpa，罐温30℃，初搅拌150r/min，溶氧自然下降，底糖(还原糖)3％，移种量20％，周期18h，菌落数达到109cfu/ml。
4、发酵罐培养
将步骤3种子罐培养好的种子移种至发酵罐(装有液体发酵培养基)，移种量为20％。在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为150-200ml/min，搅拌控制为100-200rpm，温度控制在30℃，初始还原的浓度控制在20-30g/l，溶氧控制自然。全过程通过控制流加70％的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.5-1.0g/100ml。好氧发酵周期24h，24h之后关闭搅拌，维持发酵罐内正压，厌氧发酵8h，停止发酵，得到植物乳杆菌sg-03发酵液。
5、添加佐剂并喷雾干燥
在植物乳杆菌sg-03发酵液中加入碳酸钙和脱脂米糠，至碳酸钙的含量为5.0g/100ml，脱脂米糠的含量为10.0g/100ml，直接进行喷雾干燥(出口温度约125℃)，即得到含有植物乳杆菌sg-03的耐高温乳酸菌产品，产品中水分含量小于10％，植物乳杆菌sg-03活菌数为1.0×109cfu/g，命名为植物乳杆菌sg-03活菌剂。
二、植物乳杆菌sg-03活菌剂在aa肉鸡上的应用
1、耐高温植物乳杆菌sg-03对aa肉鸡生产性能的影响
所用基础日粮为玉米-豆粕-玉米蛋白粉-ddgs型饲料，全程使用颗粒型饲料(为山东农业大学动物科技学院产品)。具体的基础日粮及营养水平见表4。
表4基础日粮组成及营养水平(风干基础)％
1)营养水平均为计算值。nutrientlevelswereallcalculatedvalues.
所用植物乳杆菌sg-03活菌剂为步骤一制备得到的植物乳杆菌sg-03活菌剂，植物乳杆菌sg-03活菌数为1.0×109cfu/g。
所用恩拉霉素商品(具体为4％的恩拉霉素预混剂)为杭州金越动物保健品有限公司产品，恩拉霉素含量为4％。
选取体况一致的1日龄健康aa肉仔鸡288只，每只体重44.1g±5.5g，随机分为4个处理，每处理6个重复，每重复12只鸡。4个处理设置如下：
a组为对照组，饲喂基础日粮；
b组为100g/tsg-03组，饲喂100g/tsg-03日粮。该100g/tsg-03日粮是在基础日粮中添加植物乳杆菌sg-03活菌剂得到的日粮。100g/tsg-03日粮中植物乳杆菌sg-03活菌剂含量为100g/1000kg，即植物乳杆菌sg-03的含量为1.0×108cfu/kg。
c组为500g/tsg-03组，饲喂500g/tsg-03日粮。该500g/tsg-03日粮是在基础日粮中添加植物乳杆菌sg-03活菌剂得到的日粮。500g/tsg-03日粮中植物乳杆菌sg-03活菌剂含量为500g/1000kg，即植物乳杆菌sg-03的含量为5.0×108cfu/kg。
d组为200g/t恩拉霉素组，饲喂200g/t恩拉霉素日粮。该200g/t恩拉霉素日粮是在基础日粮中添加恩拉霉素得到的日粮。200g/t恩拉霉素日粮中恩拉霉素商品含量为200g/1000kg，即恩拉霉素的含量为0.008％。
试验期间，统计每个处理的采食量、死淘鸡数和死淘鸡重。21日龄和35日龄时禁饲12h，期间只保证正常的饮水和光照，记录肉鸡体重，将剩余料仔细倒出并称重。记录1-21日龄，21-35日龄两个阶段的体增重、耗料量。统计生产性能的肉鸡采样前空腹12h，只提供正常饮水和光照。统计平均体重(bw)、平均体增重(bwg)、料重比(f/g)、和平均采食量(afi)。
试验数据用平均值±标准差表示，利用sas9.1统计软件中的anova过程进行单因子方差分析，p＜0.05为差异显著，p≥0.05为差异不显著。结果见表5。
表5.植物乳杆菌sg-03活菌剂不同添加量对aa肉鸡生产性能的影响
结果显示：每只鸡每日添加100-500g的植物乳杆菌sg-03活菌剂显著的改善肉鸡的生产性能，显著提高日增重和降低料肉比，有效的起到抗生素(恩拉霉素)促生长的替代作用，而且100g添加量效果优于500g。
2、耐高温植物乳杆菌sg-03对aa肉鸡免疫性能的影响
2.1、抗氧化指标
在21和35日龄时，每重复选取1只鸡翅静脉采血，斜放静置后，3000r/min离心10min分离血清，将析出的血清用移液枪仔细的转移至1.5ml离心管中，放于-20℃冰箱保存待测。解剖后取肝脏、胸肌、空肠于2ml冻存管中，放于-20℃冰箱保存待测。
严格按照试剂盒的说明方法检测血清、肝脏、胸肌、空肠测定总抗氧化能力(t-aoc)(试剂盒购自于南京建成生物工程研究所有限公司，货号a015-1-2)，结果见表6，数据表示为平均值±标准差，利用sas9.1统计软件中的anova过程进行单因子方差分析，p＜0.05为差异显著，p≥0.05为差异不显著。
表6.植物乳杆菌sg-03活菌剂对肉鸡抗氧化能力的影响
结果显示，添加植物乳杆菌sg-03活菌剂100g和500g均能够显著肝脏、胸肌和空肠的抗氧化能力，改善血清的抗氧化能力，而且效果添加100g的效果优于500g。
2.2、血清免疫指标
采血及分离血清同抗氧化指标的检测。
空肠粘膜：截取空肠，分离内容物后用生理盐水漂洗、滤纸吸干。用载玻片刮取粘膜于2ml冻存管中。立即放置于液氮罐中保存，采样完毕后转移至-80℃冰箱待测。
elisa法测定血清免疫球蛋白g(igg)(购自于南京建成生物工程研究所有限公司，货号e026-1-1)、白细胞介素-i(il-1)(购自于南京建成生物工程研究所有限公司，货号h001)以及空肠粘膜的分泌型免疫球蛋白a(siga)(购自于南京建成生物工程研究所有限公司，货号h108-2)。
测定结果见表7。
表7.植物乳杆菌sg-03活菌剂对肉鸡血清免疫指标的影响
结果显示，植物乳杆菌sg-03活菌剂能显著提高肉鸡的体液免疫和细胞免疫功能，增加igg及空肠黏膜siga的含量，提高免疫机能。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110>松刚（福建）生物工程有限公司
<120>一株耐高温植物乳杆菌及其制备方法
<130>gncsy201615
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1438
<212>dna
<213>植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)
<400>1
acatgcagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagt60
gagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctg120
gaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagtttgaaagatggc180
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