一种新型靶向溶酶体钌光催化剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药领域，具体涉及一种新型靶向溶酶体钌光催化剂及其制备方法和应用。

背景技术：

随着环境污染和人口老龄化问题加重，癌症已经成为威胁人类健康的重大疾病，是全球第二大死因。2015年约有880万人死于癌症，2018年全球预计有1810万新增癌症病例和960万癌症死亡病例。根据世界卫生组织估计，2020年全球新增癌症病例将达到2000万，至少1200万人死于癌症，我国的肿瘤发病率则以每年3％～5％的速度在提升。

放射治疗和化学药物治疗是临床上常采用的肿瘤治疗方法，但是放疗和化疗在取得治疗效果的同时，常引起不同程度的毒副作用，如皮肤肿痛、精神萎靡、脱发，甚至出现骨髓抑制、胃肠道反应等副作用让很多患者的生活质量很大程度下降。光动力治疗被认为是临床具有良好靶向性的新型肿瘤治疗方法，其作用基础是利用光激发聚集在肿瘤内部的光敏剂，产生活性氧有效杀伤病变组织，同时可减少对病灶周边正常组织的杀伤，以此来获取最佳的治疗效果。根据活性氧种类与产生方式的不同，可划分为ⅰ型和ⅱ型两种机制。i型机制中，激发态光敏剂与其他分子直接发生电子转移作用，产生自由基或自由基离子从而达到损伤组织的目的；ⅱ型机制中，激发态光敏剂与氧分子发生能量传递作用，生成单线态氧(¹o2)。

光动力疗法的治疗效果与光敏剂的性质是息息相关的，其光动力转化效率、紫外-可见光吸收范围和靶向肿瘤位点效率决定了其临床可实行性和适用范围。临床用到的光敏剂需满足以下条件(chemicalcommunications,2017,53(91),2341-12344.)：(1)能够精确靶向肿瘤位点；(2)对人体组织具有强的光毒性，同时具有较低的暗毒性；(3)适用的激发光源最好是具有较深的组织穿透力的近红外光或双光子光源，可避免因高能量的光辐射而损伤正常组织。因此，目前研究可用于肿瘤的光动力治疗的高效、低毒、选择性强的光敏剂正是临床所需。

钌金属配合物由于具有突出的光物理和化学性质，能够嵌入dna结构中以及能与蛋白质结合的能力，在细胞器染料、荧光成像和光动力治疗等研究领域获得了极大的关注。与有机化合物相比,钌金属配合物分子结构具有更好的可塑性，可以通过在配体上修饰引入其它分子活性基团改善其光物理和化学性质，可应用于结合不同底物的活性区域；并且金属配合物相对比较稳定，容易在体内环境产生药效。sherrimcfarland等人研究的钌配合物(tld1433)，基于其具有高效产生单线态氧的能力，作为第一例金属配合物用于肿瘤的光动力治疗于2016年进行临床i期试验。因此，研究钌金属配合物用于肿瘤光动力治疗具有极大的临床应用前景。

尽管大多数肿瘤采用warburg型糖酵解代谢，但从线粒体电子传递链释放的活性氧对于缺氧条件下癌细胞的细胞增殖和氧化还原调节功能至关重要。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)是细胞内参与能量代谢的重要氧化还原辅酶，在生物介质中能被氧化成nad⁺，它参与维持细胞内氧化还原平衡，细胞内nadh:nad⁺比值失衡会引起线粒体电子传递链功能障碍等病理反应。在肿瘤细胞中选择性的诱导nadh的氧化消耗和线粒体电子传递链的破坏可破坏肿瘤细胞内的氧化还原平衡，从而杀死肿瘤细胞(naturechemistry,2019,11(11):1041-1048.)。

溶酶体是一种动态的，多态的，含有多种水解酶的细胞器，具有接受和降解大分子的能力，这些大分子来自分泌的，内吞的，自噬的和吞噬的膜转运途径。其功能取决于其膜的完整性，该膜是溶酶体基质和细胞质之间的生理屏障。溶酶体膜的失稳，例如碱化或易位，将导致质子和水解酶渗漏，导致细胞器功能障碍，进而引起细胞坏死，凋亡和病理症状。因此，设计以溶酶体为靶标的光敏剂可以迅速诱导溶酶体功能障碍，进而导致癌细胞凋亡或坏死。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的问题，提供以溶酶体为靶向的分子，提供一种新型靶向溶酶体钌光催化剂。

本发明的另一个目的在于，提供上述新型靶向溶酶体钌光催化剂的制备方法。

本发明的另一个目的在于，提供上述新型靶向溶酶体钌光催化剂的应用。

为了解决上述问题，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种新型靶向溶酶体钌光催化剂，其结构如式(i)：

上述新型靶向溶酶体钌光催化剂的制备方法，包括以下步骤：

s1.双(2,2'-二吡啶基)二氯化钌(ii)二水合物和4,4'-二苯基-2,2'-联吡啶在乙醇中加热回流，反应完毕之后抽滤得到粗产品；

s2.将步骤s1得到的粗产品纯化即得。

优选地，所述步骤s2中粗产品纯化包括：经过氧化铝硅胶柱色谱分离纯化，再用二氯甲烷/乙醚重结晶即得。

上述新型靶向溶酶体钌光催化剂在作为抗癌药物中的应用。

上述新型靶向溶酶体钌光催化剂在催化氧化nadh中的应用。

上述新型靶向溶酶体钌光催化剂在催化氧化氨基酸中的应用。

上述新型靶向溶酶体钌光催化剂在抗hepg2癌细胞的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

本发明提供的一种新型靶向溶酶体钌光催化剂，该配合物应用于肝癌(hepg2细胞)的光动力治疗具有高的疗效，能够靶向细胞内的溶酶体，且能对nadh和氨基酸有光催化氧化作用，对于研究高效低毒的钌配合物光敏剂有重要的意义，为临床开发新型的金属抗肿瘤药物奠定实验和理论基础。本发明的金属钌(ii)配合物在无光照情况下，对人肝癌细胞株没有毒性(ic50>100μm)，但是在光照条件下对人肝癌细胞株具有很强的生长抑制能力(ic50＝0.51μm)，可以靶向溶酶体，并且对癌细胞内nadh有光催化氧化能力。

附图说明

图1本发明配合物分子结构；

图2本发明钌(ii)配合物的光稳定性测试图；

图3本发明钌(ii)配合物光催化氧化nadh的能力测试图；

图4本发明钌(ii)配合物光催化氧化氨基酸的能力测试图；

图5本发明钌(ii)配合物对肝癌细胞株的暗毒性与光毒性测试图；

图6本发明钌(ii)配合物溶酶体和线粒体定位实验测试图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种新型靶向溶酶体钌光催化剂，其结构如式(i)：

式(i)化合物的制备方法：

双(2,2'-二吡啶基)二氯化钌(ii)二水合物(0.0520g,0.1mmol)和4,4'-二苯基-2,2'-联吡啶(0.0308g,0.1mmol)的混合物在乙醇(20ml)中加热至80℃，回流反应24小时后将反应降至室温，析出物用乙醇过滤洗涤，在真空中干燥后得到橙红色固体。将获得的粗产物经中性氧化铝柱色谱(溶剂：甲醇/二氯甲烷＝1/99)纯化，经二氯甲烷/乙醚重结晶，得到橙红色晶体钌(ii)配合物(0.0619g,0.078mmol)，产率78％。通过质谱和核磁表征，其分子式为c42h32cl2n6ru，esi-ms[ch3oh,m/z]:361[m-2cl]²⁺。¹hnmr(400mhz,dmso)9.37(d,j＝1.6hz,2h),8.91(d,j＝8.1hz,4h),8.20(d,j＝1.7hz,4h),8.08(d,j＝7.0hz,4h),7.92–7.86(m,4h),7.77(t,j＝6.2hz,4h),7.65–7.56(m,10h)。

反应流程图：

实验例1

对实施例获得的式(i)化合物的光稳定性进行测试

将含钌配合物(10m)的pbs溶液的发光石英比色皿放在465nm光源下辐射5min(光剂量为11.7j/cm²)，检测溶液的吸光度。钌(ii)配合物在465nm光辐射下的影响如图2所示，钌(ii)配合物在光辐射前后的紫外-可见吸收图谱基本没有变化，可见钌(ii)配合物具有强的光稳定性。

实验例2

钌(ii)配合物光催化氧化nadh的能力

由于在光催化下，金属配合物能将还原型辅酶ⅰ(nadh)氧化成其氧化态(nad⁺)，所以将含钌配合物(2m)和nadh(a339nm＝1.5)的发光石英比色皿放在465nm光源下辐射5min(光剂量为11.7j/cm²)，检测溶液的吸光度。钌(ii)配合物在465nm光辐射下对nadh氧化的影响如图3所示，钌(ii)配合物对nadh有光催化氧化能力。

实验例3

钌(ii)配合物光催化氧化氨基酸的能力

将含钌配合物(2m)和不同氨基酸(20mg/l)的水溶液经465nm光源下辐射5min(光剂量为11.7j/cm²)，用过氧化氢试纸检测光照后或暗组(aa)溶液中产生的过氧化氢含量。钌(ii)配合物在465nm光辐射下对氨基酸氧化的影响如图4所示，钌(ii)配合物对部分氨基酸有光催化氧化能力，其中对蛋氨酸和缬氨酸的光催化氧化作用最强。

实验例4

钌(ii)配合物应用于人肝癌的光动力治疗

利用mtt比色法来分析钌配合物对人肝癌(hepg2细胞)的抗增殖效应。mtt，中文名叫噻唑蓝，是一种四唑盐，在活细胞中，线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将mtt还原，生成一种蓝紫色产物-甲臜(可溶于dmso)，且该产物在595nm处有吸收峰，故可用a595nm来分析细胞增殖情况。

mtt实验步骤如下：

①先复苏1管hepg2肿瘤细胞，用新鲜培养液(dmem培养基+10％胎牛血清+1％盘尼西林和链霉素)培养，传代2次后使用。

②待细胞到达对数生长期时，以5000个/孔的细胞密度接种至2块96孔板中(每孔用100μl培养液培养细胞，一板为光照组，另一板为黑暗对照组)，送入恒温箱(310k,5％co2)中培养。

③待其贴壁后，吸出原有培养基，每孔加入100μl含有200、100、50、10、1、0.1、0.05、0.01m共8个浓度的钌配合物的新鲜培养液，轻轻晃匀，在恒温箱中避光孵育。

④孵育12h后，将光照组的细胞培养板置于465nm波长蓝光灯下光照5min(光剂量为11.7j/cm²)，然后放回培养箱继续避光孵育36h(黑暗对照组的细胞一直置于温箱中避光培养)。

⑤孵育36h后，在每孔中加入10μlmtt(5mg/ml)，于37℃温箱中继续孵育4h后，吸去上清液，每孔加150μl二甲基亚砜(dmso)，用酶联免疫检测仪检测a595nm，计算细胞增殖抑制率，求出ic50值(抑制率等于50％的时候的药物浓度)。

如图5所示，mtt法检测不同浓度的钌配合物在黑暗与光照处理条件下对人肝癌细胞(hepg2)的杀伤作用效果不同，在无光照情况下，对人肝癌细胞株没有毒性(ic50>100μm)，但是在光照条件下对人肝癌细胞株具有很强的生长抑制能力(ic50＝0.51μm)。

实验例5

钌(ii)配合物溶酶体和线粒体定位实验

将处于对数生长期的hela细胞，以2×10⁴个/孔接种于共聚焦显微镜专用玻璃底培养皿中，培养24小时待细胞贴壁后，加入10μm的钌配合物孵育1h，小心吸去培养基，用pbs洗涤1次，分别加入含有100nm的商用线粒体红色荧光染料mitotrackerdeepred(mtr，100nm)，商用溶酶体红色荧光染料lysotrackerdeepred(ltr，100nm)的完全dmem培养基孵育30min，吸去培养基，加入新鲜培养基，在共聚焦显微镜20×物镜下进行拍照。钌配合物的激发波长为405nm。mtr和ltr的激发波长均为633nm，l发射光接收器：650±20nm(钌配合物)，670±20nm(mtr)，670±20nm(ltr)。

细胞器共定位实验进一步证实，如图6所示，钌配合物的信号与商用溶酶体染料重叠度非常高，与此相反，商用线粒体染料与钌配合物的信号的重叠度比较低，这说明钌配合物能够选择性地定位在肿瘤细胞的溶酶体。溶酶体主要功能是能够消化细胞内产生的废弃物以及细胞外摄取的物质。溶酶体含有多于50种不同的酶能够分解几乎所有生物分子，包括蛋白质，核酸，碳水化合物，脂质，和细胞碎片。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。