半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶及其基因和应用

本发明属基因工程技术领域，更具体地说，本发明涉及一种微藻来源的半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶及其基因和应用。

背景技术：

与传统的农作物相比，微藻具有更高的光合作用和生物量生产率。同时微藻的培养不需要大面积的土地，减少了与饲料和其他产品的农作物竞争土地。此外，利用微藻生产的生物柴油具有与石油衍生柴油类似的特性，例如密度、粘度、燃点、冷滤点、凝固点和热值等指标。综上，微藻被公认为是生产生物柴油最有希望的潜在原料之一。

生物柴油是以生物体油脂为原料，通过分解、酯化而得到的长链脂肪酸甲酯。研究发现，脂肪酸碳链长度和饱和度对生物柴油的性能具有重要的影响。在欧盟标准化委员会(cen)和美国材料与实验协会(astm)颁布的生物柴油的标准(en14214和astmd6751)中，以c16和c18的饱和或单不饱和脂肪酸为主的生物柴油性能最好。三酰甘油除了可以作为合成生物柴油的前体外，在药品、食品等领域也有广泛的用途。如三棕榈酸甘油酯又称甘油三棕榈酸酯或三软脂酸甘油酯，具有良好的生物相容性，可用于包覆药物以达到缓释效果，被广泛地应用于制备药物脂复合物(微胶囊)。此外，人乳脂中的1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(简称opo)现已经被证实具有促进钙吸收和利用、促进婴儿发育、减少便秘和肠梗阻发生的功能，近年来被广泛应用于保健食品、婴幼儿配方乳粉等领域。中国卫生部于2008年发布的第13号公告中，明确opo可以作为营养强化剂应用于婴幼儿配方乳制品中。据世界卫生组织相关资料报道，合理的油脂摄入量和平衡的脂肪酸组成比例是衡量人们食用油是否健康的两个主要方面，一些多不饱和脂肪酸的tag具有保护血管、改善血清脂肪酸组成的作用。如共轭亚油酸甘油酯(conjugatedlinoleicacidtriacylglycerol，cla-tag)是由亚油酸(c18:2)的异构体和甘油通过酯化反应生成的化合物，它克服了游离型pufa易氧化、有酸味、口味不佳等缺点，在保持了共轭亚油酸生理功能和营养功能的同时，稳定性好、气味和味道更平和、更易于被人体吸收，具有抑癌、调节血脂、抗动脉粥样硬化、免疫调节、减肥等多种生理功能。

目前这类不饱和脂肪酸甘油酯的合成主要利用化学脂交换法。现有的方法费时费力且产物难以控制，副产物较多，不宜生产具有期望生理功能的结构脂质，从而限制了此类产品的开发。脂肪酸在tags中的分布位置决定着油脂的功能特性及吸收代谢情况。因此，调控微藻tag中脂肪酸的组成是目前面临的一个难题。

在单细胞微藻中，tag的积累多发生在胁迫条件下并伴随着光合作用膜脂(如半乳糖脂)大量降解，因此一些微藻细胞中，特别是衣藻中tag的积累往往伴随着细胞生长的停滞，导致油脂的产率受限。因此，如何提高微藻脂质积累是突破现有瓶颈的关键。传统提高微藻脂质积累的方法主要是通过优化培养条件，如温度、光照强度、ph值和培养基组分等方法来实现。虽然传统的方法可以有限地提高微藻的脂质含量，但是基于它的高成本和高耗能等因素，限制了其进行大规模地商业化培养。

因此，部分研究者利用基因工程等手段期望通过调节藻体内部代谢流的流动方向或提高藻体产油速率以提高微藻脂质生产的能力。有研究者通过在微藻中过表达参与脂质代谢的首个关键酶——乙酰-coa羧化酶(accase)，结果显示总脂肪酸的生物量得以提高，但是脂质含量并没有显著变化，推测是由于accase在有些物种中并不是脂质生物合成的限速酶，也有可能是accase表达超过一定水平后，在脂质生产过程中负调馈其他的限速步骤，导致tag含量没有明显提高。同时，虽然accase酶是油脂合成代谢中重要的关键酶，但是该酶距离目标产物三酰甘油比较远，该酶过量表达所造成的影响在后续的多步反应中，可能被大量的旁路反应所消耗，结果导致对目标产物三酰甘油积累所起的作用微乎其微。此外，有研究者期望在微藻中过表达酰基转移酶(包括gpat、lpaat和dgat)和通过抑制油脂合成的竞争途径(包括如蛋白、淀粉合成)等研究策略来提高tag合成途径中的代谢中间体通量，从而增加tag的积累。然而，上述策略中部分基因的过表达虽然一定程度上能提高tag的含量，但能否有效地调控微藻细胞的整体代谢还存在疑问，同时一些代谢物质合成的缺失或过量也会对微藻细胞的生长带来负调馈影响，进而同样限制了其油脂产率。

如何在提高tag合成的同时维持叶绿体膜脂的光合作用效率是能源微藻遗传改良所面临的挑战。在以高等植物为模式系统的研究中，由于油脂大多是在种子等高度分化的器官中合成的，kennedy途径合成tag是大家关注的重点，而在叶绿体中是否存在由糖脂介导的tag合成途径的机制并未悉知。2010年，有研究者发现在拟南芥中sensitivetofreezing2(atsfr2)基因具有半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶(galactolipid:galactolipidgalactosyltransferase,gggt)的功能，在冷冻胁迫下野生型拟南芥中gggt基因被激活，催化大部分mgdg(16:3)生成dag，从而进一步提高了含有c16:3酰基的tag含量，在环境胁迫下gggt对维持叶绿体膜结构的稳定性也具有重要作用。因此，在莱茵衣藻中利用gggt探究其对糖脂代谢以及参与tag合成的调控，有望在提高tag合成的同时补偿光合膜脂的降解，这将很大程度地解决前文所提到的技术难题(tag的积累多发生在胁迫条件下并伴随着光合作用膜脂(如半乳糖脂)大量降解，细胞生长停滞，导致油脂的产率受限的技术问题)。此外，研究发现莱茵衣藻中的糖脂mgdg主要为一些多不饱和脂肪酸组成的甘油脂化合物，因此利用gggt催化糖脂生成的dag将为后续合成含有多不饱和脂肪酸的tag提供了可能性，这将极大程度地推进相关产业的发展。然而，目前并未有微藻来源的具有gggt功能的基因的相关报道，目前还无法应用到调节微藻合成tag的研究及产业中。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种微藻来源的具有gggt功能的新基因，该基因是来源于莱茵衣藻的crgggt03基因，通过酶活验证发现该蛋白同时具有半乳糖基转移酶和半乳糖基水解酶的功能，通过在莱茵衣藻中过量表达该基因，结果显示在缺氮胁迫下，相比空载对照组，过表达株中tag含量显著提高，为微藻产高产量生物柴油、多不饱和脂肪酸的tag提供技术支持。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括:

一种半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶基因crgggt03，其核苷酸序列如seqidno:1。

一种半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶crgggt03，其氨基酸序列如seqidno:2所示；所述转移酶crgggt03还具有β-半乳糖基水解酶的活性。

一种重组质粒pyes2-crgggt03，所述重组质粒是将半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶基因crgggt03连接到经ecori和xholi双酶切的pyes2-ura酵母表达载体。

一种重组质粒pyes2-crgggt03的构建方法，所述方法包括:以莱因衣藻cdna为模板，利用分别包含ecori、xhoi限制性酶切位点的引物和高保真聚合酶fastpfu进行pcr扩增crgggt03基因，扩增出cds基因片段；然后用相应的限制性内切酶酶切后，利用连接酶将该酶切后的片段与经双酶切的酵母表达载体pyes2-ura连接，获得重组质粒pyes2-crgggt03；

其中，所述包含ecori、xhoi限制性酶切位点的引物为:

正向引物:

5'-ttagaattcatgacgggctcgggcaagcccgcagcgaa-3'，

反向引物:

5'-taactcgagtcatccaatcgccaccatgcccaccgcctt-3'。

一种酵母表达载体，所述表达载体为将构建的重组质粒pyes2-crgggt03和含有黄瓜单半乳糖基二酰甘油合成酶基因mgd1的pesc-cumgd1质粒共同转入野生型的酿酒酵母invsc1感受态细胞中所得到的阳性转化菌株。

一种重组质粒pmal-crgggt03，所述重组质粒是将半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶基因crgggt03，连接到经bamhi和hindii双酶切的pmal-c5x原核表达载体。

一种重组质粒pmal-crgggt03的构建方法，所述方法包括:

以莱因衣藻cdna为模板，利用分别包含bamhi、hindiii限制性酶切位点的引物和高保真聚合酶fastpfu进行pcr扩增crgggt03基因，扩增出含有三个重复g4s氨基酸的连接肽linker和his6标签的目的基因片段linker-crgggt03-his6；然后用相应的限制性内切酶酶切后，利用连接酶将该酶切后的片段与经双酶切的原核表达载体pmal-c5x连接，获得重组质粒pmal-crgggt03；

其中，包含bamhi、hindiii限制性酶切位点的引物为:

正向引物:

5'-tcaggatccggaggaggtggatcaggaggaggtggatcaggaggaggtggatcaatgacgggctcgggcaagcccgcagcg-3'，

反向引物:

5'-tcaaagcttttaatggtgatggtgatgatgtccaatcgccaccatgcccaccgcctt-3'。

一种原核表达载体，所述表达载体为将构建的重组质粒pmal-crgggt03和转入到大肠杆菌bl21中所得到的阳性转化菌株。

一种在野生型莱茵衣藻cc400细胞中过表达crgggt03基因的方法，所述方法包括：

以莱因衣藻cdna为模板，利用分别包含ecori、bglii限制性酶切位点的引物和高保真聚合酶fastpfu进行pcr扩增crgggt03基因，扩增出cds基因片段；然后用相应的限制性内切酶酶切后，利用连接酶将该酶切后的片段与经双酶切的莱茵衣藻过表达载体pchlamy-4-yfp连接，获得重组质粒pchlamy-4-crgggt03-yfp；

其中，所述分别包含ecori、bglii限制性酶切位点的引物为:

正向引物:

5'-ttagaattcatgacgggctcgggcaagcccgcagcgaa-3'，

反向引物:

5'-taaagatcttccaatcgccaccatgcccaccgcctt-3'。

利用pchlamy-4-yfp质粒构建crgggt03的过表达载体pchlamy-4-crgggt03-yfp，在莱茵衣藻cc400细胞中用玻璃珠法进行转化，经抗性筛选后，提取转化子的基因组dna，利用特异性引物扩增crgggt03的cdna序列进行pcr筛选，以获得crgggt03过表达阳性转化子。

一种半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶基因crgggt03在提高微藻细胞生物质量、合成功能性低聚半乳糖、或提高细胞中tag含量的应用。

(三)有益效果

本发明的半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶基因crgggt03，具有半乳糖基转移酶、β-半乳糖基水解酶的活性。

通过在莱茵衣藻中过量表达半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶基因crgggt03，结果显示：在缺氮胁迫下，与空载对照组相比，基因crgggt03的过表达不仅不会对微藻细胞的生长造成明显影响，且在缺氮胁迫下，细胞干重相比对照组提高30％以上，细胞中tag含量与空载对照组提高35％以上，部分过表达藻株中tag含量甚至提高61.04％，占到细胞干重的7.73％。

综上，本发明的半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶基因crgggt03，能够被作为重要酶源，运用于高产量的生物柴油、多不饱和脂肪酸的tag及其他相关的功能性低聚糖产业中，为今后功能性食品、新药开发等领域带来广阔的发展前景。

附图说明

图1为莱茵衣藻crgggt03cdna序列的扩增。模板dna为莱茵衣藻cdna文库。pcr产物大小约为1527bp。

图2为crgggt03基因结构示意图。下划线部分为生物信息学软件interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)预测得到的糖基水解酶功能域；加重黑体字符部分为多序列比对与文献报道的糖基水解酶的催化活性位点。

图3为gggt的系统进化树。在美国国立生物技术信息中心ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和莱茵衣藻蛋白质组(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)数据库中blast同源比对搜索crgggt基因信息，下载木薯(manihotesculenta)、大豆(glycinemax)、烟草(nicotianatabacum)、番茄(solanumlycopersicum)、苦瓜(momordicacharantia)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、萝卜(raphanussativus)、胶球藻(coccomyxasubellipsoidea)、团藻(volvoxcarteri)和杜氏盐藻(dunaliellasalina)sfr2的蛋白氨基酸序列，使用dnaman进行多序列比对后运用neighbor-joining方法构建了系统进化树。

图4为酿酒酵母中黄瓜mgdg合成酶mgd1和crgggt03基因共表达载体的构建；其中

(a)为酿酒酵母中共表达载体构建示意图；(b)为酿酒酵母共转化克隆子pcr检测结果，左边泳道均为黄瓜mgd1基因扩增条带，右边泳道为crgggt03基因扩增条带。

图5为酿酒酵母共转化体系中crgggt03半乳糖基转移酶功能验证；其中(a)共转化体系中酵母总脂薄层层析图，其中pyes2-ct和pesc-trp为酵母的空载质粒，pesc-mgd1为含有黄瓜mgdg合成酶mgd1基因质粒，pyes2-crgggt03为含有莱茵衣藻crgggt03基因质粒。+，表示在酵母中转化该质粒。-，表示没有转化该质粒；

(b)为共转化体系中酵母糖脂mgdg、dgdg、trigdg和tetragdg的mrm质谱图，其中1和2分别表示mgdg、dgdg和trigdg、tetragdg的mrm质谱图。

图6为crgggt03原核表达载体构建示意图；其中，融合表达蛋白包含麦芽糖结合蛋白标签、linker连接肽和his6标签以及目的基因蛋白。

图7为crgggt03半乳糖基水解酶活性验证；其中，(a)为crgggt03水解对硝基苯-β-d-吡喃半乳糖苷底物；(b)为crgggt03半乳糖基水解酶活性吸光度测定。反应体系中分别加入不同浓度的crgggt03纯化蛋白和空载ev总蛋白，同时将商品化的e.coliβ-galactosidase(sigma)标品作为阳性对照组。

图8为crgggt03在野生型莱茵衣藻cc400细胞中过表达构建示意图。

图9为crgggt03基因过表达对莱茵衣藻细胞生长的影响；其中，(a)为crgggt03过表达藻株在不同培养条件下的生长曲线。其中crgggt03过表达藻株细胞在正常培养3天后，转入到tap缺氮培养基中继续培养2天。随后取1ml藻液样品，加入10μllugol染液充分振荡混匀后计数。

(b)为crgggt03过表达藻株在缺氮培养2天时细胞干重。*表示显著性p值小于0.05，**表示显著性p值小于0.01。

图10为缺氮胁迫下crgggt03过表达藻株细胞内tag的含量。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

本发明利用微藻来源的crgggt03基因及基因工程的方法提高微藻产tag的能力。通过研究，发明人在莱茵衣藻数据库中找到了一个新crgggt03基因，经酶活验证发现该蛋白同时具有半乳糖基转移酶和半乳糖基水解酶的功能。通过在莱茵衣藻中过量表达该基因，结果显示在缺氮胁迫下，相比空载对照组，过表达株中tag含量提高35％以上，高的甚至达61％以上，占到细胞干重的7.73％。此外，半乳糖基转移酶除了能用于合成功能性低聚半乳糖外，也是自然界用于产生多种含碳水化合物结构的关键酶，是获取复杂的低聚糖和糖缀合物以及糖缀合物和细胞表面聚糖修饰的重要催化剂。因此，本发明微藻来源的crgggt03基因，有望作为重要酶源，应用到微藻生产高产量的生物柴油、多不饱和脂肪酸的tag及其他相关的功能性低聚糖的产业中，为今后功能性食品、新药开发等领域带来广阔的发展前景。

以下为本发明微藻来源的crgggt03基因获得过程、序列特征分析、及其在细胞中过表达的功能鉴定。

(一)基因克隆及序列特征分析

本发明所提供的crgggt03基因是以jgi莱茵衣藻基因组数据(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)公布的cre03.g171050.t1.1基因为参考基因，设计特异引物(正向引物5'-atgacgggctcgggcaagcccgcagcgaat-3'，反向引物5'-tcatccaatcgccaccatgcccaccgcctt-3')，以莱茵衣藻cdna文库为模板，进行pcr扩增获得(图1)。

pcr的反应体系为：50ng模板dna，5μl5×transstartfastpfubuffer，0.25μl正向引物(10μm)，0.25μl反向引物(10μm)，最后补充去离子水，使总体积为25μl。pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸5min。该cdna含有一个大小为1527bp的开放阅读框，编码了一个含有508个氨基酸残基的蛋白。用生物信息学相关软件初步预测了此蛋白的功能，结果显示crgggt03含有糖基水解酶的功能域(参见图2的加重黑体字符)。进化树分析结果显示，crgggt03与绿藻在进化上属于同一支系，而与已报道的拟南芥和番茄等高等维管束植物属于旁系同源基因(图3)。

本发明首先提供一种莱茵衣藻半乳糖脂：半乳糖脂半乳糖基转移酶基因crgggt03，其核苷酸序列如seqidno:1所示：

atgacgggctcgggcaagcccgcagcgaataaggcgacggcaaacggcgatggcgagccggtacggttcctgaagggggcggctatcagcgtgtggcagaactcgggtgacgacgactcgaactggactcgcttcgccaagagccgctggcccttccgctcgttcggcgtgagcgctatccgcgggaaatacaacatcgacaagtgcagtgacttctggaacaactatgagcgggacatcaagctggcggccgacatcggcagcaccaccttccgcttctccatcgagtgggctcgcatcgagccgctgaggggcgtgttcgacatggaggctgtgcacaggtaccaccagatgctggactgcatggcggcgcacggcctggtgcccaacgccacactgtggcacttcgtgcaccccacctggttcgagcaggcgggcggctggaccaaggaggagaacatcccggcctttgtgcgcttcagcgtcaagtgcttcgagtggttcaaggacaagatcacgctgtgggccaccttcaatgagcccacgtgctacatgttcctggccttcattgtgggcattgcgccgcccggccgcatcatggacctggtcaccgccggccgcatgctcagcaccatgctcaaggcgcacaccgccacctacagggcgatcaaggcggcgccgggggggcaggcggcgcaggtgggcctggtgagccaccacatcaccttcgagccgcagggcactggcatcctgtacggcgtgtccaaggtgctgtctgactggatgacctactggtggggctgggacgtggtgcaccactggatgctgaccggcgagttcgtgtggaagctgcccgtgctgggcgtgtggcagcgctggcaggacccggcggggcgccccccctgcgactggtggggcatcaactactacagccggggcatcttctcctggtacctcgcacccagctgccgcgagtccgaggtgatgacggacatgtactaccccatctacccggagggcctgtacaagtgcatcaagaggtgctctgagttcggcattcccatgtacatcactgagaccggcattgccgacgcccgcgacgaccgccgcgcgctcatgatcgactcctacatgaaggcgacgctgcgggcggtggccgagggctgcgacgtgcgcgggctgtactactggacgctgctggacaacctggagtgggccaccggctacaccatgaagttcgggctgtacgcctgggagccggatggcagcgtggaccgcaagctcaaggagggcagcaagacgctggtgcgctacttcaagaccctgccggacgacctggcgggcgtgcgggcggcggcgcggcaggtgcaggggcagctgggcgaggacctgggcgtggaggcggcgctggaggaggagggcgtgacgcgcgtggcggcgggaggcaagctggtggtgggcgaggcggcgggcaagggcggcgaggcggaagggcggaaggcggtgggcatggtggcgattggatga。

更进一步地，本发明再提供一种莱茵衣藻半乳糖脂：半乳糖脂半乳糖基转移酶crgggt03，其氨基酸序列如seqidno:2所示：

mtgsgkpaankatangdgepvrflkgaaisvwqnsgdddsnwtrfaksrwpfrsfgvsairgkynidkcsdfwnnyerdiklaadigsttfrfsiewarieplrgvfdmeavhryhqmldcmaahglvpnatlwhfvhptwfeqaggwtkeenipafvrfsvkcfewfkdkitlwatfneptcymflafivgiappgrimdlvtagrmlstmlkahtatyraikaapggqaaqvglvshhitfepqgtgilygvskvlsdwmtywwgwdvvhhwmltgefvwklpvlgvwqrwqdpagrppcdwwginyysrgifswylapscresevmtdmyypiypeglykcikrcsefgipmyitetgiadarddrralmidsymkatlravaegcdvrglyywtlldnlewatgytmkfglyawepdgsvdrklkegsktlvryfktlpddlagvraaarqvqgqlgedlgveaaleeegvtrvaaggklvvgeaagkggeaegrkavgmvaig。

(二)半乳糖脂：半乳糖脂半乳糖基转移酶功能验证

以莱因衣藻cdna为模板，利用分别包含ecori、xhoi限制性酶切位点的引物和高保真聚合酶fastpfu进行pcr扩增crgggt03的cds基因片段，随后用相应的限制性内切酶酶切后，利用t4dna连接酶将该片段与经双酶切的酵母表达载体pyes2-ura连接，获得重组质粒pyes2-crgggt03。上述分别包含ecori、xhoi限制性酶切位点的引物为：

正向引物：

5'-ttagaattcatgacgggctcgggcaagcccgcagcgaa-3'，

反向引物：

5'-taactcgagtcatccaatcgccaccatgcccaccgcctt-3')。

利用酿酒酵母转化试剂盒s.c.easycomptmtransformationkit将该重组质粒和已构建的含有黄瓜单半乳糖基二酰甘油(monogalactosyldiacylglycerol，mgdg)合成酶mgd1的pesc-cumgd1质粒共同转入野生型的酿酒酵母invsc1感受态细胞中，得到转化后的酵母细胞，载体共转化示意图如图4(a)和(b)所示。

随后，将转化后的酵母细胞涂布在相应的营养缺陷型的固体选择培养基中，30℃培养2～4d至形成肉眼可见的单克隆细胞。随机挑取若干克隆子，提取酵母的基因组进行pcr验证。

将验证成功后的酵母阳性转化菌株在酵母诱导培养基中进行诱导表达36小时，收样后利用有机试剂提取酵母总脂。提取方法为：于酵母细胞沉淀中加入适量的液氮充分研钵成粉末后，立即加入6ml的氯仿：甲醇：甲酸＝10:20:1(v/v/v)溶液，充分混匀后加入3ml的低盐溶液(0.2mh3po4+1mkcl)，随后振荡混匀30s，在室温下1000×g离心5min后将下层的有机层转移到安捷伦玻璃瓶中，使用氮吹浓缩仪蒸发溶剂，干燥后加入100μl氯仿溶解。以氯仿：己烷：四氢呋喃：异丙醇：水＝50:100:1:80:2(v/v/v/v/v)的混合液为展开剂，利用薄层层析(tlc)的方法检测生成的糖脂。

如图5a所示，crgggt03在同时转化黄瓜mgd1的酿酒酵母invsc1中都能检测到mgdg和dgdg。

此外，将提取的酵母总脂通过在lc-ms的正极模式下，利用behc18色谱柱分离酵母样品中所含的不同酰基组成的半乳糖脂来进行lc-ms测定。如图5b所示，在crgggt03和同时转化黄瓜mgd1的酿酒酵母invsc1中能检测到mgdg，dgdg，trigdg和tetragdg的质谱信号。

同时根据质谱产生的特征碎片离子的荷质比推算脂肪酸链的碳数和双键数，进行糖脂各组分的定性分析得到四种半乳糖脂的主要脂肪酸组成种类(参见表1所示)，共鉴定出9种mgdg，9种dgdg，8种trigdg和8种tetragdg。

表1共表达体系酵母中糖脂的主要脂肪酸组成种类

注释：m代表mgdg；d代表dgdg；t代表trigdg；te代表tetragdg。

综上，通过利用上述构建的酵母双载体共表达体系验证了crgggt03具有半乳糖基转移酶的功能。

(三)半乳糖基水解酶功能验证

以莱因衣藻cdna为模板，利用分别包含bamhi、hindiii限制性酶切位点引物和高保真聚合酶fastpfu进行pcr扩增出含有三个重复g4s氨基酸的连接肽linker和his6标签的目的基因片段(linker-crgggt03-his6)，随后用相应的限制性内切酶酶切后，利用t4dna连接酶将该片段与经双酶切的原核表达载体pmal-c5x连接，获得重组质粒pmal-crgggt03，载体构建示意图如图6所示。

上述分别包含bamhi、hindiii限制性酶切位点引物为：

正向引物：

5'-tcaggatccggaggaggtggatcaggaggaggtggatcaggaggaggtggatcaatgacgggctcgggcaagcccgcagcg-3'，

反向引物：

5'-tcaaagcttttaatggtgatggtgatgatgtccaatcgccaccatgcccaccgcctt-3'。

将该重组质粒转入到大肠杆菌bl21(de3)中，在30℃，200rpm下加入0.5mmiptg进行蛋白诱导表达12小时后离心收集细胞。经低温高压机械破碎后利用直链淀粉树脂亲和层析纯化含有mbp结合标签的crgggt03蛋白(～102kda)，随后进行体外的半乳糖基水解酶酶活实验。

实验中，选用对硝基苯-β-d-吡喃半乳糖苷为底物，该底物在半乳糖基水解酶的催化下可以生成黄色的对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率可以计算β-半乳糖苷酶的活性。反应过程为：

(1)标准液的配置：利用β-半乳糖苷酶试剂盒(solarbio，货号：bc2580)中的试剂二将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml。

(2)样本测定：在ep管中按照表2所示依次加入各反应体系组分，充分混匀后，放入37℃水浴反应30min。最后加入1000μl试剂三混匀后，400nm处测定吸光度a。计算δa＝a(测定)-a(对照)，并根据标准管的吸光度(x)和浓度(y,nmol/ml)建立标准曲线，将δa带入标准曲线中计算样品生成的产物量。

表2：β-半乳糖苷酶酶活反应体系

注：加入样本后迅速混匀，放入37℃水浴60min，随后加入其它溶液。

(3)酶活力计算：

酶活力单位定义为每mg蛋白每小时产生1nmol对硝基苯酚。

β-gal活力(nmol/h/mg)＝(y×v反应总)/(v样×cpr)/t

v反应总：反应体系总体积，0.5ml；v样：加入反应体系中样本体积；cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；t：反应时间，0.5h。

以纯化后的crgggt03以及含有mbp的空载蛋白设置不同的实验组，同时将标准品e.coliβ-galactosidase(sigma)作为阳性对照组。

结果如图7中a所示：随着反应体系中crgggt03蛋白含量的降低，产物对-硝基苯酚的颜色也逐渐变浅，而mbp对照组中均无对-硝基苯酚的生成，同时通过分光光度计测定反应后的溶液在400nm处的吸光度值，如图7中b所示，随着反应体系中crgggt03蛋白含量的降低，溶液的吸光度值od400呈现下降的趋势，而对照组吸光度值无明显的变化。上述实验结果表明：crgggt03具有β-半乳糖基水解酶的活性。

(四)在野生型莱茵衣藻cc400细胞中过表达crgggt03及其对细胞tag积累的影响

以莱因衣藻cdna为模板，利用分别包含ecori、bglii限制性酶切位点的引物和高保真聚合酶fastpfu进行pcr扩增crgggt03基因，扩增出cds基因片段；然后用相应的限制性内切酶酶切后，利用连接酶将该酶切后的片段与经双酶切的莱茵衣藻过表达载体pchlamy-4-yfp连接，获得重组质粒pchlamy-4-crgggt03-yfp；

其中，所述分别包含ecori、bglii限制性酶切位点的引物为:

正向引物:

5'-ttagaattcatgacgggctcgggcaagcccgcagcgaa-3'，

反向引物:

5'-taaagatcttccaatcgccaccatgcccaccgcctt-3'。

然后在莱茵衣藻cc400细胞中用玻璃珠法进行转化，步骤如下：

(1)挑取新鲜的cc400藻株于100ml含有tap液体培养基的锥形瓶中，在24℃，140r/min，50μem^-2s^-1条件下培养至对数生长期(对数生长期细胞数约为2×10⁶cells/ml)；

(2)在超净工作台中将藻液转入50ml无菌离心管。3000×g，离心2min，弃上清，收集藻类细胞，并用新鲜的tap液体培养基轻轻重悬沉淀，使细胞浓度达到2×10⁸cells/ml；

(3)将300μl重悬藻液与300mg高温灭菌干燥后的玻璃珠转到2ml圆底离心管中，然后加入1μg限制性内切酶scai线性化的crgggt03过表达载体，同时设置空载p4-yfp和负对照ddh2o；

(4)充分涡旋15s，停30s，重复3次后转至含有5mltap液体培养基的50ml无菌离心管中。22℃，100rpm下暗光复苏16h；

(5)2000rpm，离心3min后弃上清，收集藻细胞；

(6)用250μl液体tap培养基轻轻重悬藻细胞，并将藻液均匀涂布于含有10mg/l的博来霉素tap固体选择培养基中，随后置于光照培养箱中倒置培养一周直至可见单克隆微藻；

(7)挑取tap固体平板上的微藻单克隆于含有30μl6％的chelex100树脂中，100℃加热10min后，冰浴3min后，14000rpm离心1min，取2μl上清作为模板，并利用特异性引物扩增crgggt03的cdna序列对其进行pcr筛选，从而得到阳性的转化子，实验流程如图8所示。

随后通过实时荧光定量pcr测定候选crgggt03过表达阳性藻株在正常培养条件下crgggt03mrna的转录水平。经过筛选后，选取过表达藻株crgggt03oe-21和crgggt03oe-34为研究对象。细胞生长曲线的测定结果如图9中a图所示，crgggt03过表达藻株与对照藻株的生长速率相似。在正常培养第三天后，将微藻细胞转入tap缺氮培养基中培养，结果显示在缺氮胁迫前2天crgggt03过表达藻株与对照组相比细胞的生长也没有显著性区别。此外，在缺氮胁迫第二天过表达藻株crgggt03oe-21和crgggt03oe-34的细胞干重相比对照组分别提高了30.97％和39.80％(图9的b图)。

综上，过表达crgggt03不会对微藻细胞的生长造成明显的影响，在缺氮胁迫下crgggt03的过表达提高了细胞的生物质。

此外，实验进一步提取了缺氮胁迫培养第二天的阳性克隆子crgggt-oe-21、crgggt-oe-34和空载对照藻株的总脂，并利用薄层层析分离tag。随后进行转甲酯化反应，并利用gc-ms测定其tag的含量。

具体步骤为：以石油醚：乙醚：乙酸＝70:30:1(v/v/v)的混合液为展开剂，利用薄层层析的方法分离tag，碘熏20min后用刮刀刮取硅胶板上对应tag位置处的斑点，收集于gc上样小瓶中。随后加入200μl氯仿：甲醇(2:1，v/v)混合液，再加入300μl盐酸：甲醇(5:95，v/v)混合液，于85℃金属浴中静置加热1h，在室温冷却后加入1ml正己烷，充分振荡混匀后于室温静置2h。取200μl上层液转移至装有内插管的gc上样瓶中，并加入5μl200ppm十五烷，充分振荡混匀后，经gc-ms测定。气相色谱条件：

色谱柱：hp-88column(60m*0.25mm*0.2μm)；进样口：250℃；柱温：50℃保持2min，25℃/min升温到175℃，保持5min，7℃/min升温到210℃，保持2min，2℃/min升温到230℃，保持1min，分流比，20:1；ftd:h2:o2:n2＝40:400:30ml/min。

gc-ms实验结果显示，在缺氮胁迫下crgggt03-oe-21和crgggt03-oe-34中tag含量与空载对照组分别显著性地提高了35.25％和61.04％，达到细胞干重的6.49％和7.73％(图10)。以上实验结果表明：在缺氮胁迫下，衣藻中过表达crgggt03能提高显著提高细胞中tag的合成。

最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110>中国科学院（武汉）水生生物研究所

<120>半乳糖脂:半乳糖脂半乳糖基转移酶及其基因和应用

<141>2020-10-17

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>1527

<212>dna

<213>chlamydomonasreinhardtii

<400>2

atgacgggctcgggcaagcccgcagcgaataaggcgacggcaaacggcgatggcgagccg60

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aactggactcgcttcgccaagagccgctggcccttccgctcgttcggcgtgagcgctatc180

cgcgggaaatacaacatcgacaagtgcagtgacttctggaacaactatgagcgggacatc240

aagctggcggccgacatcggcagcaccaccttccgcttctccatcgagtgggctcgcatc300

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accctgccggacgacctggcgggcgtgcgggcggcggcgcggcaggtgcaggggcagctg1380

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165170175

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