一种环糊精基多孔淀粉及其制备方法

本发明涉及一种环糊精基多孔淀粉及其制备方法，尤其涉及一种交联复合酶解双重改性的环糊精基多孔淀粉制备技术，属于多孔淀粉技术领域。

背景技术：

多孔淀粉由于其表面丰富的孔隙、较大比表面积以及良好的吸附性和生物相容性，已被广泛应用于化学、制药、食品、环境等领域。多孔淀粉的制备方法包括物理、化学、生物和协同作用等方法。其中酶解法因其温和的反应条件、较高制样效率和底物特异性被广泛采用。然而多孔淀粉丰富的羟基结构使其具有良好的亲水性，这一特点限制了其对于疏水活性物质的负载能力，进而限制了多孔淀粉的应用领域。此外，多孔淀粉的孔隙结构使其稳定性下降，无法在一些温度较高、存在外部机械力的条件下得到良好应用。已有研究表明，多孔淀粉的交联改性可以通过形成淀粉分子间共价键来增强淀粉结构，但在提高淀粉稳定性的同时改善淀粉的疏水性仍然是多孔淀粉改性过程中亟需解决的问题，且部分疏水改性手段，如osa酯化改性会使淀粉的酶敏感性降低，使得酶解过程消耗的酶用量更多、时间更长。

β-环糊精由于其独特的内部疏水空腔，可与疏水性物质进行包合。但是单独作为输送载体存在高成本、难回收等问题。然而其亲水外壁丰富的羟基结构有良好的反应性，可与多种大分子载体材料进行化学改性，从而实现对环糊精分子的固定，改善其溶水难回收的缺陷，提高稳定性，同时增强改性材料疏水物质负载能力。

技术实现要素：

[技术问题]

现有的多孔淀粉存在稳定性差、疏水性物质负载能力差的问题。

[技术方案]

为了解决上述问题，本发明提供了一种环糊精基多孔淀粉的制备方法，本发明利用交联反应将淀粉与环糊精进行交联固载，充分保留了交联淀粉的颗粒态，改善了淀粉热稳定性及抗剪切性，同时提高了多孔淀粉对疏水性物质的负载能力。

首先，本发明提供了一种环糊精基多孔淀粉的制备方法，所述方法为以淀粉和β-环糊精为原料，经物料混合、调节体系反应环境、交联固载、洗涤、固液分离、干燥制备得到β-环糊精交联淀粉；将所得β-环糊精交联淀粉经酶解二次改性、固液分离、干燥制备得到环糊精基多孔淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤如下：

(1)物料混合：将淀粉分散于nacl溶液中，溶胀20～60min后，再加入β-环糊精，得到混合体系；

(2)调节体系反应条件：调节步骤(1)得到的混合体系的ph为4-10，反应温度为30-70℃；

(3)交联固载：将步骤(2)得到的预热厚的混合体系中搅拌下滴入环氧氯丙烷，于30-70℃温度下反应2-8h；

(4)初产物分离：调节体系ph结束反应，固液分离除去上清液后获得β-环糊精交联淀粉，洗涤、干燥；

(5)酶解改性：将步骤(4)所得β-环糊精交联淀粉分散于磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，预热后加入α-淀粉酶和糖化酶的复合酶液，于一定温度下进行酶解；

(6)终产物分离：调节体系ph终止酶解，固液分离除去上清液，洗涤、干燥后获得环糊精基多孔淀粉。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述淀粉为玉米淀粉，nacl溶液浓度为0.5-3g/100ml水，混合体系中淀粉的添加量为5-20g/100mlnacl溶液，所述淀粉与β-环糊精的质量比为10:0.2-10:1.2。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述环氧氯丙烷的添加量为0.5-3ml/100ml悬浮液(混合体系)。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，体系用浓度为0.5-3mol/l的hcl溶液将ph调节至6.5-7.5以结束反应；所述固液分离优选离心分析，离心参数为3000-4000rpm，5-15min；所述洗涤条件为50-65％乙醇溶液洗涤2-5次；所述干燥条件为45-55℃温度下保持10-14h，密封保存。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述β-环糊精交联淀粉酶解浓度为5％-40％，所述磷酸盐-柠檬酸缓冲液的ph为4～6；所述α-淀粉酶和糖化酶复合体积为1:1-1:5，加酶量相对于干基淀粉为0.1-5％(v/w，ml/g)，于40-55℃条件下酶解9-12h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中所述加入naoh调节体系ph，其中naoh溶液浓度为0.5-3mol/l，加入体积为3-5ml/50ml反应体系，所述离心分离条件为3500-4000rpm，10-15min，并用水洗涤2-5次，所述干燥条件为45-55℃温度下保持10-14h，密封保存。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的环糊精基多孔淀粉。

本发明还提供了上述环糊精基多孔淀粉在吸附疏水性物质中的应用。

有益效果：

本发明利用交联反应将淀粉与环糊精进行交联固载，反应条件温和，不会破坏淀粉晶型结构，充分保留了交联淀粉的颗粒态。交联使淀粉的热稳定性及抗剪切性得到明显改善，且这一特性在酶解后仍然得以保留，同时提高了多孔淀粉对疏水性物质的负载能力。此外，通过环糊精改性使得淀粉对酶的敏感性提高，可有效提高酶解效率，节省酶用量。

附图说明

图1为本发明实施例1所制备β-环糊精基多孔淀粉x射线衍射图。

图2为本发明实施例1所制备β-环糊精基多孔淀粉的扫描电镜图。

图3为本发明实施例1所制备β-环糊精基多孔淀粉及对比例1、2的粘度曲线。

图4为本发明实施例1和对比例1、对比例2的交联或溶胀条件下制得的β-环糊精交联淀粉、溶胀淀粉和淀粉交联淀粉以及原淀粉的酶敏感性对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作详细说明。

α-淀粉酶：800fau/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；糖化酶：100000u/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

实施例1

将10％(w/v，g/ml)的淀粉nacl溶液中充分溶胀后(nacl的浓度为1.5g/100ml水，溶胀30min)，加入4％(w/w，g/g淀粉)β-环糊精，调节体系ph为10，50℃条件下持续搅拌滴加1％(v/v，ml/ml)环氧氯丙烷，反应6h后，添加1mol/l的hcl溶液将ph调节至6.5-7.5结束反应，将悬浮液离心分离(3500rpm，10min)，并用50％乙醇溶液洗涤3次，沉淀在50℃条件干燥12h。将所制得β-环糊精交联淀粉分散于ph为4.6的磷酸盐-柠檬酸缓冲液配制底物浓度为20％(w/v，g/ml)的分散体系，加入0.5％(w/w，g/g，基于干淀粉)α-淀粉酶和糖化酶复合酶液(淀粉酶和糖化酶复合体积为1:3)，50℃条件下酶解11h，加入体积为5ml/50ml反应体系，浓度为1mol/l的naoh溶液终止酶解，离心(3500rpm，10min)并用去离子水洗涤沉淀，50℃条件干燥12h后密封保存。

吸附实验：准确称取0.5g环糊精基多孔淀粉样品于预先称重过的50ml离心管中，按1：10(w/v)的比例加入5ml大豆油，50℃条件下水浴振荡30min，使样品与大豆油进行充分吸附。吸附结束后，将混合物在3500rpm转速下离心10min，倾倒上清液至无多余油滴滴落，测量沉淀物重量。吸油性能计算公式如下：

吸油率(％)＝(m2-m1-m0)/m0×100％(1)

式中：m0—称取的环糊精基多孔淀粉质量，g；m1—离心管质量，g；m2—离心后沉淀于离心管总质量，g。

本实施例制备的β-环糊精基多孔淀粉对大豆油进行吸附，吸附量为316.28％。

本实施例制备的β-环糊精基多孔淀粉的x射线衍射图如图1所示，可以看出交联酶解后的多孔淀粉仍表现为玉米淀粉a-型衍射曲线，表明两次改性条件均不会破坏或改变淀粉晶型结构。

本实施例制备的β-环糊精基多孔淀粉的扫描电镜图如图2所示。可以观察到该多孔淀粉的形貌特征主要为球状或不规则状颗粒，有较多孔洞分布于颗粒表面，成孔效果良好，表明交联改性对后续酶解无不良影响。

本实施例制备的β-环糊精基多孔淀粉的粘度曲线如图3所示。可以看出β-环糊精基多孔淀粉的糊化曲线较为平坦，表明交联提高了淀粉结构的致密性，进而抑制其在水中的溶胀，同时淀粉糊的热稳定性和抗剪切性得到了显著改善，且有良好的冷糊稳定性。

实施例2

将10％(w/v，g/ml)的淀粉nacl溶液中充分溶胀后(nacl的浓度为1.5g/100ml水，溶胀30min)，加入8％(w/w，g/g淀粉)β-环糊精，调节体系ph为10，70℃条件下持续搅拌滴加1％(w/v，g/ml)环氧氯丙烷，反应4h后，添加1mol/l的hcl溶液将ph调节至6.5-7.5结束反应，将悬浮液离心分离(3500rpm，10min)，并用50％乙醇溶液洗涤3次，沉淀在50℃条件干燥12h。将所制得β-环糊精交联淀粉分散于ph为4.6的磷酸盐-柠檬酸缓冲液配制底物浓度为20％(w/v，g/ml)的分散体系，加入5％(w/w，g/g，基于干淀粉)α-淀粉酶和糖化酶复合酶液(淀粉酶和糖化酶复合体积为1:3)，50℃条件下酶解11h，加入体积为5ml/50ml反应体系，浓度为1mol/l的naoh溶液终止酶解，离心(3500rpm，10min)并用去离子水洗涤沉淀，50℃条件干燥12h后密封保存。

本实施例制备的β-环糊精基多孔淀粉对大豆油进行吸附，吸附实验同实施例1，吸附量为274.55％。

实施例3

将10％(w/v，g/ml)的淀粉nacl溶液中充分溶胀后(nacl的浓度为1.5g/100ml水，溶胀30min)，加入4％(w/w，g/g淀粉)β-环糊精，调节体系ph为8，50℃条件下持续搅拌滴加1％(w/v，g/ml)环氧氯丙烷，反应8h后，添加1mol/l的hcl溶液将ph调节至6.5-7.5结束反应，将悬浮液离心分离(3500rpm，10min)，并用50％乙醇溶液洗涤3次，沉淀在50℃条件干燥12h。将所制得β-环糊精交联淀粉分散于ph为4.6的磷酸盐-柠檬酸缓冲液配制底物浓度为20％(w/v，g/ml)的分散体系，加入5％(w/w，g/g，基于干淀粉)α-淀粉酶和糖化酶复合酶液(淀粉酶和糖化酶复合体积为1:3)，50℃条件下酶解11h，加入体积为5ml/50ml反应体系，浓度为1mol/l的naoh溶液终止酶解，离心(3500rpm，10min)并用去离子水洗涤沉淀，50℃条件干燥12h后密封保存。

本实施例制备的β-环糊精基多孔淀粉对大豆油进行吸附，吸附实验同实施例1，吸附量为272.81％。

对比例1

将10％(w/v，g/ml)的淀粉nacl溶液中充分溶胀后(nacl的浓度为1.5g/100ml水，溶胀30min)，调节体系ph为10，50℃条件下持续搅拌滴加1％(w/v，g/ml)环氧氯丙烷，反应6h后，添加1mol/l的hcl溶液将ph调节至6.5-7.5结束反应，将悬浮液离心分离(3500rpm，10min)，并用50％乙醇溶液洗涤3次，沉淀在50℃条件干燥12h。将所制得交联淀粉分散于ph为4.6的磷酸盐-柠檬酸缓冲液配制底物浓度为20％(w/v，g/ml)的分散体系，加入0.5％(w/w，g/g，基于干淀粉)α-淀粉酶和糖化酶复合酶液(淀粉酶和糖化酶复合体积为1:3)，50℃条件下酶解11h，加入体积为5ml/50ml反应体系，浓度为1mol/l的naoh溶液终止酶解，离心(3500rpm，10min)并用去离子水洗涤沉淀，50℃条件干燥12h后密封保存。

本对比例制备的多孔交联淀粉对大豆油进行吸附，吸附实验同实施例1，吸附量为233.32％。

本对比例制备的多孔交联淀粉的粘度曲线如图3所示。可以看出多孔交联淀粉的糊化曲线与实施例1中β-环糊精基多孔淀粉的粘度曲线相似，较为平坦，表明交联改性确实提高了淀粉结构的致密性，且改善了淀粉糊的热稳定性和抗剪切性。

对比例2

将10％(w/v，g/ml)的淀粉nacl溶液中充分溶胀后(nacl的浓度为1.5g/100ml水，溶胀30min)，加入4％(w/w，g/g淀粉)β-环糊精，调节体系ph为10，50℃条件下持续搅拌溶胀6h后，添加1mol/l的hcl溶液将ph调节至6.5-7.5，将悬浮液离心分离(3500rpm，10min)，并用50％乙醇溶液洗涤3次，沉淀在50℃条件干燥12h。将所制得溶胀淀粉分散于ph为4.6的磷酸盐-柠檬酸缓冲液配制底物浓度为20％(w/v，g/ml)的分散体系，加入0.5％(w/w，g/g，基于干淀粉)α-淀粉酶和糖化酶复合酶液(淀粉酶和糖化酶复合体积为1:3)，50℃条件下酶解11h，加入体积为5ml/50ml反应体系，浓度为1mol/l的naoh溶液终止酶解，离心(3500rpm，10min)并用去离子水洗涤沉淀，50℃条件干燥12h后密封保存。

本对比例制备的多孔溶胀淀粉对大豆油进行吸附，吸附实验同实施例1，吸附量为228.81％。

本对比例制备的多孔溶胀淀粉的粘度曲线如图3所示。可以看出多孔溶胀淀粉的糊化曲线与实施例1中的β-环糊精基多孔淀粉以及对比例1中的多孔交联淀粉的曲线形状相差较大，温度变化以及剪切搅拌过程中粘度出现明显变化，表明未交联改性的多孔淀粉更易吸水溶胀，热稳定性以及抗剪切性能较差。

对比例3

将10％(w/v，g/ml)的淀粉nacl溶液中充分溶胀后(nacl的浓度为1.5g/100ml水，溶胀30min)，加入2％(w/w，g/g淀粉)β-环糊精，调节体系ph为3，30℃条件下持续搅拌滴加1％(w/v，g/ml)环氧氯丙烷，反应2h后，添加1mol/l的hcl溶液将ph调节至6.5-7.5结束反应，将悬浮液离心分离(3500rpm，10min)，并用50％乙醇溶液洗涤3次，沉淀在50℃条件干燥12h。将所制得β-环糊精交联淀粉分散于ph为4.6的磷酸盐-柠檬酸缓冲液配制底物浓度为20％(w/v，g/ml)的分散体系，加入5％(w/w，g/g，基于干淀粉)α-淀粉酶和糖化酶复合酶液(淀粉酶和糖化酶复合体积为1:3)，50℃条件下酶解11h，加入体积为5ml/50ml反应体系，浓度为1mol/l的naoh溶液终止酶解，离心(3500rpm，10min)并用去离子水洗涤沉淀，50℃条件干燥12h后密封保存。

本实施例制备的β-环糊精基多孔淀粉对大豆油进行吸附，吸附实验同实施例1，吸附量为230.34％。

酶敏感性测试例：分别准确称取1.0g原淀粉以及分别在对比例1交联条件下、对比例2溶胀条件下和实施例1交联条件下制得的淀粉交联淀粉、溶胀淀粉和β-环糊精交联淀粉，并分散于5mlph为4.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，加入0.15mlα-淀粉酶和糖化酶复合酶液(淀粉酶和糖化酶复合体积为1:3)，50℃条件下酶解30min后，加入体积为0.5ml/5ml反应体系，浓度为1mol/l的naoh溶液终止酶解，3500rpm离心10min，测量酶解液体积，稀释一定倍数后，利用3,5-二硝基水杨酸(dns)法测定酶解液中葡萄糖含量，并以被水解的淀粉量表示样品酶敏感度，计算公式如下：

酶敏感度(％)＝0.9cv/m×100％(2)

式中：c—水解液中葡萄糖浓度，g/ml；v—水解液体积，ml；0.9—葡萄糖与淀粉的转化系数；m—投入淀粉量，g。

原淀粉以及分别在对比例1交联条件下、对比例2溶胀条件下和实施例1交联条件下制得的淀粉交联淀粉、溶胀淀粉和β-环糊精交联淀粉的酶敏感性如图4所示。可知与原淀粉相比，淀粉交联淀粉、溶胀淀粉和β-环糊精交联淀粉的酶敏感度均有显著提升。淀粉酶通过其非催化位点与淀粉表面的亲和吸附作用而实现进一步水解。加热、碱性条件下，淀粉颗粒充分水合溶胀，暴露出更多可与酶结合的位点，提高了酶的可及性。此外，交联过程中β-cd的引入进一步增加了淀粉对酶的敏感度。其原因为β-cd也可以与淀粉酶的相关亲和位点实现吸附作用，增加了淀粉酶与淀粉的接触。而随着糖化酶的随机内切作用，为α-淀粉酶提供了新的非还原末端，向颗粒内部持续深入酶解，提高了酶解的效率。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。