DH5 α感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆扩增培养，PCR、酶切鉴定正确后，送交上海Invitrogen公司测序，将含有正确连接片段的重组质粒命名为pEGFP-hTERT，进而将重组体转化感受态大肠杆菌，涂于含卡纳的固体培养基平板上培养，随机挑取白色菌落接种于含氨苄的LB液体培养基中，摇床培养16h，小量提取质粒。
[0100]3.重组质粒pEGFP-hTERT双酶切鉴定
[0101]所得重组真核表达质粒经内切酶EcoR I和BamH I双酶切得到与目的基因约
3.5kb及载体约5.3kb大小一致的两个片段，结果显示重组质粒构建正确，双酶切鉴定图谱见图6。得到的重组质粒pEGFP-hTERT和空白质粒pIRES2_EGFP用去内毒素质粒大提试剂盒(Omega)的步骤大量提取重组质粒，测浓度后置于_20°C备用。
[0102](三)重组质粒pEGFP-hTERT转染获得永生化犬细支气管上皮细胞
[0103]1.采用LipofectaminTM转染试剂，选取生长状态良好传至第三代的原代犬细支气管上皮细胞，在24孔板中以I X 15Cell/孔的密度接种，待细胞汇合度达80 %后可进行转染，转染前将细胞更换新鲜的无抗生素无血清培养基；
[0104]2.配制如下两种溶液:
[0105]溶液A:重组质粒pEGFP-hTERT(试验组)、1 μ g pIRES2_EGFP(阴性对照组)以及I μ L的转染试剂(空白对照组)分别稀释到50 μ L opt1-MEM(Gibico)中；重组质粒设置 5 个浓度梯度，分别为 0.5 μ g/50 μ L, I μ g/50 μ L, 1.5 μ g/50 μ L，2 μ g/50 μ L 和2.5 μ g/50 μ L，故试验组共5个EP管，阴性对照组I个和空白对照组I个，总共7个EP管。
[0106]溶液B:另取7个EP管，各取IyL LipofectaminTM稀释到50 μ Lopt1-MEM(Gibico)中；
[0107]3.将溶液A用200 μ L移液枪轻轻吹打混匀后加入溶液B，使溶液A和B混合，使质粒DNA与LipofectaminTM转染试剂分别按0.5:1，1:1，1.5:1，2:1以及2.5:1比例混合，切忌震荡或剧烈晃动。室温静置5min。
[0108]4.小心吸取混合液一滴滴加入无抗生素无血清培养基的24孔细胞板中，放入37°C细胞培养箱，静置培养24h后，于荧光倒置显微镜下检查质粒表达情况。因重组质粒带有EGFP(绿色荧光蛋白)基因，可作为标签蛋白检查重组质粒是否成功转染。
[0109]结果发现利用LipofectaminTM转染试剂转染犬原代细支气管上皮细胞时pEGFP-hTERT 与 LipofectaminTM 的最佳比例为 2:1。
[0110]转染成功后的细胞，经胰酶消化后收集，继续传代培养，共获得转染成功的永生化细胞株6株，且均能稳定传代。图7显示的是转染后培养至第5代和第20代的犬细支气管上皮细胞在荧光显微镜下拍摄的图片，发现转染后随着代次的增加荧光并没有减少，荧光强度和数量均基本一致。
[0111]第20代的犬细支气管上皮细胞，参照如上方法，经间接免疫荧光试验检测角蛋白18，结果与原代细胞的结果一致。
[0112]综上所述，本发明提供了一种通过转染端粒酶基因而获得永生化的犬细支气管上皮细胞，其创新性主要体现在:1.永生化的犬细支气管上皮细胞保持了原代细支气管上皮细胞的特性，为研宄犬类病原感染的致病机理提供了重要的实验材料；2.用差速贴壁及胰酶和胶原酶消化的方法获得纯度很高的原代犬细支气管上皮细胞，并成功得以传代；3.通过转染端粒酶基因获得的永生化犬细支气管上皮细胞，克服了原代细胞增殖能力十分有限的缺点，为研宄犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的实验材料，具有很好的实用价值。
【主权项】
1.一种犬原代细支气管上皮细胞，该细胞株CBEl于2014年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC:C2014223，分类命名:犬原代细支气管上皮细胞。
2.权利要求1所述犬原代细支气管上皮细胞的应用。
3.权利要求1所述犬原代细支气管上皮细胞在制备永生化犬细支气管上皮细胞中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于:权利要求1所述犬原代细支气管上皮细胞通过转染端粒酶真核表达载体获得永生化的犬细支气管上皮细胞。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于: 1)真核表达载体重组质粒pEGFP-hTERT的构建 按照质粒DNA小提中量纯化试剂盒步骤提取质粒PC1-neo-hTERT，经质量比I %琼脂糖凝胶电泳检测鉴定正确后用EcoR I和Sal I双酶切重组质粒，利用小量胶回收试剂盒纯化回收3.5kb的片段，即为hTERT ； 用EcoR I和Sal I双酶切荧光真核表达载体PIRES2-EGFP，酶切片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，与hTERT按摩尔比4:1的比例加入目的片段和载体，然后加入IuLT4DNALigase，配制10 μ L连接体系，混匀后于PCR仪16°C过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆扩增培养，PCR、酶切鉴定正确后，送交上海Invitrogen公司测序，将含有正确连接片段的重组质粒命名为pEGFP-hTERT，进而将重组质粒pEGFP-hTERT转化感受态大肠杆菌，涂于含卡那的固体培养基平板上培养，随机挑取白色菌落接种于含氨苄的LB液体培养基中，摇床培养16h，小量提取质粒pEGFP-hTERT； 2)重组质粒pEGFP-hTERT双酶切鉴定 所得重组质粒pEGFP-hTERT经内切酶EcoR I和BamH I双酶切得到与目的基因约3.5kb及载体约5.3kb大小一致的两个片段，得到的重组质粒pEGFP-hTERT和空白质粒PIRES2-EGFP用去内毒素质粒大提试剂盒所述的步骤大量提取重组质粒，测浓度后置于-20°C备用； 3)重组质粒pEGFP-hTERT转染获得永生化犬细支气管上皮细胞 采用LipofectaminTM转染试剂，取权利要求1所述的原代犬细支气管上皮细胞，在24孔板中以IX 15Cell/孔的密度接种，待细胞汇合度达80%后进行转染，转染前将细胞更换新鲜的无抗生素无血清培养基；将重组质粒pEGFP-hTERT 2 μ g与LipofectaminTM转染试剂I μ L，分别稀释至50 μ L opt1-MEM中，然后混合，并室温静置5min。吸取混合液I滴，滴加入无抗生素无血清培养基的24孔细胞板中，37°C细胞培养箱静置培养24h，获得转染成功的永生化犬细支气管上皮细胞。
【专利摘要】本发明提供了一种犬原代细支气管上皮细胞及其在制备永生化细胞中的应用，属于生物技术领域。所述犬原代细支气管上皮细胞，取至45日龄的清洁级雄性比格犬。分离犬气管组织，剪碎后加入胶原酶及胰酶消化，得到完整的细支气管组织后培养所获细胞进一步通过间接免疫荧光试验检测角蛋白18表达，证实成功获得犬原代细支气管上皮细胞。构建含端粒酶基因（hTERT）的真核表达载体pEGFP-hTERT，转染犬原代细支气管上皮细胞后，hTERT基因高表达，细支气管上皮细胞能够稳定传代培养至少20代。本发明制备的犬永生化细支气管上皮细胞，为研究犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的生物材料。CCTCC No: C201422320141202
【IPC分类】C12N15-70, C12N5-071, C12N15-66
【公开号】CN104531607
【申请号】CN201410836765
【发明人】刘永杰, 谢星, 庞茂达, 郁磊, 林焱, 赵艳兵, 梁姗, 马可
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月29日