上清液即为粗 酶液；
[0029] (7)根据不同需要和使用对象不同，还可W将（6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离 纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡萄糖氧化酶制剂。
[0030] 实施例2
[0031] (1)培养基制备
[0032] ①菌种活化培养基；蛋白腺10.0 g，酵母膏5. Og，化C1 10.0 g，琼脂20.0 g，蒸馈水 l.OL抑值为自然，于103kpa、12rC高压蒸气灭菌30min;
[0033] ②菌种低温驯化培养基；葡萄糖25. Og，蛋白腺3. Og，（NH4)2S042. 5g，CaC〇33. Og，pH 值为自然，于103kpa、12rC高压蒸气灭菌30min ;
[0034] ⑨液体种子培养基：蛋白腺10.0 g，牛肉膏5. Og，化Cl 10.0 g，抑值为自然，于 103kpa、121°C高压蒸气灭菌30min ;
[003引④液体产酶培养基：葡萄糖80.0 g，蛋白腺3. Og，KH2PO4 1. 6g，M拆04 ?%0 0. 7g，KCl 0. 6g,抑值为 5. 6,于 103kpa、12rC高压蒸气灭菌 30min;
[0036] (2)将产生葡萄糖氧化酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中屯、（CGMCC) 提供的菌株说明进行初始活化；
[0037] 做将城活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 25°C - 22°C - 20°C - 18°C - 16°C - 14°C一 12°C - 10°C，驯化 8 天左右，使其在低温环境 中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；
[003引 （4)按常规方法将低温驯化后的葡萄糖氧化酶产生菌在液体种子培养基中12~ 14°C培养48~7化后，按5vt %的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种 子；
[0039] (5)将（4)制备的二级种子按发酵液体积5~7%的接种量接入50L的产酶培养 基中，在12~14°C培养96~12化时，即微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶结束；
[0040] (6)将巧）的发酵液在4, 000~8, 000巧m离屯、收集液体，收集到的上清液即为粗 酶液；
[0041] (7)根据不同需要和使用对象不同，还可W将（6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离 纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡萄糖氧化酶制剂。
[0042] 实施例3
[00创 （1)、培养基制备
[0044] ①菌种活化培养基；蛋白腺10.0 g，酵母膏5. Og，化C1 10.0 g，琼脂20.0 g，蒸馈水 1. 抑值为自然，于103kpa、121°C高压蒸气灭菌30min ;
[0045] ②菌种低温驯化培养基：葡萄糖50.0 g，蛋白腺5. Og，（畑4) 2SO4 3. Og，CaC〇3 5. Og,抑值为自然，于103kpa、121°C高压蒸气灭菌30min ;
[0046] ⑨液体种子培养基：蛋白腺12.0g，牛肉膏7.0g，NaCl ll.Og，抑值自然，121°C高 压蒸气灭菌30min ;
[0047] ④产酶培养基：葡萄糖 85. Og，蛋白腺 5. Og，KH2PO4 2. Og，M拆O4 ? 7&0 0. 8g，KC1 0. 6g,抑值为5. 6,于103kpa、121°C高压蒸气灭菌30min ;
[0048] (2)将产生葡萄糖氧化酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中屯、（CGMCC) 提供的菌株说明进行初始活化；
[0049] (3)将（2)活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 25°C - 22°C - 20°C - 18°C - 16°C - 14°C一 12°C - 10°C，驯化 8 天左右，使其在低温环境 中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；
[0化0] (4)按常规方法将低温驯化后的葡萄糖氧化酶产生菌在液体种子培养基于14~ 16°C培养48~72h后，按5vt%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种 子；
[0化1] (5)将（4)制备的二级种子按发酵液体积7~9%的接种量接入10化的产酶培养 基中，在14~16°C培养72~9化时，即微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶结束；
[0化2] (6)将巧）的发酵液在4, 000~8, 000巧m离屯、收集液体，收集到的上清液即为粗 酶液；
[0化3] (7)根据不同需要和使用对象不同，还可W将（6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离 纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡萄糖氧化酶制剂。
[0054] 按实施例1、2和3的方法制得的低温葡萄糖氧化酶，平均酶活性为800U/ml，经浓 缩、分离和纯化得到活性为lOOOU/ml或lOOOU/g的低温葡萄糖氧化酶，按0. 01%。~0. 5%。 的量，应用于动物饲料、食品加工和医药检测等领域中，在8~25°C条件下处理0. 5~2小 时，具体内容请详见表1。
[0化5] 表1低温葡萄糖氧化酶应用实例
[0化6]
【主权项】
1. 海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将能产生葡萄糖氧化酶的菌种先活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 25°C - 22°C - 20°C- 18°C- 16°C- 14°C- 12°C- 10°C，使其在低温环境中生长良好，当 菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基为：葡萄糖20.0 ~50.0 g， 蛋白胨 I. 0 ~5. 0g，（NH4)2S042. 0 ~3. 0g，CaC03l. 0 ~5. 0g，pH 值为自然，于 103kpa、121°C 高压蒸气灭菌30min ; 所述的能产生葡萄糖氧化酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心（CGMCC)，菌种编号：L 10601或L 6446或L 10904 ; (2) 按常规方法将步骤（1)中低温驯化后的葡萄糖氧化酶产生菌在液体种子培养基中 于10~16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基为： 蛋白胨7.0~12. Og,牛肉膏2.0~7. 0g，NaCl 8.0~11. 0g，pH值为自然，于103kpa、 121°C高压蒸气灭菌30min。 (3) 将液体二级种子按发酵液体积3~9%的接种量接入液体产酶培养基中，在10~ 16°C培养72~144h时，即海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶结束；所述的液体产酶培 养基为：葡萄糖 75. 0 ~85. Og,蛋白胨 I. 0 ~5. 0g，KH2PO4L 4 ~2. 0g，MgSO4 · 7H20 0· 7 ~ 0.8g，KCl 0.2 ~0.6g，pH 值为 5.6，于 103kpa、121°C 高压蒸气灭菌 30min。 (4) 将（3)的发酵液在4, 000~8, OOOrpm离心收集液体，收集到的上清液即为粗酶液。 (5) 根据不同需要和使用对象不同，还可以将（4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯 化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡萄糖氧化酶制剂。
2. 根据权利要求1所述的海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在 于，步骤（1)中产生葡萄糖氧化酶的菌种活化培养基为：蛋白胨10. 〇g，酵母膏5. 0g，NaCl 10.0 g,琼脂20. 0g，蒸馏水I. 0L，pH值为自然，于103kpa、121°C高压蒸气灭菌30min。
【专利摘要】本发明涉及海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，具体为将产生葡萄糖氧化酶菌种活化，再经过逐级低温驯化，使菌种在低温环境中生长良好，将低温驯化后的葡萄糖氧化酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接种于液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，得低温葡萄糖氧化酶，收集到的粗酶液根据不同需要和使用对象不同，进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明生产的低温葡萄糖氧化酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可简化加工工艺，缩短加工时间，降低生产成本，提高生产效率，改善并提高产品质量；该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、具有更广阔的工业开发价值与市场应用优势。
【IPC分类】C12N9-04
【公开号】CN104630167
【申请号】CN201510084670
【发明人】王晓辉, 李晓艳, 窦少华, 于爽, 张庆芳, 迟乃玉, 王强, 张旭姣, 金连豆
【申请人】大连大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月16日