一种共价偶联剂及含该共价偶联剂的化学修饰共价偶联固相载体及该载体的制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫检测技术领域，特别是指一种共价偶联剂，本发明还涉及一种化学修饰共价偶联固相载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]塑料、纤维素膜或者玻璃等多种物质可作为固相材料，但通常聚苯乙烯塑料由于具有优良的光学透明性、较高的蛋白吸附性能、良好的加工工艺性以及低廉的价格而得到广泛的应用。对于聚苯乙烯塑料，主链结构为碳链，侧链带有非极性基团，因此由它形成的固相表面呈憎水性。固相的外形也可多样化，能制成试管、微孔板、内嵌六角柱、微球、膜等形状。具体选择什么形状要依据特定免疫分析的要求而定，但总的是以增大固相比表面和提高免疫反应速率为原则。
[0003]早期以及现在的固相分离技术大多是利用物理吸附原理，使结合标记物仅能依靠疏水键的作用吸附在固相表面从而与游离标记物产生分离，我们称之为固相物理吸附技术，这方面技术较为成熟。
[0004]固相材料和免疫分析中的生物活性分子大多为分子量较高的化合物。一般而言，大分子间存在着四种相互作用:范德华力(包括氢键)、离子键、疏水键和共价键。
[0005](I)范德华力是大分子间由于定向、诱导和分散效应而产生的相互作用，它是一种很弱的作用力，而且随非共价键键合原子或分子间距的六次方倒数即1/R6而变化。
[0006](2)离子键是正、负电荷之间的一种静电吸引作用.但在水溶液中带电离子更倾向于与水分子形成水合离子，因此它们间的离子键大大削弱。
[0007](3)疏水键是非极性基团为避开水相而群集在一起的作用力。蛋白质分子中合有多种带非极性倒链的氨基酸残基.这些疏水性倒链间以及它们与蛋白质主链骨架的a-CH基问倾向于形成疏水键。普遍认为，免疫分析体系中蛋白质在无共价键与固相材料结合的情况下，疏水键是其吸附于疏水性固相表面(如PS表面)的主要作用力。但是对于亲永性的生物分子，由于它们与溶液中水分子形成氢键的作用力要大于靠疏水键与固相的作用力，因而难以吸附在憎水性固相表面；同样对于小分子生物活性分子，由于它们分子量小形成疏水键的可能性大大降低.因此在固相表面吸附也比较困难。
[0008](4)共价键是依靠不同分子间活性基团的化学反应产生的强相互作用力。只要带有合适的活性基团，大分子、小分子和亲水性生物活性分子都能通过共价键牢固地结合在固相表面。这点对于小分子物质更具有重要意义，因为共价键可能是它们与固相间直接且穗定结合的唯一途径。
[0009]对比这四种相互作用，不难发现，在免疫分析体系中，固相与生物活性分子难以通过范德华力和离子键产生结合，而且由疏水键产生的吸附作用其局限是明显的.所以共价键成为固相与生物活性分子结合的最好选择。另一方面，由于生物活性分子及其特点的分析可知，大多数作为免疫分析试剂的生物分子都有-NH2、-COOH或-SH等活性基团，这为它们与固相间共价偶联提供了可能和必要条件。
[0010]近十几年来，随着免疫分析技术的不断发展，越来越多的小分子或亲水性生物物质，如多肽、半抗原、多糖或者多聚核苷酸成为免疫分析试剂，而这些生物分子很难或者根本不能靠物理作用吸附在塑料固相表面，因此依靠物理吸附的分离方法已不能满足免疫分析技术的新发展和新要求，寻求利用共价键将生物分子与固相材料牢固地结合成为一个重要的选择，固相化学偶联技术在免疫分析实践中应运而生。
[0011]固相化学偶联技术的重点在于先用化学或物理方法使固相表面产生合适的活性基团，然后再通过特定方式让生物活性分子以共价键连接在固相表面，它包括两方面的内容:固相材料合成/表面改性技术和生物活性分子在固相表面倡联技术。该技术涉及到免疫学、高分子材料科学、生物化学和有机化学等多种学科的知识。
[0012]早在多肽和多聚棱苷酸的固相合成中就已提出和应用，例如表面化学修饰的聚苯乙烯颗粒作为固相合成的载体，但这些方法大多使用毒性很大的化学试剂且操作步骤繁琐复杂，同时聚苯乙烯在所用的溶液中溶胀，其光学性能(透明性)大大降低，显然这些方法不适于用在免疫分析领域中。所以国外研究者从70年代就开始寻求新的化学偶联方法用于免疫分析实践中.至今已取得很大进展。
[0013]如何在固相表面引入合适的活性基团是固相化学偶联技术首要解决的问题，也是难度较大的一步。一个发展方向是采用固相材料的合成改性技术，选择带有活性基团的单体进行均聚合或共聚合反应可以合成人们所期待性能的固相材料。高分子材料合成的可设计性为固相化学偶联技术提供了广阔的发展空间，合成改性是该领域中最有前途的方法之一。美国Seradyn公司用苯乙烯和丙烯酸进行乳液聚合生产出表面羧基修饰的微球(商名为CM-MP)。该微球与普通聚苯乙烯微球折射率相同，并且根据添加单体配比的不同.羧基在微球表面的比例可从5%?100%的改变。用永溶性的碳化二亚胺将微球上的羧基活化，再与蛋白质的氨基反应生成酰胺键，最终将蛋白质固定在固相表面。
[0014]另一个发展方向是固相材料的表面改性，主要有以下几种方式:
[0015](I)光化学表面改性:丹麦NUNC公司的专利产品Covalink NH标准板就是将光化学反应对象苯乙烯塑料表面进行改性而得到。该产品中仲胺基团通过2nm长的“空间臂”连接在固相表面，并且“空间臂“在固相表面的(面)密度为1014/cm2。Covalink NH表面的仲胺基不同于其他高活性基团，既有足够高的活性又能保持一定的稳定性，所以它既可与生物活性分子共价结合又能将非特异性结合降至最低。另外，由于蛋白质分子通过足够长的“空间臂”与固相表面相连，这样就能避免蛋白质失活问题的出现。在使用该产品时，生物活性分子的羧基通过水溶性碳化二亚胺(EDC)的活化作用后再与Covalink NH的仲胺反应，最终连接在固相表面。
[0016]Covalink NH标准板的制备:先用8 —甲氧基补骨脂素经过有机合成反应，连接上“空间臂”和仲胺基团得到补骨脂素衍生复合物，然后再将此复合物在波长大于350nm的紫外光下照射数小时可得最终产品.
[0017](2)辐射改性:由于Y射线具有很强的穿透性和引起分子电离的能力，故可用它对固相材料进行辐射改性。用Co6tl作为辐射源将乙烯基单体，如丁烯酸、丙烯酸等，辐射接枝在聚苯乙烯表面上，从而在固相表面引入羧基活性基团，再用水溶性碳化二亚胺将蛋白质结合在固相上。用Y射线将酰肼基团辐射接技在固相表面，再使酰肼基团与蛋白质的羧基相连。未有充分的证据说明固相表面辐射改性导致蛋白质主要靠共价键与辐射改性的固相表面相连。Y射线可引起塑料分子电离从而产生大量次级电子，大部分次级电子均能引起物质内部发生一系列物理和化学变化，使固相内部和表面产生大量极性或化学活性基团。所以蛋白质吸附在固相表面，可能是物理作用和共价键共同作用的结果。生物活性分子在辐射改性的固相表面的吸附机制仍需进一步探讨。
[0018](3)化学方法表面改性:此方法使用一些化学试剂对固相材料表面进行处理，使其带上某些活性基团。一是重氮化化学改性法:对聚苯乙烯塑料管用发烟硝酸和冰醋酸处理，在苯环上发生硝化，再加入硫代硫酸钠还原成氨基聚苯乙烯，最后苯环上的氨基与亚硝酸反应得到重氮化聚苯乙烯活化的塑料试管。当向管内加入IgG抗体，其氨基酸残基上的酚羟基与固相表面结合。由于此方法过于苛刻，所以较少使用。美国Xenopore公司使用一独特湿法处理过程开发出一种能一步共价连接的免疫分析板(商品名为Xenobind)。该产品表面无须添加任何偶联剂或活化剂而直接与蛋白质或多肽分子的氨基共价相连。这种方法是目前文献中所报道的效果最好的表面化学改性方法，但该公司对此技术保密甚严，无专利和较为详细资料可查阅。
[0019](4)表面涂层改性:此方法指在固相表面覆盖一层具有活性基团或良好吸附性能的涂层。采用PVLA(氨基内酯聚苯乙烯)法:由于PVLA具有两亲性，一方面它作为聚苯乙烯的衍生物可通过物理作用牢固地吸附在疏永性的聚苯乙烯固相表面，另一方面它的氨基内酯可由高碘酸氧化产生醛基，而蛋白质的氨基能在较温和条件下与PVLA上所产生的醛基发生反应，最终蛋白质通过PVLA固