;为解淀粉芽抱杆菌S76-3发酵上清稀释50倍后对镶刀菌5035菌丝的抑制 作用。图7中的A是YPG培养基中的菌体经S76-3发酵上清液处理后，镶刀菌菌丝顶端膨 大，图7中的B是YPG培养基中未经S76-3发酵上清液处理的镶刀菌菌丝正常生长。图上 的标尺为50 ym。
[0027] 图8 ;为解淀粉芽抱杆菌S76-3发酵液防治小麦赤霉病的田间小区试验效果图。图 8中的"S76-3菌剂"是小麦（安农845W始花期喷洒S76-3发酵稀释液后的小麦发病情况， 图8中的"水对照"是始花期喷洒自来水后小麦的发病状况，图8中的"多菌灵"是始花期 喷洒商品化的多菌灵可湿性粉剂（按750g/公顷的用量使用）的小麦发病状况。
【具体实施方式】
[002引实施例1括抗菌株的分离与筛选
[0029] 本发明设及括抗菌分离材料采自于中国湖北省武汉市狮子山地区华中农业大学 多年连续种植小麦的麦田，选取赤霉病发病严重的小麦田中的发病较轻的小麦麦穗进行括 抗菌的分离。收集新鲜麦穗用自来水冲洗2-4遍，之后用灭菌的剪刀切成3-5mm碎块置于 研鉢中，按照每个麦穗加入10ml无菌水后研磨成匀浆，吸取1ml匀浆，采用10倍体积比例 依次稀释至1〇^1〇人1〇入得到含菌稀释液，取1(T6稀释浓度的100 y 1含菌稀释液涂布于 PDA平板上，每个处理S个重复，28°C培养2化后，挑取表型差异的单菌落划线培养于NA培 养基。通过分析，将该分离的菌株初步鉴定为芽抱杆菌。
[0030] 括抗菌S76-3的筛选采用平皿对時培养。禾谷镶刀菌（分离自武汉赤霉病发病麦 穗）接种于PDA培养基（培养基配方见表3)表面。28°C培养3天制备新鲜菌丝。用5mm 打孔器取新鲜禾谷镶刀菌菌丝块，接种于PDA平板中央。同时在其四周3cm处等距的S点 分别接种培养2化的细菌单菌落，W只接种禾谷镶刀菌菌丝块的PDA平板为对照，每个处理 重复=次。所有处理于28°C下培养5天，检测供试菌株的抑菌率。经过上述筛选，获得一株 对禾谷镶刀菌具有明显括抗作用的菌株S76-3 (图2)，其抑菌率达62 %，抑菌圈清晰且边缘 整齐，抑菌效果明显。
[0031] 实施例2括抗菌株S76-3的菌学鉴定
[0032] (1) S76-3菌株的形态学鉴定
[0033] 将S76-3菌株于NA培养基培养4她后，可见NA培养基上菌落为乳白色，边缘为不 规则形，菌落表面粗趟，不透明，菌落粘稠且呈權皱状突起（见图1)。革兰氏染色为阳性，有 内生芽抱。扫描电子显微镜观察表明，菌体呈短杆状（见图3)，透射电子显微镜观察表明， 该菌株鞭毛周生（见图4)。
[0034] (2) S76-3的分子生物学鉴定
[003引 将S76-3菌株于NB培养基培养4她后，采用lOmM的tris-HCl (购自Amresco公 司产品）和ImM的邸TA(购自Mbio公司产品）提取方法（de Silva et al. 1998)提取基 因组DM,提取后用苯酪-氯仿-异戊醇（25:24:1)抽提和T邸溶解。利用特异性引物扩增 16s rDNA并送华大公司进行测序。测序序列长度为1447bp，序列编号为SEQ ID NO. 1。
[0036] 测序引物的DM序列；
[0037] les rDNA(正向引物）；AGAGTTTGATCCTGGCTC
[0038] 16S rDNA(反向引物）；AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
[0039] 在Genbank数据库中，将S76-3菌株的16s rDNA序列采用BLAST检索，发现其与 解淀粉芽抱杆菌与枯草芽抱杆菌属内菌株相似度较高，为进一步确定该菌株的遗传特性， 选取匹配结果中相似度大于95%的菌株13株构建系统发育树（见5)。
[0040] (3) S76-3菌株的生理生化试验
[0041] S76-3菌株生理生化结果显示；革兰氏染色呈阳性，明胶液化、牛奶腺化、淀粉水 解、TweenSO水解、纤维素利用、巧樣酸盐产碱试验均为阳性，产&S试验为阴性，能够利用 葡萄糖、果糖、庶糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、麦芽糖、肌醇、山梨醇产酸，不能利用鼠 李糖产酸，对5 % -7 %的化C1具有耐受性，对10 %的化C1不具有耐受性，在51°C下不能生 长。
[0042] 表1S76-3菌株的生理生化试验
[0043]
【主权项】
1. 一株对小麦赤霉病具有抗性的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌 株S76-3,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:M2014315,它的16S rDNA 的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示。
2. -种适用于权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌S76-3的发酵培养基，其特征在于， 所述的发酵培养基组成如下：红糖23.3g/L，豆粉ll.lg/L，CaC0 3 4. 9g/L，KN03 8g/L，KH2P04 0? 5g/L，K2HP04 1. 2g/L，MgS04 ? 7H20 5g/L，NaCl 3g/L，补充蒸馏水至 1L，培养基的 pH = 7. 2。
3. -种防治小麦赤霉病的微生物菌剂，其特征在于该菌剂包含有保藏号为CCTCC NO : M2014315 的解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) S76-3 菌株。
4. 权利要求1所述的对小麦赤霉病具有抗性的解淀粉芽孢杆菌S76-3菌株在防治小麦 赤霉病中的应用。
5. 权利要求1所述的对小麦赤霉病具有抗性的解淀粉芽孢杆菌S76-3菌株在制备防治 小麦赤霉病微生物制剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于植物病害防治技术领域，涉及一株防治小麦赤霉病的解淀粉芽孢杆菌菌株的及其应用。本发明分离的解淀粉芽孢杆菌S76-3，保藏号为CCTCC NO：M2014315；其16S rDNA的核苷酸如SEQ ID NO：1所示。公开了该菌株的分离、鉴定、广谱抑菌作用、芽孢产量发酵优化以及在防治小麦赤霉病的田间应用。本发明的解淀粉芽孢杆菌发酵稀释液的液体菌剂可以有效的抑制田间小麦赤霉病的发生和危害，减少了麦穗中毒素的产生。该菌株的抗逆性强，菌剂对环境危害少，可作高效生防菌剂，本发明的解淀粉芽孢杆菌抑菌谱广，可抑制包括禾谷镰刀菌在内的10种植物病原真菌的生长，具有良好的开发和应用前景。CCTCC NO：M 201431520140703
【IPC分类】C12R1-07, A01P3-00, A01N63-00, C12N1-20
【公开号】CN104673705
【申请号】CN201410778424
【发明人】廖玉才, 宫安东, 李和平, 张静柏
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2014年12月15日