蜘蛛丝蛋白薄膜及其制备方法_2

文档序号:8399035阅读:来源:国知局
所使用的六氟 异丙醇(HFIP)的沸点59°C、六氟丙酮(HFAc)的沸点-26. 5°C相比,DMSO的沸点要高出很 多。另外,DMSO也在一般产业领域中作为丙烯酸纤维的聚合、纺丝液使用,还作为聚酰亚胺 的聚合溶剂使用,因此DMSO是低成本且确认了安全性的溶剂。
[0021] 本发明的蛋白质为源自蜘蛛丝蛋白的多肽。源自蜘蛛丝蛋白的多肽是指,只要为 源自或类似天然型蜘蛛丝蛋白的物质即可,没有特别限定。所述源自蜘蛛丝蛋白的多肽,从 强韧性优异的观点考虑,优选为源自蜘蛛的大壶状腺产生的大吐丝器牵引丝蛋白的多肽。 作为上述大吐丝器牵引丝蛋白,可举出源自络新妇蛛((Nephila clavipes)的大壶状腺蜘 蛛丝蛋白(8口丨(11'〇;[11)]\^3口1、]\^3口2,源自十字园蛛(4四116118(1丨3(161]^1:118)的40?3、40?4等 。
[0022] 所述重组蜘蛛丝蛋白还可为源自蜘蛛的小壶状腺产生的小吐丝器牵引丝的重组 蜘蛛丝蛋白。作为上述小吐丝器牵引丝蛋白,可举出源自络新妇蛛(Nephila clavipes)的 小壶状腺蜘蛛丝蛋白MiSpl、MiSp2。
[0023] 除此以外,上述重组蜘蛛丝蛋白还可为源自蜘蛛的鞭状腺(flagelliform gland) 产生的炜丝蛋白的重组蜘蛛丝蛋白。作为上述炜丝蛋白质,例如可举出源自络新妇蛛 (Nephila clavipes)的鞭毛状丝蛋白(flagelliform silk protein)等。
[0024] 作为源自所述大吐丝器牵引丝蛋白的多肽,可举出含有2以上、优选4以上、更优 选6以上的式I :REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单位的多肽。需要说明的是,在源自所 述大吐丝器牵引丝蛋白的重组多肽中,式I :REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单位可相 同,也可不同。
[0025] 在所述式(1)中,REPl表示聚丙氨酸的意思。在所述REPl中,连续排列的丙氨酸 优选为2个以上残基,更优选为3个以上残基,进而优选为4个以上残基,特别优选为5个以 上残基。另外,在所述REP1中,连续排列的丙氨酸优选为20个以下残基,更优选为16个以 下残基,更优选为12个以下残基,特别优选为10个以下残基。在所述式(1)中,REP2为由 10~200个残基的氨基酸组成的氨基酸序列,所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷 氨酰胺、脯氨酸和丙氨酸的合计残基数相对于氨基酸残基数整体为40%以上,优选为50% 以上,更优选为60%以上。
[0026] 在大吐丝器牵引丝中,所述REPl相当于在纤维内形成结晶β片的结晶区域,所 述REP2相当于在纤维内更具有柔软性、大部分欠缺规律结构的无定形区域。而且,所述 "REP1-REP2"相当于由结晶区域和无定形区域组成的重复区域(重复序列),为牵引丝蛋白 的特征性序列。
[0027] 作为含有2个以上所述式I :REP1_REP2(1)所示的氨基酸序列的单位的多肽,例 如可举出,具有序列编号1、序列编号2和序列编号3的任一者所示的氨基酸序列的源自 ADF3的重组蜘蛛丝蛋白。序列编号1所示的氨基酸序列为在N末端附加了由起始密码、 HislOTAG (组氨酸标签)和HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别位点组成的 氨基酸序列(序列编号4)的ADF3的氨基酸序列中,将第1~13位的重复区域以约变成2 倍的方式增加的同时,以转译在第1154位氨基酸残基终止的方式进行变异后的序列。序列 编号2所示的氨基酸序列为在从NCBI数据库取得的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的基因 银行(Genebank)的登录号(Accession number) :AAC47010, GI :1263287)的氨基酸序列的 N末端附加了由起始密码、HislOTAG和HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别 位点组成的氨基酸序列(序列编号4)的氨基酸序列。序列编号3所示的氨基酸序列为在 N末端附加了由起始密码、HislOTAG和HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别 位点组成的氨基酸序列(序列编号4)的ADF3的氨基酸序列中,将第1~13位的重复区域 以约变成2倍的方式增加后的序列。另外,作为含有2个以上上述式I :REP1-REP2(1)所示 的氨基酸序列的单位的多肽,还可使用由序列编号1、序列编号2和序列编号3的任一者所 示的氨基酸序列中,1个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列组成,且 具有由结晶区域和无定形区域组成的重复区域的多肽。
[0028] 在本发明中,"1个或多个"是指,例如1~40个、1~35个、1~30个、1~25个、 1~20个、1~15个、1~10个、或1个或数个的意思。另外,在本发明中"1个或数个"是 指,1~9个、1~8个、1~7个、1~6个、1~5个、1~4个、1~3个、1~2个、或1个 的意思。
[0029] 作为源自所述小吐丝器牵引丝蛋白的重组蜘蛛丝蛋白,可举出含有式2 :REP3(2) 表示的氨基酸序列的多肽。在所述式2中,REP3表示由(Gly-Gly-Z)m(Gly-Ala)l(A)r构 成的氨基酸序列,Z表示任意的一个氨基酸,特别优选为选自由Ala、Tyr和Gln组成的组中 的一个氨基酸。另外,m优选为1~4, 1优选为0~4, r优选为1~6。
[0030] 在蜘蛛丝中,小吐丝器牵引丝从蜘蛛网的中心呈螺旋状卷绕,或是作为网的加固 材料使用,或是作为包裹捕捉到的猎物的丝利用。与大吐丝器牵引丝相比已知小吐丝器牵 引丝拉伸强度差,但伸缩性能强。认为这是由于在小吐丝器牵引丝中,很多的结晶区域是由 甘氨酸与丙氨酸相互连接的区域所形成,因此比仅由丙氨酸形成结晶区域的大吐丝器牵引 丝相比,结晶区域的氢键更容易变弱。
[0031] 作为源自上述炜丝蛋白质的重组蜘蛛丝蛋白,可举出含有式3 :REP4 (3)所示的氨 基酸序列的多肽。在所述式3中,REP4表示由(Gly-Pro-Gly-Gly-X)n构成的氨基酸序列, X表示任意一个氨基酸,但特别优选为选自由Ala、Ser、Tyr和Val组成的组中的一个氨基 酸。另外,η表示至少为4以上的数字,优选为10以上,更优选为20以上。
[0032] 在蜘蛛丝中,炜丝没有结晶区域,具有由无定形区域组成的重复区域为较大的特 征。在大吐丝器牵引丝等中,由于具有由结晶区域和无定形区域组成的重复区域,因而推测 出同时具备很高的应力和伸缩性。另一方面,对于炜丝而言,与大吐丝器牵引丝相比其应力 差,但具有很高的伸缩性。这被认为是由于炜丝的大部分是由无定形区域构成所致。
[0033] 所述多肽,可使用以含有编码多肽的基因的表达载体进行转化后的宿主进行制 备。基因的制备方法没有特别限制,将编码天然型蜘蛛丝蛋白的基因以从蜘蛛由来的细胞 聚合酶链式反应(PCR)等进行扩增并克隆,或进行化学合成。基因的化学合成方法也没有 限制,例如,基于通过NCBI的网络数据库等得到的天然型蜘蛛丝蛋白的氨基酸序列信息, 可将通过AKTA oligopilot plus 10/100(GE医疗?日本株式会社制)等自动合成的寡核 苷酸用PCR等进行连接并合成。此时为了易于进行蛋白质的精制或确认,也可合成编码向 上述氨基酸序列的N末端附加由起始密码和HislOTAG构成的氨基酸序列而得到的氨基酸 序列的基因。作为所述表达载体,可使用由DNA序列可表达蛋白质的质粒、噬菌体、病毒等。 作为所述质粒型表达载体,只要在宿主细胞内进行目的基因的表达、且可进行自身扩增即 可,没有特别限定。例如作为宿主使用大肠杆菌R〇setta(DE3)的情况下,可使用pET22b (+) 质粒载体
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