水稻抗病相关基因OsPAD4的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因0SPAD4的 功能验证及应用。该基因编码一个类甘油三酯脂酶（triacylglycerollipase),它正向调 控水稻对白叶枯病和细菌性条斑病的抗性以及创伤诱导的系统抗性。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响会造成其产量和品质的下降。水稻 白叶枯病是由黄单孢杆菌水稻致病变种一白叶枯病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae) 引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害之一。另外，由黄单孢杆菌的另一个水 稻致病变种一细菌性条斑病菌引起的细菌性条斑病（细条病；Xanthomonasoryzae pv.oryzicola)也是水稻的重要病害；在我国，它是水稻检疫病害。
[0003] 植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两 大类：（1)主效抗病基因，又称MR(majorresistance,Zhang和Wang2013)基因和（2)抗 病相关基因。七个已经被克隆的主效抗白叶枯病基因（Xal，Xa3/Xa26,xa5,xal3,Xa21，xa25 和Xa27)编码的蛋白质是多样性的，说明水稻与白叶枯病菌互作关系的复杂性（Zhang和 Wang2013)。主效抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原 因，使利用主效抗病基因改良植物抗性受到限制：（1)主效抗病基因的资源有限，如目前知 道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的主效抗病基因只鉴定了大约37个；目前还没有在水稻 中发现抵抗细条病的主效抗病基因；（2)主效抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异 性，抗病范围有限；（3)因为病原的快速突变，一个主效抗病基因的作用往往几年或者十几 年后就会丧失。抗病相关基因是指除主效抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编 码蛋白质参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导、阻止信号传导或参于防卫反应 等。很多抗病相关基因的特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根 据病原诱导前后基因的表达量的差异，大规模地鉴定植物抗病相关基因（Maleck等，2000 ; Schenk等，2000 ;Zhou等，2002)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝 大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比主效抗病基因小。但根据下述原因，它 们是值得大力开发的基因资源：（1)由于绝大多数抗病相关基因编码的蛋白质不需要直接 与病原物相互作用，这类基因可能是具有持久抗性的基因资源；（2)大多数抗病相关基因 参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；（3)这类基因的 资源丰富。虽然已经发现了很多在水稻一病原互作中表达量发生了改变的基因（Zhou等， 2002 ;Chu等，2004)，但是这些基因是否直接参与调控水稻抗病反应（即属于抗病相关基因） 却不清楚。分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究和应用于水稻抗性改良的前提。 同时，与主效抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗 性。了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻的抗性，控制病害的发生。通过超 量表达作为抗病反应正调控因子的抗病相关基因，或者通过抑制表达作为抗病反应负调控 因子的抗病相关基因进行作物品种的改良，将进一步增强作物的抗病性，拓宽作物的抗谱。 这些方面是采用常规作物育种和改良技术所不能达到的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是鉴定一个水稻0sPAD4基因在水稻一病原互作中的功能，为利用 这个基因改良水稻抵御病害的能力奠定基础。申请人将这个基因命名为0sPAD4。
[0005] 本发明涉及的0sPAD4基因赋予水稻对由白叶枯病菌和细菌性条斑病菌所引起的 病害产生抗病反应。该基因的DNA序列如序列表SEQIDNO: 1所示，或者基本上相当于SEQ IDN0 :1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQIDN0 :1所示序列的亚片段。对其序列 进行分析表明，它编码一种类甘油三酯脂酶。阻止〇sPAD4表达，减弱水稻对白叶枯病和细 条病的抗性，同时也减弱水稻对创伤诱导的系统抗性。
[0006] 在本发明的实施例部分，我们阐述了 0SPAD4基因的分离、功能验证和该基因的特 点。
【附图说明】
[0007] 序列表SEQIDNO: 1是0sPAD4基因的核苷酸序列和它对应编码的氨基酸序列。
[0008] 图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因0sPAD4以及验证该基因功能的流 程图。
[0009] 图 2.用定量反转录一PCR(quantitativereversetranscription-PCR,qRT-PCR) 技术检测08?八04基因的表达模式。水稻材料(牡丹江8、他49、0490116)在成株期接种白叶枯 病菌生理小种PX061。"ck"表示没有任何处理的对照样品。"a"和"b"分别表示与ck相比 差异的显著性水平在P〈〇. 01和P〈〇. 05;双星号（**)和单星号（*)分别表示在同一时间点， 转基因株系（Rb49或D490M6)与对照牡丹江8相比差异的显著性水平在P〈0. 01和P〈0. 05。
[0010] 图3.抑制0sPAD4基因表达的遗传转化载体的主要结构特征图。它是在PDS1301 载体的多克隆位点插入了 566个核苷酸的0sPAD4基因的cDNA片段的反向重复序列。RB 和LB代表T-DNA右和左边界；Hpt代表潮霉素磷酸转移酶基因（筛选基因）;35S代表花椰菜 花叶病毒启动子；AdhI代表玉米乙醇脱氢酶基因内含子I;Waxy-a代表水稻Waxy基因内含 子；0CS代表章鱼碱合成酸基因终止子；⑶S代表0 -葡萄糖苷酸酶基因(标记基因)。
[0011] 图4.用实时定量RT-PCR技术检测0SPAD4基因在对照(牡丹江8)和I；代遗传转 化植株（D146RM)中的表达量以及表达量与接种白叶枯病菌PX061后植株病斑面积大小的 关系。"a"和"b"分别表示与对照(牡丹江8)相比差异的显著性水平在P〈0. 01和P〈0. 05。
[0012] 图5.用实时定量RT-PCR技术检测0sPAD4基因在对照(牡丹江8)和代遗传转 化植株（D146RM)中的表达量以及表达量与接种白叶枯病菌PX099后植株病斑面积大小的 关系。"a"和"b"分别表示与对照(牡丹江8)相比差异的显著性水平在P〈0. 01和P〈0. 05。
[0013] 图6.白叶枯病菌PX061在两个遗传转化家系（D146RM6-7和D146RM7-3)和对 照(牡丹江8)水稻植株中的生长分析。每个时间点的细菌数是来自3片叶的细菌生长数 (colony-formingunit,cfu)的平均数。"0天"代表接种1小时后取样。
[0014] 图7. 0sPAD4基因在水稻品种牡丹江8中受创伤诱导表达模式。水稻样品为创伤处 理1、3、6、12、24、48、72小时后的未创伤叶(水稻植株的上部叶）和创伤叶(水稻植株的下部 叶)。"a"和"b"分别表示创伤处理植株与未创伤植株（ck)相比差异的显著性水平在P〈0. 01 和P〈0.05。
【具体实施方式】
[0015] 本发明的前期结果显示，在水稻一细菌性病原互作中，0SPAD4基因的表达量发生 改变，提示该基因可能参于水稻一病原互作的调控（Qiu等，2007)。但是该基因是正向调控 水稻抗病反应还是负向调控水稻抗病反应却不清楚。为了回答这些问题，产生了本发明。
[0016] 以下实施例中进一步定义本发明，图1描叙了鉴定和分离克隆0sPAD4基因以及验 证该基因功能的流程。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的 基本特征。
[0017] 实施例一 ：0sPAD4基因的表达模式分析
[0018] 本发明涉及的基因在MSU Rice Genome Annotation Project (http://rice. plantbiology. msu. edu/)中的编号为L0C_0sllg09010。为了进一步证实0sPAD4基因的 表达是否受病原入侵水稻的影响，我们采用定量反转录一PCR (quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技术（Qiu等，2007)，分析了接种白叶枯病菌PX061后， 0sPAD4基因在感病水稻品种牡丹江8和抗病水稻家系Rb49和D490M6中的表达模式。牡丹 江8是常用的感病水稻品种，Rb49是牡丹江8背景、携带主效抗白叶枯病基因Xa3/Xa26的 转基因株系（Sun等，2004;Cao等，2007) ;D490M6是牡丹江8背景、携带主效抗白叶枯病基 因Xa21的转基因株系（Zhao等，2009)。白叶枯病菌生理小种PX061由菲律宾国际水稻研 究所惠赠（Sun等，2004;见《遗传资源来源