过程是： (1)采集普通人皮肤成纤维细胞，培养人皮肤成纤维细胞； (2) 构建Runx2慢病毒载体； (3) 慢病毒感染人皮肤成纤维细胞，确定成纤维细胞开始表达Runx2 ; (4) 感染3-7天后，细胞密度2~3xl04/cm2的情况下，用9 ym的 CHIR99021+10 y mForskolin以及加10nM地塞米松激素信号分子液处理细胞7~15天； (5) 之后加入成骨细胞诱导液进行诱导，持续10~20天可以得到成骨细胞；可以用该 诱导液维持细胞培养； (6) 获得成骨细胞，并进行鉴定。
[0022] 本方法使用小分子（forskolin 6 ym~12 ym +地塞米松5~15nM)也可以使得 表达Runx2的人皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞，尽管转化效率(形成成骨标志物：矿化 结节的比例不高）不如三者（forskolin + CHIR99021 +地塞米松）化合物存在的高，但是 首先引入了小分子forskolin的使用，利于人皮肤成纤维细胞向成骨细胞方向分化。
[0023] 实施例1 一、质粒构建和细胞培养 1. 1人皮肤成纤维细胞培养：先采集普通人皮肤成纤维细胞，将人皮肤成纤维细胞 培养于含有10%胎牛血清（Hyclone) + 100U/ml青霉素（Sigma) + 100μg/ml链霉素 (Sigma) +高糖DMDM组成的普通培养液（Gibco)中并贴壁于包被有明胶的6孔板中；接 种细胞密度5~6xl03/cm 2培养于37°C，5% C02的培养箱中。
[0024] 1. 2构建Runx2慢病毒载体：将全长Runx2 (来源于人类）的cDNA插入到含GFP 的pVSVG载体中，另外还构建仅含有GFP的pVSVG的空载。
[0025] 二、病毒侵染细胞 慢病毒包装与感染：目的基因Runx2质粒与病毒包装质粒通过Lipof ectamine 2000共转染HEK293T细胞，获得了高滴度的病毒，对普通的人皮肤成纤维细胞分别感染 Runx2-GFP-PVSVG慢病毒和GFP-PVSVG空载慢病毒，效率分别可达到61%和93. 4%。
[0026] 三、小分子诱导 将病毒感染后的人皮肤成纤维细胞(此时细胞分别表达Runx2或者GFP)，培养3~7 天，使用普通培养液，该培养液包含10%胎牛血清（Hyclone)，100U/ml青霉素（Sigma)， 100 μg/ml 链霉素（Sigma)，高糖 DMDM (Gibco)。
[0027] 之后更换为激素信号分子诱导液再培养7~1 5天，激素信号分子诱导液包括 10% 胎牛血清（Hyclone) + 100U/ml 青霉素（Sigma) + 100μg/ml 链霉素（Sigma) + 高糖 DMDM 培养基（Gibco) + lOyMForskolin y y + 10nM 地塞米松； 四、成骨分化培养液 7~15天后，再更换为成骨细胞分化液进行培养，此成骨细胞分化培养液包括10%胎 牛血清（Hyclone) + 100U/ml 青霉素（Sigma) + 100 μg/ml 链霉素（Sigma) + 高糖 DMDM 培养基（Gibco)+ 10mMf3-甘油磷酸 + 100nM 地塞米松+0.2mM ascorbate-2-phosphate， 此后，每隔2~3天更换一次成骨细胞分化培养液，持续诱导5天以上；其后的细胞培养， 一直使用成骨分化液维持。
[0028] 五、茜素红染色鉴定 ① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次； ② 取含4%多聚甲醛的固定液固定细胞30min ; ③ 去固定液，利用2%的茜素红染液，37°C，孵育30min，可放在培养箱中进行； ④ 弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性； ⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
[0029] 实施例2~实施例8:实施例2至实施例8中对培养和转分化方法与实施例1相 同，不再重点述，但其配方和操作时间不同，具体如下表所示。
【主权项】
1. 一种利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法，其 特征是利用Runx2基因的表达及小分子化合物CHIR99021和forskolin，诱导人成纤维细胞 转分化为成骨细胞。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是先构建携带Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮肤 成纤维细胞，使正常人皮肤成纤维细胞表达Runx2,放置普通培养液培养3~7天后，在该 普通培养液再加入小分子化合物6yM~12yM的forskolin+ 5~15nM的地塞米松两种 物质，组成激素信号分子诱导液，在该激素信号分子诱导液中再进行7~15天的细胞培养， 随后利用成骨细胞分化液进行诱导（37°C，5%C02)，5~7天后可诱导为成骨细胞； 所述普通培养液是指：10%胎牛血清+lOOU/ml青霉素+ 100yg/ml链霉素+高糖DMDM培养基，在37°C，5%C02环境下培养细胞； 所述成骨细胞分化液配方为：1〇%胎牛血清（Hyclone) + 100U/ml青霉素（Sigma) +IOOyg/ml链霉素（Sigma) +高糖DMDM培养基（Gibco)+lOmM0-甘油磷酸+IOOnM地塞 米松 + 0.2mMascorbate-2-phosphate;在 37。C，5%C02 环境下培养细胞。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述激素信号分子诱导液还可以是在 普通培养液再加入5~10yM的小分子化合物CHIR99021物质，则在普通培养液添加由 CHIR99021 (5 ~IOyM)+forskolin(6yM~12yM)+ 地塞米松（5 ~15nM)三者混合 液组成的混合液，即是激素信号分子诱导液。
4. 根据权利要求1或2所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程 成骨细胞的方法，其特征在于：组成激素信号分子诱导液中最佳量为：9uM小分子化合物 CHIR99021+10uM小分子化合物forskolin+10nM地塞米松。
5. 根据权利要求1或2所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成 骨细胞的方法，其特征在于： a. 所采集的成骨细胞是由普通人皮肤细胞通过转录因子Runx2的表达直接转分化而 得，该皮肤细胞不需要传统的诱导性多能干细胞（iPS)四因子（c-Myc，Klf4，0ct4,Sox2)， 因而不经过干细胞阶段，避免移植时成瘤风险； b. 所利用激素信号分子诱导液中的地塞米松与小分子化合物CHIR99021和/或小分 子化合物forskolin在一定浓度下的组合，搭配上述Runx2表达的人皮肤成纤维细胞，且维 持Runx2 -定的表达时间窗口 11天~15天，以及早期使得(转分化启动后6~11天后)碱 性磷酸酶(ALP)在细胞中的表达，可以得到该成骨种子细胞； 所述碱性磷酸酶（ALP)是指：成骨细胞的表型标志物之一，成骨分化的过程中早期表 达的蛋白。
6. 根据权利要求1或2所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成 骨细胞的方法，其特征和具体步骤是 (一)、质粒构建和细胞培养 I. 1细胞培养 先采集普通人皮肤成纤维细胞，将人皮肤成纤维细胞培养于含有10 %胎牛血清 (Hyclone) + 100U/ml青霉素（Sigma) + 100yg/ml链霉素（Sigma) + 高糖DMDM组成的 普通培养液（Gibco)中并贴壁于包被有明胶的6孔板中；接种细胞密度5~6xl03/cm2培 养于37°C，5%C02的培养箱中； I. 2质粒构建 将全长Runx2 (来源于人类）的cDNA插入到含GFP的pVSVG载体中，另外还有仅含有GFP的pVSVG的空载； (二)、病毒侵染细胞 慢病毒包装与感染：目的基因（Runx2)质粒与病毒包装质粒通过Lipofectamine2000 共转染HEK293T细胞，获得了高滴度的病毒，分别对此细胞感染Runx2-GFP-PVSVG慢病毒和 GFP-PVSVG空载的慢病毒，感染效率分别可达到61%和93. 4% ; (三) 、小分子诱导 将病毒感染后的皮肤成纤维细胞培养3~7天，使用普通培养液培养，配方是：10%胎 牛血清（Hyclone) + 100U/ml青霉素（Sigma) +IOOyg/ml链霉素（Sigma)+ 高糖DMDM培 养基（Gibco); 之后更换为在普通培养液添加有小分子化合物后组成的激素信号分子诱导剂再培 养7~1 5天，激素信号分子诱导剂包括10 %胎牛血清（Hyclone) +lOOU/ml青霉素 (Sigma) +IOOyg/ml链霉素（Sigma) + 高糖DMDM培养基（Gibco) + 9yM的CHIR99021 (浓度范围：5~IOyM) + 10yMForskolin(浓度范围：6yM~12yM)+IOnM地塞米松； (四) 、成骨分化培养液 随后再更换为成骨细胞分化培养液进行培养，成骨细胞分化液包括10%胎牛血清 (Hyclone) + 100U/ml青霉素（Sigma) +IOOyg/ml链霉素（Sigma) + 高糖DMDM培养基 (Gibco)+lOmM0 甘油磷酸 +IOOnM地塞米松 + 0.2mMascorbate-2-phosphate，此后，每 隔2~3天更换一次成骨细胞分化液，持续诱导5天以上；其后的细胞培养，一直使用成骨 细胞分化液维持； 五、茜素红染色鉴定 ① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次； ② 取含4%多聚甲醛的固定液固定细胞30min; ③ 去固定液，利用2%的茜素红染液，37°C，孵育30min，可放在培养箱中进行； ④ 弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性 ⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
【专利摘要】本发明涉及一种利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法，特别是一种利用Runx2基因表达及小分子化合物CHIR99021和/或小分子化合物forskolin，在地塞米松存在的条件下诱导人成纤维细胞转分化为成骨细胞的方法，属细胞生物学与组织工程领域。它包括：构建携带Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮肤成纤维细胞，之后利用小分子化合物5～10μMCHIR99021和10μMforskolin在地塞米松的存在的条件下，进行人成纤维细胞的转分化，7～１５天以后，更换成骨细胞诱导液进行诱导，5～20天后可将其诱导为成骨细胞的方法。本发明可以简单快速地获得成骨细胞，用于骨代谢性疾病，骨折等的细胞治疗。本发明的药物组合也可用于组织工程骨的研发和生产。为基础研究带来便捷，为临床应用带来前景。
【IPC分类】C12N5-10, C12N15-867, C12N5-077, C12N15-12
【公开号】CN104762324
【申请号】CN201510099327
【发明人】胡敏, 李燕皎
【申请人】昆明学院
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月6日