高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病毒构建方法，尤其涉及一种高效包装与表达黑色素瘤分化相关 基因-7的腺病毒构建方法。
【背景技术】
[0002] 常用腺病毒载体的包装方法包括：1)经典的同源重组法(双质粒共转染）：原理 是同源重组。在腺病毒左臂区域(通常缺失E1基因区）插入目的基因表达盒构成腺病毒穿 梭质粒，与带有腺病毒全基因组(通常缺失E1基因区）的大质粒共同转染携带E1基因区的 细胞如293细胞，两种质粒在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成 病毒颗粒。2) Ad-Easy法：原理是通过同源臂重组的方式在细菌中获得重组腺病毒基因组 质粒。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的质粒共转化 RecA+细菌，在细菌RecA重组酶的作用下经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其线 性化后转染293细胞获得重组病毒。以上两种方法存在操作繁复，重组效率较低等缺陷，在 实际的应用中受到了一定的限制。
[0003] 黑色素瘤分化相关基因-7 (mda-7)是近年来发现的一种新型肿瘤抑制基因，现在 又命名为IL-24。该基因能促进其他多种癌细胞的生长抑制和凋亡，如卵巢癌、肺癌、前列腺 癌、乳腺癌、胶质瘤、胰腺癌等。相对于其它抗肿瘤基因，mda-7在抗瘤抑瘤及降低毒副作面 用两具有明显的优势。首先，mda-7的抗肿瘤具备恶性肿瘤选择性。该基因对正常表皮细 胞，肺成纤维细胞，乳腺细胞，前列腺和肺上皮细胞，星形胶质细胞，内皮细胞及黑色素细胞 等正常细胞均无任何毒副作用；其次，mda-7用于癌症治疗不受肿瘤细胞的抑癌基因状态 的影响，相对于P53等抑癌基因来说，mda - 7抑制癌细胞的增长和促进凋亡与这些癌细胞 中其它抑癌基因的状态无关（p53，Rb，或pl6ink4)，因而可以更稳定地发挥抗肿瘤作用；同 时，mda-7/IL-24是一个前Thl因子（pro - Thlcytokine)，能激活STAI产生肿瘤免疫，抗 血管生成和受体介导的细胞毒性；最后，mda-7蛋白还可以大大增强肿瘤细胞对放射治疗 的敏感性，从而起到杀伤肿瘤细胞的效果。mda-7是IL-10家族中唯一的具有杀死肿瘤细 胞而对正常细胞没有任何毒性作用的细胞因子，从而具有极大的临床抗肿瘤应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因_7的腺病毒构 建方法，克服现有技术腺病毒构建方法中存在的操作繁复，重组效率较低，抗肿瘤选择性差 等缺陷。
[0005] 为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一、本发明采用属于腺病毒AdMax? 的PDC316为载体，以此构建重组腺病毒表达载体代替最普及的AdEasy系统。与目前使用 最普及的腺病毒AdEasy系统相比，腺病毒AdMax?系统具有操作简便、重组效率高、获得的 病毒产率高(一般大于10 4vp/cell)的特点。AdMax?系统只需要2 - 4周就能完成从质粒 构建到重组出毒，AdMax系统因在真核细胞内重组出毒，出毒成功率大于98% (其中95%的克 隆含有目的基因），而AdEasy系统的出毒成功率只有18% - 34%。AdMax?系统采用mCMV启 动子，因为mCMV启动子比常用的hCMV启动子强若干倍，所以AdMax?系统包装的目的基因 的表达水平明显提高3 - 4倍。二、本发明以AdMax?系统包装mda-7基因构建了复制缺陷 型腺病毒载体Ad. mda-7. egfp，并证明其具有增强蛋白表达效率及选择性诱导肺腺癌细胞 株A549凋亡的功能。腺病毒转染肺癌细胞A549和正常的支气管上皮细胞HBE后，将该基因 转染入肺癌细胞后，能促进肺癌细胞的凋亡（F=6376. 200, P〈0.001)，而对正常支气管上皮 细胞HBE则无明显作用（F=2. 227, P=0. 189)，经Ad. mda-7. egfp干预后，两种细胞的凋亡率 具有显著性差异（P〈0. 01)，Ad. egfp组细胞凋亡率无显著性差（P=0. 060)，提示Ad. mda-7. egfp诱导的细胞凋亡具有明显的肿瘤选择性，为肺腺癌的基因治疗奠定了良好的实验基 础。
【附图说明】
[0006] 图1为本发明胚胎肾细胞HEK293细胞总RNA。
[0007] 图2为本发明RT-PCR产物电泳图。
[0008] 图3为本发明PMD18-T- mda-7/IL-24经Bglll及Hindlll双酶切电泳图。
[0009] 图4为本发明PMD18-T- mda-7/IL-24测序结果。
[0010]图 5 为本发明 pDC316-mda-7. egfp 质粒经 Bglll 及 Hindlll 双酶切。
[0011] 图6为本发明pDC316-mda_7. egfp测序结果。
[0012] 图7为本发明出现CPE反应的293细胞（100 x )。
[0013] 图8为本发明Ad. mda-7. egfp的PCR鉴定。
[0014] 图9为本发明A549细胞内Ad. mda-7. egfp表达的绿色荧光蛋白（100 x )。
[0015]图 10 为本发明 Ad. mda-7. egfp 的 RT-PCR 鉴定。
[0016] 图11为本发明免疫组织化学（IHC)检测mda-7蛋白的表达，A，C免疫组化染色 阴性，E可见细胞胞浆免疫组化染色阳性。B未见绿色荧光蛋白表达，D，F可见绿色荧光蛋 白表达（400 x )。
[0017] 图12为本发明FCM法检测Ad. mda-7. egfp表达绿色荧光蛋白的效率。
[0018] 图13为本发明Ad.mda-7. egfp诱导肺癌细胞凋亡（Hoechst33342_PI染色100 x )。
[0019] 图14为本发明FCM法检测Ad. mda-7. egfp选择性引起肺癌细胞凋亡。
【具体实施方式】
[0020] 本发明主要分为两个步骤，步骤一为腺病毒表达载体的构建，即采用属于腺病毒 AdMax的pDC316为穿梭载体，以此构建重组腺病毒表达载体代替最普及的AdEasy系统。其 主要方法为：将重组的含有目的基因hMDA - 7片段的穿梭质粒载体pDC316- hMDA7和骨架 质粒pBHGlox A El，3Cre，共同转染至HEK293细胞，包装产生重组腺病毒Ad. mda-7. egfp，并 进行扩增及感染性滴度测定。步骤一主要为保证AdMax系统出毒成功率，即保证AdMax系 统真核细胞内重组出毒，出毒成功率大于98%,具体操作步骤为。
[0021] 1?重组腺病毒Ad. mda-7. egfp的包装。
[0022] 用Bglll和Hindlll内切酶同时对腺病毒载体pDC316 -EGFP和hMDA7片段进行 双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收；将回收的载体片段和目的基因cDNA用T4 L igase 16°C 连接过夜，直接取5 yL连接产物转化TG1感受态细菌，用含氨苄青霉素LB培养基平板 进行筛选，挑出3个克隆，摇菌过夜，抽提质粒、双酶切鉴定正确的重组腺病毒穿梭载体 命名为PDC316-EGFP- hMDA7。用质粒抽提试剂盒提取病毒包装系统中的质粒DNA，以紫外 光吸收法测定其浓度及纯度后进行质粒转染过程。将穿梭质粒PDC316-EGFP - hMDA7和 辅助质粒 pBHGlox( delta) El，3Cre 通过 Lipofectamine 2000 共转染 HEK293 细胞，观察 细胞生长状况，待大部分细胞出现细胞病变（cytopathic effect，CPE)，收集细胞，一70 °C /37 °C反复冻融，收集病毒上清一 70 °C保存。
[0023] 2?重组腺病毒Ad. mda-7. egfp感染性滴度（TCID50)测定。
[0024] 将生长状态良好的HEK293细胞4倍稀释后转入细胞培养瓶中，加入重组腺病毒 PDC316- hMDA7收获的粗提液继续培养，待大部分细胞出现典型的CPE，收集病毒上清液， 再次扩增，将混悬液3000rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀用Tris缓冲液重悬，反复冻融三 次,6000rpm离心,取上清，用DNase酶消化后，用0. 45um的滤膜过滤，然后进行柱纯化。一 70°C保存。在离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从将稀释好的病毒接种到 96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100沿。在每孔加入细胞悬 液100W，使细胞量达到3X10 5个/ml。将96孔板置于37°C 0)2培养箱中培养，10天后观 察细胞病变现象，并对CPE孔进行计数，计算每行的阳性率。病毒滴度计算按（Karber法)： 滴度T = 101+d (s_°_5)进行。重组腺病毒Ad. hMDA7-EGFP，病毒活性单位为2. 5X 101(lIU/ml， 而常用的AdEasy包装系统产生的病毒活性单位通常只有107 - 108 IU/ml，AdMax系统包 装的病毒活性明显高于AdEasy包装系统。
[0025] 步骤二为腺病毒表达载体的功能鉴定，即以Ad. mda-7为对照组，观察Ad. mda-7. egfp具有增强蛋白表达效率的功能，其主要方法为：以Ad. mda-7. gfp (AdEasy系统）为对 照组，以Ad. mda-7. egfp (AdMax系统)为实验组，分别感染肺腺癌细胞A549,通过流式细胞 仪检测表达绿色荧光蛋白阳性的细胞；同时以Ad. egfp为对照病毒，以支气管上皮细胞HBE 为对照细胞，观察Ad. mda-7. egfp选择性诱导肺腺癌细胞A549凋亡的效应。其主要方法为： 1?以