基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种敲除载体构建方法及其crRNA原件。
【背景技术】
[0002] 鲤鱼疱疼病（Kai herpesvirus disease, KHVD)是由是鲤鱼疱诊病毒（KHV或 CyHV-3)感染引起的鲤鱼及锦鲤的一种急性传染疾病，该病的爆发给我国鱼类养殖业造成 了严重的经济损失。该病毒为囊膜包被病毒，直径为170-230nm，含有20面体对称核衣壳， 属于疱瘆科病毒，其遗传物质属于双链DNA。目前针对疫情爆发的补救手段主要仍采用隔 离与大量扑杀，尚无有效救治手段。研宄证实，实验条件下鲤鱼脑细胞系CCB和鳍条细胞系 KF-1是KHV的敏感细胞。
[0003] CRISPR:成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是原核生物抵抗外来基因片段一噬 菌体、质粒等的免疫防御系统。属于III型CRISPR的CRISPR/Cas9系统由三个必要的部分 组成：包括crRNA、tracrRNA及Cas9核酸内切酶。目前常见的px330载体中，是将crRNA与 tracrRNA进行连接组成含莖环结构的sgRNA。crRNA的5'端含20bp的特异序列，可以识别 特定DNA的互补序列。在发挥识别作用过程中，与靶基因前间区3'邻近的3个（NGG)碱基称 为PAM序列。在细胞内转染px-330后，含有crRNA的gRNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具 体革G点，从而对特定基因位点进行切割导致突变，从而实现基因敲除。pX330-U6-Chimenic_ BB-CBh-hSpCas9(pX330-puro)转基因供体质粒关键原件示意图如图2所示，关键元件含有 组成gRNA的crRNA片段和tracerRNA片段，Cas9蛋白及Puro抗性基因完整表达盒。
[0004]目前，CRISPR系统作为高效DNA编辑工具已被大量应用，有报道称该系统可以在 细胞水平通过在病毒基因组DNA中造成特异性的双链断裂从而阻抑相应病毒在胞内的复 制如属于cccDNA病毒的HBV和感染过程中存在pre-DNA形式的EBV、HIV，不过尚未有采用 该策略成功抑制鱼类DNA病毒的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明是要解决现有方法抑制KHVD不足的问题，提供一种基于CRISPR/Cas9系统 靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件。
[0006] 本发明基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法，按以下步 骤进行：
[0007] 一、依据 KHV 基因组 TK(GenBank:AB375385. 1)和 DP(GenBank:AY939862. 1)基 因设计crRNAs，通过http://crispr. mit. edu/设计优化并分别合成crRNA-TK引物和 crRNA-DP引物，于沸水处理15min，而后自然降温过夜退火，分别得到两个带有Bbsl酶切粘 性末端的DNA双链退火产物；
[0008]二、为了便于筛选克隆化细胞系，本发明前期工作对能够携带CRISPR/Cas9的 pX330载体（pX33〇-U6-Chimenic_BB-CBh_hSpCas9 ;http://www. addgene. org/42230)进行 了改造，成功制备了含有puromycin抗性基因的pX330-puro载体，如图1所示；
[0009] 三、对pX330_puro载体采用Bbsl进行单酶切，而后采用SAP磷酸酶进行去磷反 应，回收线性化的pX330-puro载体；
[0010] 四、采用T4连接酶，对步骤三回收得到的线性化的pX330-puro载体与步骤一得到 的两个退火产物分别进行连接，得连接产物；
[0011] 五、将步骤四的连接产物转入感受态细胞内，培养后，挑取单菌落进行PCR验证， 对PCR验证为阳性的单菌落，提取重组质粒DNA，对重组质粒DNA采用Bbsl酶进行单酶切验 证，对验证为阳性的重组质粒DNA，命名为pX330-puro TK或pX330-puro DP重组载体。
[0012] 其中步骤一中crRNA-TK引物序列为：
[0013]上游引物：5' -CACCGTGCTCTTGCCCGCGAACAT-3'
[0014]下游引物：5 ' -AAACATGITCGCGGGCAAGAGCAC-3 '
[0015] crRNA-DP引物序列为：
[0016]上游引物：5' -CACCGCCGTGTTCCTCACGTACTCG-3'
[0017]下游引物：5 ' -AAACCGAGTACGTGAGGAACACGGC-3 '
[0018] 基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的特异性crRNA原件为crRNA-TK 和crRNA-DP，所述crRNA-TK为双链DNA，其正义链如序列表中的SEQIDN0:1所示，反 义链如序列表中的SEQIDN0 :2所示；正义链5' -GTGCTCTTGCCCGCGAACAT-3'，反义链 5' -ATGTTCGCGGGCAAGAGCAC-3'。
[0019] 所述crRNA-DP为双链DNA，其正义链如序列表中的SEQ ID N0:3所示，反义 链如序列表中的SEQ ID N0 :4所示；正义链5' -CCGTGTTCCTCACGTACTCG-3'，反义链 5' -CGAGTACGTGAGGAACACGG-3'。
[0020] 在本发明中，我们应用CRISPR/Cas9系统在鲤鱼鲤鱼鳍条KF-1细胞系中进行了 KHV增殖抑制试验。为了有效干扰KHV病毒的复制，我们选取了与病毒复制有关的TK和DP 作为CRISPR/Cas9系统的靶标。为了提高检测的灵敏度，我们根据病毒早期转录的0RF-81 基因设计合成了 taqman水解探针。结果显示：在鲤鱼鳍条细胞系内，CRISPR/Cas9系统可以 在有效的抑制KHV的增殖。TK基因靶向切割示意图如图3所示，Cas9核酸内切酶复合物在 gRNA指导下（靶向与crRNA反向互补的双链DNA)可定向在DNA识别区的PAM序列（NGG) 前5nt位置造成双链断裂。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明由带有CRISPR/Cas9系统的pX330-puro载体，连接针对KHV基因组TK和 DP基因的crRNA确保对其目的DNA片段的特异性破坏。本发明与现有技术相比，具有安全、 高效特点，其病毒抑制率能达到80%。本发明具有以下优势：1、靶向精确性高，细胞内病毒 抑制效果明显；2、构建简便，实验周期短。
【附图说明】
[0023] 图1为含有puromycin抗性基因的pX330_puro载体质粒图谱；图2为转基因供体 质粒关键原件示意图；图3为TK基因靶向切割示意图；图4为pX330-puro TK和pX330-puro DP细胞克隆PCR验证结果；图5为KHV病毒拷贝Real-time PCR监测标准曲线；图6为病 毒拷贝数监测KHV增殖情况；图7为病毒拷贝数监测KHV增殖情况；图8为连续测定细胞中 病毒滴度增减情况。
【具体实施方式】
[0024] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0025] 一：本实施方式基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载 体构建方法，按以下步骤进行：
[0026] 一、依据 KHV 基因组 TK(GenBank:AB375385. 1)和 DP(GenBank:AY939862. 1)基 因设计crRNAs，通过http://crispr. mit. edu/设计优化并分别合成crRNA-TK引物和 crRNA-DP引物，于沸水处理15min，而后自然降温过夜退火，分别得到两个带有Bbsl酶切粘 性末端的DNA双链退火产物；
[0027] 二、为了便于筛选克隆化细胞系，本发明前期工作对能够携带CRISPR/Cas9的 pX330 载体（pX33〇-U6-Chimenic_BB-CBh_hSpCas9 ;http://www. addgene. org/42230)进行 了改造，成功制备了含有puromycin抗性基因的pX330-puro载体，如图1所示，重组后的 px330puro载体全长10046bp，如序列表中的SEQ ID N0 :21所示；
[0028] 三、对pX330_puro载体采用Bbsl进行单酶切，而后采用SAP磷酸酶进行去磷反 应，回收线性化的pX330-puro载体；
[0029] 四、采用T4连接酶，对步骤三回收得到的线性化的pX330_puro载体与步骤一得到 的两个退火产物分别进行连接，得连接产物；
[0030] 五、将步骤四的连接产物转入感受态细胞内，培养后，挑取单菌落进行PCR验证， 对PCR验证为阳性的单菌落，提取重组质粒DNA，对重组质粒DNA采用Bbsl酶进行单酶切验 证，对验证为阳性的重组质粒DNA，命名为pX330-puro TK或pX330-puroDP重组载体。
[0031] 其中步骤一中crRNA-TK引物序列为：
[0032]上游引物：5 ' -CACCGTGCTCTTGCCCGCGAACAT-3 '
[0033]下游引物：5 ' -AAACATGITCGCGGGCAAGAGCAC-3 '
[0034] crRNA-DP引物序列为：
[0035]上游引物：5 ' -CACCGCCGTGTTCCTCACGTACTCG-3 '
[0036]下游引物：5 ' -AAACCGAGTACGTGAGGAACACGGC-3 '
[0037] 步骤三中单酶切反应体系如下：
【主权项】
1. 基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法，其特征在于该方法 按以下步骤进行： 一、 依据KHV基因组TK和DP基因设计crRNAs，分别合成crRNA-TK引物和crRNA-DP 引物，于沸水处理15min，而后自然降温过夜退火，分别得到两个带有BbsI酶切粘性末端的 DNA双链退火产物； 二、 对能够携带CRISPR/Cas9的pX330载体进行了改造，成功制备了含有puromycin抗 性基因的pX330-puro载体； 三、 对pX330-puro载体采用BbsI进行单酶切，而后采用SAP磷酸酶进行去磷反应，回 收线性化的pX330-puro载体； 四、 采用T4连接酶，对步骤三回收得到的线性化的pX330-pUr〇载体与步骤一得到的两 个退火产物分别进行连接，得连接产物； 五、 将步骤四的连接产物转入感受态细胞内，培养后，挑取单菌落进行PCR验证，对PCR 验证为阳性的单菌落，提取重组质粒DNA，对重组质粒DNA采用BbsI酶进行单酶切验证，对 验证为阳性的重组质粒DNA，命名为pX330-puro TK或pX330-puro DP重组载体。
2. 根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方 法，其特征在于步骤三中单酶切反应体系如下：
酶切反应条件：37°C反应3h。
3. 根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建 方法，其特征在于步骤三中去磷反应条件：线性化的pX330-puro载体30 μ L，SAP 1 μ L， Buffer 5yL，ddH20 14yL，反应 30min 后，60°C 终止 SAP 作用 15min〇
4. 根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方 法，其特征在于步骤四中连接体系如下：
连接反应条件：17°C反应12h。
5. 基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的crRNA原件，其特征在于crRNA原件为 crRNA-TK和crRNA-DP，所述crRNA-TK为双链DNA，其正义链如序列表中的SEQ ID NO : 1所 示，反义链如序列表中的SEQ ID NO :2所示；所述crRNA-DP为双链DNA，其正义链如序列表 中的SEQ ID NO :3所示，反义链如序列表中的SEQ ID NO :4所示。
【专利摘要】基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件，涉及一种敲除载体构建方法及其crRNA原件。是要解决现有方法抑制KHVD不足的问题。方法：一、合成crRNA-TK和crRNA-DP引物，沸水处理，退火，得到两个DNA双链退火产物；二、制备pX330-puro载体；三、对pX330-puro载体进行酶切，进行去磷反应，回收线性化的载体；四、对线性化载体与两个退火产物连接，得连接产物；五、将连接产物转入感受态细胞内，提取重组质粒DNA，命名为pX330-puro TK或pX330-puro DP重组载体。本发明基于定向敲除KHV关键基因，靶向精确性高，胞内病毒抑制效果明显。
【IPC分类】C12N15-113, C12N15-85
【公开号】CN104762321
【申请号】CN201510194406
【发明人】赵翊丞, 于泽, 王鶴鸣, 张紫茜, 张童童, 滕春波
【申请人】东北林业大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月22日