化性质是很重要的。
[0018] 在已有技术中也已尝试了一些分子定向进化的方法，以便稳定人重链或轻链可变 结构域（Barthelemyetal.，J.Biol.Chem. 2008 283(6) : 3639-54)。他们用VH的CDR-改 造文库构建了噬菌体展示系统，然后筛选在施加热胁迫之后对蛋白A具有结合活性的VH。 有报告称通过该方法筛选到了具有增加的溶解性、并在蛋白质的热变性后允许可逆折叠的 CDR改造的人VH(Jespersetal.，Nat.Biotechnol.2004 22(9):1161-5)。此外，有报告 称，制备了无热变性处理下在CDR3部分和框架部分诱导突变的各种文库并用相同的方法 筛选到在噬菌体展示后对蛋白A展现高结合活性的VH，因此，可以得到相比野生型的VH为 热力学稳定且具有增加的可溶性表达的改造的VH(Barthelemyetal.，JBiolChem. 2008 283(6) : 3639-54)。在噬菌体展示系统中，靶蛋白是由融合到靶蛋白的N-末端的pelB蛋 白的Sec信号序列诱导至Sec途径。然而，在这种情况下，该蛋白（其之前在大肠杆菌的 细胞质内折叠）由于蛋白质的固有转位途径的限制而不能通过该途径。原因是，一般的噬 菌体展示采用Sec途径，这是大肠杆菌的代表性的蛋白质转位途径，并且，由于这条途径的 性质，靶蛋白质在穿过细胞膜时在分子伴侣帮助下在细胞质内具有线性结构而不是三维结 构。在胞质内，sec途径特异的蛋白质（不同的线性形式）在被称作SecB的分子伴侣的帮 助下，蛋白转录后直接天然存在而不折叠。sec途径靶蛋白通过SecB被移动到由存在于 细胞内的SecA、SecYEG和SecDFYajC组成的转位复合体，以线性形式而不是三维结构穿过 膜，并且已穿过的氨基酸链在到达周质前通过DsbA和DsbB的氧化和还原形成包括二硫键 的完整的三维结构（BaneyxandMujacicNatureBiotech. 2004, 22, 1399 ~1408)。因此， 如果由于蛋白质本身的性质而在细胞质中迅速发生一定的蛋白质折叠和三维结构形成，这 种蛋白与设计用于Sec途径的噬菌体展示筛选系统不具有兼容性。
[0019] 此外，据报道，当基于斑块尺寸的大小直接从遍布菌苔的平板上筛选克隆时，可选 择具有改进的理化性质的野生型VH(Toetal.，J.Biol.Chem. 2005280(50) : 41395-403)。 但是，通过基于平板的筛选来进行大规模处理是不可能，因此，为了减小文库的大小，制造 仅用于进行蛋白质体外筛选步骤的VH3家族的初始文库。
[0020] 同时，为了提高重组蛋白的折叠特性，尝试了遗传选择方法（Maxwellet al.,ProteinSci. 1999 8 (9) : 1908-11；ffigleyetal.,Nat.Biotechnol. 2001 19 (2):131-6；Cabantousetal. ,NatBiotechnol. 2005 23(1):102-7；ffaldoGS.Curr. Opin.Chem.Biol. 2003 7 (1) : 33-8)。一个代表性用于改善重组蛋白的折叠特性的方法是通 过测量以重组DNA技术融合到目的蛋白质的报告蛋白的活性来间接测定目的蛋白质的折 叠程度。然而，当目的蛋白单独存在时，不能准确地反映折叠。
[0021] 另外，为了提高蛋白质的溶解性，已经开发出了分子定向进化方法，其中利用 Tat(双精氨酸转位）途径作为生物过滤器来确定蛋白质是否被折叠，该途径是具有校对蛋 白质折叠品质的功能的蛋白质转位途径。具体地，目的蛋白融合到报告基因和Tat信号序 列并通过大肠杆菌内的Tat途径表达，然后根据蛋白质的折叠程度和溶解性通过TatABC 转位酶复合体进行蛋白折叠校对。如果靶蛋白质具有足够的溶解性，由靶蛋白和报告蛋白 组成的融合蛋白穿过大肠杆菌的内膜并到达周质。通过诸如抗生素抗性测量等方法检测 到达周质的融合蛋白，从而筛选具有所需溶解性程度的蛋白质（Fisheretal.，Protein Sci. 2006 15(3) :449-58)。由此可以看出，当重组蛋白时，不仅是在天然系统中的Tat途径 底物蛋白质被应用于Tat途径时，它也显著通过Tat途径，与重组蛋白的溶解性和稳定性 成正比（Limetal.，ProteinSci.2009 18(12):2537-49)。另外，已经报道，利用Tat途 径，有效筛选出允许在大肠杆菌的细胞质内进行蛋白质折叠的单链抗体（scFv)(FisherAC andDeLisaMP.JMolBiol. 2009 385(1) :299-311)。根据上述文献，分子定向进化是通过 使用在大肠杆菌中不溶的并表达为模板碱基序列的scFvl3完全在体外实现的。scFv内的 二硫键具有约4至6kcal/mol的水平，并有助于蛋白质分子的稳定化。这一键是形成在氧 化环境中，如细菌的周质或真核生物的内质网（ER)。细菌的周质通常通过电子在内膜上存 在的DsbA和DsbB之间的流动保持氧化条件。因此，在通过人工穿过Tat途径而从scFv改 造文库中选择的scFvl3蛋白的情况下，自主自我折叠、在还原条件细胞质而不是氧化条件 细胞质中没有形成二硫键的胞内抗体被优先选择。具体而言，当引导蛋白进入Tat途径的 信号序列融合到靶蛋白的N-末端并且TEM-1 0 -内酰胺酶融合到靶蛋白的C-末端（用作 报告基因）的基因在大肠杆菌内表达时，表达了三功能融合蛋白（tripartide)。
[0022] 表达的融合蛋白进入Tat途径，并且通过存在于内层细胞膜的Tat ABC转位酶复 合体的机制进行蛋白质折叠检查。一些研宄发现，在许多重组蛋白中，只有那些具有溶解 性的蛋白保持了与Tat途径的特定机制的兼容性（Sanders et al.，Mol. Microbiol. 2001 41(1) :241-6 ；DeLisa et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2003 100(10):6115-20 ；Matos et al.，EMB0 J. 2008 27 (15): 2055-63 ;Fisher AC and DeLisa MP.J. Mol. Biol. 2009 385(1):299-311 ；Lim et al. , Protein Sci.2009 18 (12):2537-49)〇
[0023] 但是，上述用于提高蛋白质的折叠特性的方法从未被应用于选择结构域抗体，特 别是，VH或VL结构域抗体等。
[0024] 总之，目前，人VH结构域抗体的改造修饰和筛选无一例外地是基于噬菌体展示和 与蛋白A的结合活性来进行（KristensenPandWinterG.Fold.Des. 1998 3(5) :321_8; Sieberetal. ,Nat.Biotechnol. 1998 16(10):955-60；Jungetal. ,J.Mol.Biol. 1999 294 (1): 163-80;W6mAandPlilckthunA.J.Mol.Biol. 2001 305 (5): 989-1010)。
[0025] 因此，迫切需要发展用于选择具有更有效的溶解性和高的热稳定性的VH结构域 抗体的方法，并且进一步地，迫切需要发展通过利用所选择的结构域抗体而具有改善功效 的最小单位的下一代抗体。
【发明内容】
[0026] 技术问题
[0027] 本发明的一个实施方案涉及提供一种命名为Tat相关蛋白质改造工程（TAPE)的 方法，能够有效地筛选具有溶解性和高的热稳定性的VH或VL结构域抗体。
[0028] 进一步地，本发明的一个实施方案涉及提供由TAPE法筛选的、具有溶解性和优异 的热稳定性的、人VH和VL结构域抗体和人或改造的VH和VL结构域抗体支架，以及提供所 述VH和VL结构域抗体和抗体支架的氨基酸序列，和编码它的多核苷酸。
[0029] 在含有根据本发明筛选的人或改造的VH或VL支架的VH或VL结构域抗体具有相 应的人或改造的VH或VL结构域抗体支架（不管CDR序列）的情况下，仍保留着溶解性和 热稳定性。
[0030] 进一步地，本发明的一个实施方案涉及提供一种在由TAPE法筛选的人VH或VL结 构域抗体支架中包括随机CDR序列的文库，及其制备方法。
[0031] 进一步地，本发明的一个实施方案涉及提供对使用所述库筛选的靶蛋白具有结合 能力的VH或VL结构域抗体，所述结构域抗体的氨基酸序列，及编码它的多核苷酸。
[0032] 解决技术问题的技术方案
[0033] 在一个总的方面，本发明提供了一种命名为Tat相关蛋白质改造工程（TAPE)的方 法，能够有效地从人免疫球蛋白可变结构域文库或组合文库中筛选配体，尤其是，具有高溶 解性和高的热稳定性的VH和VL结构域抗体。
[0034] 另外，本发明提供了用于筛选所述配体的系统、载体和宿主细胞，并提供了由TAPE 法筛选的配体，特别是VH和VL结构域抗体。
[0035] 令人惊讶地，我们发现，由根据本发明的TAPE法筛选的VH结构域抗体，只要保 留了VH结构域抗体支架，S卩，FR1至FR4框架，而不管被插入的⑶R序列，S卩，序列⑶R1至 CDR3,就具有高溶解性和热稳定性，以及保持高溶解性和热稳定性。
[0036] 从这个观点来看，本发明提供了由本发明的TAPE法筛选的VH结构域抗体支架，其 中随机的人源性或组合的⑶R序列，也就是，⑶R1至⑶R3序列，被插入到VH结构域抗体支 架，g卩，FR1至FR4框架中，以及构造它的方法。
[0037] 另外，本发明提供了从所构建的文库中筛选具有靶向与靶蛋白结合能力的VH结 构域抗体的方法。
[0038] 在本发明提供的具有高的溶解性和热稳定性的VH结构域抗体支架，S卩，FR1至FR4 框架，具有下面的氨基酸序列：
[0039] FR1的氨基酸序列：
[0040] XoVQLXAXsGXAXJAPGXgSXioXnXuXJXMXMXwGXiAAg-式1)
[0041] 在式1)中，
[0042] X。是 E或Q，
[0043] X# V或