白是TEM-I β -内酰胺酶，并 且所述Tat信号序列是TorA。
8. -种载体，包含权利要求1至7中任一项的基因构建体。
9. 根据权利要求8的载体，其中所述载体是选自pET22b、pAE34、pET9a和ΛρΜΚ的组 中的任一种载体，并且所述基因构建体被插入到所选定的载体中。
10. 根据权利要求8的载体，其中所述载体是ρΕΤ-ΤΑΡΕ。
11. 一种转化有权利要求8的载体的宿主细胞。
12. 根据权利要求11的载体，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
13. -种宿主细胞群，包含一种或多种转化有权利要求1至7中任一项的基因构建体的 宿主细胞。
14. 根据权利要求13的宿主细胞群，其中在宿主细胞群中包括的宿主细胞转化有分别 编码各包括不同的靶蛋白的融合蛋白的基因构建体。
15. 根据权利要求13的宿主细胞群，其中所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌菌株。
16. -种筛选可溶性靶蛋白的方法，该方法包括： (1) 在含有抗生素的液体培养基中培养权利要求13的宿主细胞群； (2) 收集存活的宿主细胞以收集质粒DNA ; (3) 从收集的质粒DNA中收集编码靶蛋白的核酸序列；和 (4) 从收集的核酸序列中确认并筛选靶蛋白的序列。
17. 根据权利要求16的方法，还包括，在步骤⑶后，选自下组的一个阶段： (3'）制备基因构建体，其中所收集的核酸序列被再次功能性地连接到编码Tat-信号 序列的基因和抗生素抗性基因，然后再用制备的基因构建体转化该宿主细胞群， 和， (3"）直接用含有所收集的核酸序列的质粒转化宿主细胞群，而不制备单独的基因构建 体， 其中，阶段（1)至（3'）或阶段（1)至（3"）被重复两轮或更多轮。
18. 根据权利要求16或17的方法，其中所述抗生素是氨苄青霉素或羧苄青霉素。
19. 根据权利要求17的方法，其中所述抗生素是在重复所述轮时以逐渐增加的浓度加 入。
20. 根据权利要求16所述的方法，其中所述抗生素在初始轮时具有0. 05至0. 2 μ g/ml 的浓度。
21. -种可溶性VH结构域抗体支架，具有下面的FRl至FR4的氨基酸序列： (1) FRl =X0VqlxiX2X3GX4X 5X6X7X8PGX9SX 10X11X12X13CX14X 15X16GX17X18X19 在FRl的氨基酸序列中， X。 是E或Q， X2是E，或Q， 父3是S，或A， 父4是6,或A， 父5是6，厘，1 V，或E， V，或 W， 父7是￥，K，A，或I， 父8是0, K，或H， 父9是6，1'，六，1?4,5，或1'， XI。 是 L，V，R，或 M， X1^R,或 K， 父12是1，I，或V， 父13是S，A，或T， 父14是六4，￥，1?，I，K，T，或 S， 父15是六，6，卩，V，或Τ， 父16是34，或￥， 父17是？，丫，1?，6，或1^ X1；^T，A，S，N，T，P，Ι，Ν，Η，或 Α， 父19是？，1^，￥，或(：； (2) FR2 =WX20RX21X22PGX23GX 24X25X26X27X28 在FR2的氨基酸序列中， 父2(1是V，Α，或L， 父21是 Q，N，R，I，Κ，Υ，V，M，S，Q，W，F，L，V，或 C， 父22是六，6，1(，S，V，M，或 Τ， 父23是1(，〇4，1?，或1'， &4是 L，N，I，P，Y，T，V，W，A，R，M，或 S， X2^V,或 E， 父26是1，I，V，P，F，H，M，Y，L，C，或 R， 父27是 V，M，I，或 L， 父28是3^，或6; (3) FR3 ：X29X3〇X3iX32X33X34X35X36X37X38X3A〇X4lX42X43X4A5X46X47X48X49X5〇X5lDX52X53X54YX55CX56X57 在FR3的氨基酸序列中， 父29是1?，11，〇，或1'， X3。是 F，V，L，或 I， X3#T，S，或 I， 父32是 I，L，V，M，或 R， 父33是S，T，或D， 父34是1?4，￥，1或1， 父35是〇，1或八， X3f^N，T，D，I，R，K，Y，或 E， 父37是六，S，V，或T， X39是 ^!'，!(。^，或乂， 父41是1，V，A，或 Μ， X42是F，Y，N，D，H，或S， 父43是L，或M， 父44是93，札或1 父45是11^，￥，I，或 W， X46是 N，T，K，D，Y，I，或 S， 父47是S或N， 父48是L或V， X4i^R，K，或 T， 父5。是0，六，5，？，1'，￥，1，或5， X51是E，A，D，或S， ^是！^，或S， 父53是S，A，或G， 父54是 V，I，L，或 M， 父55是Y或F， X5f^A，G，V，或 S， 父57是1?，3，1(，1'，1^，1 或 F;和 (4)FR4 ：X58GX59GX60X61VTVSS 在FR4的氨基酸序列中， 父58是1(：，￥，6,5，或八， 父59是0，1?，或L， X6tl是 A，T，I，或 V， 父61是1^，1^，V，或 T。
22.根据权利要求21的VH结构域抗体支架，其中所述FRl至FR4具有下面的氨基酸序 列： (I) FRl AciVqlxiX2Sggx5X6X 7X8Pgx9SXiciRX12SCX 14X15SGX17X18X19 在FRl的氨基酸序列中， X。是E或Q， 父2是E或Q， X5是G，N，V，或E， 父6是L或V， 心是V或K， 父8是Q，K或H， 父9是6，1'，六，1?4，或1'， 父1(1是L或V， 父12是L或V， 父14是六4, V，I，K，或S， 父15是六，6,或V， 父17是？，丫，1?，6，或1^ X1；^T，A，S，N，T，P，Ι，Ν，Η，或 Α，和 父19是？，1^，￥，或(：； (2) FR2 ：ffVRX21X22PGX23GX24X 25X26X27X28 在FR2的氨基酸序列中， 父21是 Q，N，R，I，Κ，Υ，V，M，S，Q，W，F，L，V，或 C， \2是六，6，1(，S，或 Μ， 父23是1(，〇4，1?，或1'， &4是 L，Ν，I，Ρ，Υ，Τ，V，W，A，R，Μ，或 S， 乂25是V或Ε， 父26是1，I，V，P，F，H，M，Y，L，C，或 R， 父27是V，M，I，或L，和 父28是3^，或6; ⑶ FR3 :rx30tx32sx34dx36x37x 38x39x40x41x42x 43x44x45x46x47x 48x49x50x51dtax54yx 55cx56x57 在FR3的氨基酸序列中， X3。是 F，V，L，或 I， 父32是 I，L，V，或 M， 父34是1?4, V，或 I， X3f^N，T，D，I，R，K，Y，或 E， 父37是六，S，V，或T， X39是 ^!'，!(。^，或乂， 父41是1，V，A，或 M， X42是F，Y，N，D，H，或S， 父43是L或M， 父44是93，札或1 父45是11^，￥，I，或 W， X46是 N，T，K，D，Y，I，或 S， 父47是S或N， 父48是L或V， X4i^R，K，或 T， 父5。是0，六，5，？，1'，￥，1，或5， X51是E，A，D，或S， 父54是 V，I，L，或 M， 父55是Y或F， X5f^A，G，V，或 S，和 父57是1?，3，1(，1'，1^，1或 F 和 (4) FR4 ：X58GQGX60X61VTVSS 在FR4的氨基酸序列中， 父58是1(：，￥，6,5，或八， X6tl是 A，T，I，或 V，和 父61是1^^，V，或 T。
23.根据权利要求21的VH结构域抗体支架，其中所述VH结构域抗体支架是选自具有 下面的FRl至FR4的氨基酸序列的支架。
24.根据权利要求21的VH结构域抗体支架，其中所述VH结构域抗体支架是选自具有 下面的FRl至FR4的氨基酸序列的支架。
选自CDRHl的位置30和31，CDRH2的位置53和CDRH3的位置97、99、100和IOOa中的一个 或多个位置诱导的。
33. 根据权利要求28的VH结构域抗体文库，其中所述文库是天然的、合成的或免疫文
34. -种使用根据权利要求28的文库，筛选对所需抗原具有结合能力的VH结构域抗体 的方法。
35. 根据权利要求33的方法，其中所述筛选VH结构域抗体是通过除了被结合到其上的 VH结构域以外，洗脱未结合到固定的所需抗原的VH结构域抗体来执行的。
36. 根据权利要求34的方法，其中所述洗脱未结合到固定的所需抗原的VH结构域抗体 被重复两次或更多次。
【专利摘要】本发明涉及被称作Tat相关蛋白质改造工程(TAPE)的方法，通过将靶蛋白和抗生素抗性蛋白连接到Tat信号序列并在大肠杆菌内表达它，筛选具有更高的溶解性和优异的热稳定性的靶蛋白，特别是源自人生殖细胞的免疫球蛋白可变结构域(VH或VL)，以及由TAPE法筛选的、具有溶解性和优异的热稳定性的、人或改造的VH和VL结构域抗体和人或改造的VH和VL结构域抗体支架。还提供了在由TAPE法筛选的人或改造的VH或VL结构域抗体支架中包括随机CDR序列的文库，以及其制备方法。海通了使用该文库筛选的具有靶蛋白质结合能力的VH或VL结构域抗体，包括该结构域抗体的药物组合物。
【IPC分类】C07K16-28, C07K19-00, C12N15-63, C12N15-62, C12N15-13, G01N33-53
【公开号】CN104769113
【申请号】CN201280076586
【发明人】李滢权, 金圣根, 朴荣燮, 南效廷, 金董植, 朴在燦, 尹桦
【申请人】财团法人牧岩生命工学研究所
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2012年8月22日
【公告号】EP2888367A1, WO2014030780A1