过表达BnNRT1-3基因提高油菜氮素利用率的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于油菜转基因技术领域，具体设及过表达化NRT1-3基因提高油菜氮素 利用率。
【背景技术】
[0002] 氮素（脚对植物产量和品质的形成起着至关重要的作用。我国是世界农业生产大 国，广泛种植有水稻、玉米、小麦、油菜、棉花等农作物。虽然我国的耕地面积只有全球耕地 面积的8%左右，但化肥（氮肥）使用量却占到了全球的1/3,接近35%。究其原因，主要 有W下两个方面；一是我国农作物的氮肥利用效率低，如水稻、玉米和小麦氮肥平均利用率 为28. 7% (目湘等，2008)，油菜氮肥平均表观利用率为34.6% (邹娟等，2011)，远远低于 发达国家的50%W上；二是我国在氮肥使用上存在不合理之处，往往发达地区用量过剩而 贫困地区用量不足，该进一步导致了氮肥的有效利用率下降。氮肥的使用量过多W及氮素 利用率下降导致了农业生态环境的急剧恶化，同时也带来了诸多环境问题，如±壤酸化、水 体富营养化W及臭氧层破坏等。因此，提高氮素利用效率，减少氮肥使用量，不仅有利于农 作物产量潜力的发挥，提高农作物品质，更能促进农业的健康可持续发展。
[0003] 关于提高植物氮素利用效率，目前的研究往往集中在如何通过优化氮肥管理、合 理施用氮肥W及改革种植制度等措施来实现，但实际操作存在一定的障碍，因为不同的作 物对氮肥的需求在量上和时间上均存在差异，无法形成统一的标准。虽然在氮营养高效种 植资源的收集、鉴定与筛选方面有一些报道，如水稻（童汉华等，2007)、玉米（周联东等， 2003)、棉花（韩踰和张薇，2011)中，W期解析氮高效的遗传基础，但进展缓慢。植物主要是 从±壤中获取氮营养元素的，该其中设及到一系列的N吸收与转运系统。硝态氮是植物利 用氮素的主要形态，硝酸盐转运子在植物的N吸收与转运方面起着重要的作用。
[0004] 植物硝酸盐转运子包含两个基因家族，其中NRT1/PTR基因家族主要为低亲和转 运子，称为低亲和转运系统（LATS) ;NRT2基因家族为高亲和转运子，称为高亲和转运系统 (HATS)，在外界硝酸根离子浓度很低时发挥作用。正常情况下，植物对硝态氮的吸收主要 依赖于LATS。目前在拟南芥中研究得比较清楚的LATS成员主要有AtNRTl. 1、AtNRTl. 2、 AtNRTl. 3、AtNRTl. 4、AtNRTl. 5、AtNRTl.6、AtNRTl. 7、AtNRTl.8和AtNRTl. 9(Wanget al.，2012)。其中AtNRTl. 1 和AtNRTl. 2 负责N的吸收（Liuetal.，1999;Okamotoet al.，2003) ;AtNRT1.4对维持叶片的硝酸根离子稳态有重要作用（化iuetal.，2004); AtNRTl. 5、AtNRTl.6、AtNRTl.8和AtNRTl. 9 与N的转运相关（Linetal.，2008;Almagro etal.，2008;Lietal.，2010;Wangetal.，2011) ;AtNRT1.7 负责N的再利用（Fanet al.，2009)。AtNRTl. 3是诱导型的N转运子，其功能研究还不清楚。有研究表明，在豆科模 式植物裝襲首猜（Medicagotruncatula)中，化NRT1.3为双亲和型转运子，在植物缺氮时 上调表达，促进植物对N的吸收（Mor紅e-Leetal.，2011)。另外在小麦中，与AtNRT1.3同 源的基因TaNPF6.6的表达模式和对N的反应亦不同于拟南芥，其在根中表达且对缺氮表现 为上调表达化uchnerandHawkesford，2014)。由此可见，NRTL3基因的功能在不同的物 种中有所差异，总体来看其对植物N的吸收与利用具有正向效应。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是确定甘藍型油菜中化NRT1-3基因在N吸收与利用方面的功能，设 及化NRT1-3在提高植物氮素利用效率方面的应用，W培育氮高效的农作物。
[0006] 为了实现上述目的，本发明通过W下技术方案实现：
[0007] 本发明首先克隆了甘藍型油菜中NRT1. 3的同源基因，申请人将该基因命名为 化NRT1-3基因，在CaMV35S启动子控制下在甘藍型油菜中过量表达化NRT1-3基因，能提高 油菜的氮素利用效率。
[000引所述的硝酸盐转运子化NRT1-3基因的核巧酸序列如序列表SEQIDNO;l中第 1-1914位碱基所示的序列所示，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO;1中第1-1914位碱基 所不的序列所不，该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO;1所不。
[0009] 该基因调控甘藍型油菜对氮素利用效率的提高主要表现为增加了植株干物质的 量。
[0010] 利用引物对F46和R46-U见序列表SEQIDN0;3,4)，通过RT-PCR技术从甘藍型 油菜中克隆硝酸盐转运子化NRT1-3基因，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物 转基因操作，获得转基因植株。研究结果表明化NRT1-3过表达植株的氮素利用效率明显高 于野生型（WT)。
[0011] 本发明确定了化NRT1-3基因在提局植物氮素利用效率方面的作用，为利用转基 因的手段培育氮高效的植物奠定了基础。
【附图说明】
[001引 1、序列表SEQIDN0;1是本发明克隆的化NRT1-3基因的核巧酸序列，序列长度为 1914bp，其中178-1914位碱基对应的序列是该基因的CDS区，编码578个氨基酸序列。
[001引 2、序列表SEQIDNO;2是本发明克隆的化NRT1-3基因编码的蛋白质序列。
[0014] 3、SEQIDNO;3和SEQIDNO;4是扩增化NRT1-3基因的特异引物对，我们将其命 名为引物F46和引物R46-1 ;其中；BnACT2-F/BnACT2-R为BnActin2内参基因的扩增引物。
[0015] 图1 ;本发明的其中一个实施例的过表达植物表达载体地nNRTl-3的构建。图1中 的A图为PCAMBIA1300载体图；图1中的B图为pCAMBIA1300s载体示意图；图1中的C图 为本发明构建的地nNRTl-3载体的示意图。
[0016] 图2 ;BnNRTl-3过表达转基因株系的表达分析。图中；WT为野生型（非转基因） 对照，其余编号对应不同的转基因株系。编号1表示转基因株系D-1，编号2表示转基因株 系D-2，W此类推。图中化NRT1-3的扩增引物对为F46/R46-U引物序列见表1) ;BnActin2 内参基因的扩增引物对为BnACT2-F/BnACT2-R(引物序列见表1)。
[0017] 图3 ;野生型与化NRT1-3过表达株系在不同浓度硝酸盐生长条件下的干重比较。 过表达植株和野生型植株均在1/4化agland营养液中培养两周，之后移入不同硝酸盐浓度 的1/2化agland营养液中继续培养生长S周，取地上部分称取干重，实验进行两次重复。其 中WT为野生型对照，D-2、D-19和D-25为S个过表达株系。误差线为标准偏差，*和**分 别表示转基因植株同野生型植株t测验在P<0. 05和P<0. 01水平下差异显著。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1甘藍型油菜化NRT1-3基因的克隆
[0019] 1.克隆甘藍型油菜化NRT1-3基因的cDNA序列
[0020] 根据甘藍型油菜基因组参考序列（ht1:p://www.genoscope.cns.fr/ brassicanapus/)获得化NRTl-3的基因组序列信息炬naA05gl9580D)。根据基因组序列信 息设计引物对F46和R46-U该引物序列见说明书表1和序列表SEQIDN0:3和4)。其中 F46为正向引物，含有甜aI酶切接头；R46-1为反向引物，含有PstI酶切接头。由于甘 藍型油菜角果皮和种子的巧片结果显示化NRT1-3在角果发育后期的角果皮中有较强的表 达，于是利用TransZolPlant试剂盒（购自北京全式金生物技术有限公司）提取甘藍型油 菜角果发育42d后的角果皮的RNA(具体操作步骤见试剂盒说明书）。利用RT-PCR的方法， 使用高保真的TransStartFas巧化DNAPolymerase(购自北京全式金生物技术有限公司） 扩增化NRT1-3 的cDNA序列。PCR反应条件为 95°Clmin;95°C20s，54°C20s，72°C50s，40 个循环；72°C5min。将克隆得到的产物连入祀ASY-Blunt载体（购自北京全式金生物技术 有限公司）中，构建测序中间载体，命名为祀ASY-NRT1.3,进行序列测定，验证克隆序列的 正确性。
[0021] 2.甘藍型油菜的化NRT1-3基因的序列信息和特性分析
[002引甘藍型油菜化NRT1-3基因编码区cDNA为1737bp，编码578个氨基酸。克隆得到 的SEQ ID NO ;1序列包含了化NRT1-3基因5' UTR区段的177个碱基。化NRT1-3蛋白与 AtNRTl. 3和MtNRTl. 3的同源性分别为89%和70%。通过ProtComp 9. 0软件预测化NRT1-3 蛋白定位于细胞膜，该与其功能相一致。
[0023] 实施例2化NRT1-3转基因植株的获得
[0024] 1.含有化NRT1-3编码区cDNA表达载体的构建
[0025] 将实施例1中包含化NRT1-3基因的pEASY-NRTl. 3载体质粒用甜aI和PstI双 酶切后，将酶切下的片段与用相应酶酶切后的PCAMBIA1300S载体质粒的载体部分相连，得 到WCaMV35S启动子驱动化NRT1-3过表达的植物表达载体，我们将其命名为地nNRTl-3 载体（如图1中C图所示）。其中pCAMBIA1300s载体是通过PCAMBIA1300载体（购自YRGene 公司，货号；VAC0323)改造而来。首先将pCAMBIA1300载体（如图l中A图所示）用Handm 和EcoRI进行双酶切，切下多克隆位点部分；然后将含