gauuggaccucaaug-3' (SEQIDN0:226)，
[0268] 5' -cugauggauuugagguuac-3' (SEQIDN0:227)，
[0269] 5f -ccucaagaagugagauguc-3/(SEQIDNO:228),
[0270] 5' -gagccgacuaugacuacuc-3' (SEQIDN0:229)，
[0271] 5' -gauucagucagaguugaac-3' （SEQIDN0:230)
[0272] 本文用到的术语"双调蛋白特异性-siRNA"指的是对编码双调蛋白的基因具有特 异性的siRNA。此外，对于本领域内的技术人员来说，显然包含一条有义链和一条反义链的 双调蛋白特异性-siRNA，上述siRNA的有义链包含一个或多个核苷酸的置换，删除或插入， 且具有选自SEQIDN0:1至230的序列，其反义链具有与有义链互补的序列，只要它对双调 蛋白具有特异性，也在本发明的范畴内。
[0273] 基于本发明的双调蛋白特异性-siRNA具有与编码双调蛋白的mRNA互补结合的核 苷酸序列，从而能有效抑制双调蛋白的表达。而且，siRNA的一条或两条链的3'端可包含 一个具有一个或两个或更多的未配对的核苷酸突出。
[0274] 此外，为了增加siRNA的体内稳定性，siRNA可包含用于赋予核酸酶抗性和减少非 特异性免疫反应的各种化学修饰。
[0275] 本发明的siRNA的第一或者第二寡核糖核苷酸的修饰可以是选自以下修饰中的 至少一种，或者两种及以上的结合：一个或多个核苷酸的糖结构的2'碳位置上的OH基团 被-CH3 (甲基），-OCH3 (甲氧基），-NH2, -F (氟基），-0-2-甲氧乙基-〇-丙烷基，-0-2-甲 硫基，-0-3-丙氨基，-0-3-二甲基氨丙基，-0-N-甲基乙酰胺或-0-二甲氨基乙氧基取 代的修饰；核苷酸中的糖结构的氧被硫取代的修饰；核苷酸与磷硫酰、硼氢化磷酸盐或甲 基膦酸酯键之间的化学键的修饰；对PNA(核酸肽），LNA(锁核酸）或UNA(未锁核酸） 的修饰（Ann. Rev. Med. 55, 61-652004 ;US 5, 660, 985 ;US 5, 958, 691 ;US6, 531，584 ;US 5, 808, 023 ；US 6, 326, 358 ；US 6, 175, 001 ；Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003 ； RNA, 9: 1034-1048, 2003 ；Nucleic Acid Res.31:589-595, 2003 ；Nucleic Acids Research, 38(17)5761 - 5773, 2010 ;Nucleic Acids Research, 39(5) 1823 - 1832, 2011)。
[0276] 根据本发明，在这些双调蛋白特异性-siRNAs中，包含具有选自SEQ ID NO: 1至30 的序列的有义链的siRNA是对小鼠双调蛋白特异的，包含具有选自SEQ ID N0:31至230的 序列的有义链的siRNA是对人类双调蛋白特异的。本发明发现分别包含具有任意一条SEQ ID NO: 1至230的序列的有义链的siRNA均能有效抑制双调蛋白的表达。
[0277] 另一方面，本发明提供了一种双链寡核糖核苷酸结构，即siRNA配合物，为了确保 siRNA在体内的有效传送并增加siRNA的稳定性，在上述siRNA配合物中，一个或多个亲水 性的多聚物和疏水性的多聚物分别结合在双调蛋白特异性-siRNA的两端。这里用到的术 语"双链寡核糖核苷酸结构"指的是一种包含一个或多个分别结合在siRNA或shRNA两端 的亲水性多聚物和疏水性多聚物的一种双链寡核糖核苷酸结构。
[0278] 上述双链寡核糖核苷酸结构通过疏水多聚物部分的疏水作用形成自组装的纳米 颗粒（参见 Korean Patent Laid-Open Publication No. 2010-123214)。该配合物的优势 在于它具有很高的体内传送效力和体内稳定性，且颗粒大小分布一致，因此该配合物的质 量控制（QC)容易从而使得用该配合物制备药物的过程变得简单。
[0279] 特别地，根据本发明的双调蛋白特异性-双链寡核糖核苷酸结构优选地具有以下 结构式（1)代表的结构：
[0280] 结构式（1)
[0281] A-X-R-Y-B
[0282] 其中A代表亲水性化合物，B代表疏水性化合物，X和Y各单独代表简单的共价键 或者由连接物-介导的共价键，R代表双调蛋白特异性-siRNA。
[0283] 更优选地，根据本发明的双调蛋白特异性-的双链寡核糖核苷酸结构具有以下结 构式（2)代表的结构：
[0284] 结构式（2)
[0285] A-X-S-Y-B
[0286] AS
[0287] 在上述结构式（2)中，A代表亲水性化合物，B代表疏水性化合物，X和Y各单独代 表简单的共价键或者由连接物介导的共价键，S代表双调蛋白特异性-siRNA的有义链，AS 代表双调蛋白特异性-siRNA的反义链。
[0288] 更优选地，包含双调蛋白特异性-siRNA的双调蛋白特异性-双链寡核糖核苷酸结 构具有以下结构式（3)代表的结构：
[0289] 结构式（3)
[0290] AH S 3，-Y-B
[0291] AS
[0292] 在上述结构式（3)中，A代表亲水性化合物，B代表疏水性化合物，X和Y各单独代 表简单的共价键或者由连接物介导的共价键，S代表双调蛋白特异性-siRNA的有义链，AS 代表双调蛋白特异性-siRNA的反义链。
[0293] 包含有结构式（1)至（3)表示的双调蛋白特异性-siRNA的双链寡核糖核苷酸结 构中的反义链的5'端可结合1到3个磷酸基团。且，对本领域内的技术人员来说，显然 shRNA可替代结构式（1)至（3)中的siRNA。
[0294] 优选地，以上结构式（1)至（3)中的亲水性化合物为分子量200-10, 000的阳离子 或非离子型多聚物化合物，更优选地，为分子量1，000-2, 000的非离子型多聚物化合物。例 如，在本发明中用到的亲水性多聚物化合物优选地为非离子型亲水性多聚物化合物，比如 聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮或聚恶唑啉，但不限于上述物质。
[0295] 结构式（1)至（3)中的疏水性化合物（B)的作用是通过疏水相互作用形成由结构 式（1)表示的寡核苷酸结构组成的纳米颗粒。优选地，疏水性化合物具有250-1，000的分 子量，可以是类固醇衍生物，甘油酯衍生物，丙三醇醚，聚丙二醇，C 12-C5(l的非饱和或饱和碳 氢物，二酰基卵磷脂，脂肪酸，磷脂，脂肪胺或类似物，但不限于上述物质。对本领域内的技 术人员来说，显然可以用任何疏水性化合物，只要它符合本发明的目的，
[0296] 类固醇衍生物可选自胆固醇，胆留烷醇，胆酸，胆固醇甲酸盐和胆固醇胺，在所述 类固醇衍生物中甘油酯衍生物可以选自单_甘油醋，双-甘油酯和三-甘油醋，及类似物。 这里，甘油酯脂肪酸优选c12-c5(l的饱和或不饱和脂肪酸。
[0297] 特别地，在上述疏水性化合物中，优选使用饱和或不饱和碳氢化合物或胆固醇，因 为饱和或不饱和碳氢化合物或胆固醇容易参与到合成本发明的寡核苷酸结构的过程中。上 述疏水性化合物可结合到亲水性化合物的末端，且可结合到siRNA的有义链或反义链上的 任何位置。
[0298] 本发明结构式（1)至（3)中的亲水性化合物或疏水性化合物通过单个共价键或由 连接物介导的共价键（X或Y)结合到双调蛋白特异性-siRNA上。介导上述共价键的连接 物是共价结合在双调蛋白特异性-siRNA末端的亲水性或疏水性化合物上，且不受特别限 制只要它在特定环境中，如果需要的话能提供可降解的键。因此，本发明用到的连接物可以 是任何化合物，结合它为了在制备本发明的双链寡核糖核苷酸结构的过程中激活双调蛋白 特异性-siRNA和/或亲水性（或疏水性）化合物。上述共价键可以是可降解键和不可降 解键中的一个。在这里，不可降解键的例子包括但不限于，酰胺键和磷酸键，可降解键的例 子包括但不限于，二硫键，可降解酸键，酯键，酐键，可生物降解的键和可酶解的键。
[0299] 任何具有特异性结合到双调蛋白上的性质的siRNA均可用作在结构式（1)至（3) 中R(或S和AS)代表的双调蛋白特异性-siRNA，没有限制。优选地，在本发明中用到的 siRNA包含了有义和反义链链，所述有义链具有任意一条SEQ ID NO: 1至230的序列，所述 反义链具有与有义链互补的序列。
[0300] 在又另一方面，本发明提供了包含双调蛋白特异性-双链寡核糖核苷酸结构的纳 米颗粒。
[0301] 如上所述，包含了双调蛋白特异性-siRNA的双调蛋白特异性-双链寡核糖核苷酸 结构是一种包含亲水性化合物和疏水性化合物的两性结构，在该两性结构中，亲水性部分 通过与体内水分子的相互作用（例如氢键）而面向结构的外侧定位，疏水性化合物部分通 过与水分子之间的疏水作用而朝向结构内侧定位，由此形成热力学稳定的纳米颗粒。也就 是说，疏水性化合物位于纳米颗粒的中心，亲水性化合物位于双调蛋白特异性-siRNA的外 侦牝包裹双调蛋白特异性-siRNA，从而形成纳米颗粒。如上所述形成的纳米颗粒增强了双调 蛋白特异性-siRNA的细胞内传送并增加了双调蛋白特异性-siRNA的效能。
[0302] 本发明的纳米颗粒的特点在于，它们可以仅由包含具有相同序列的siRNAS的双 链寡核糖核苷酸结构组成，或者仅由包含具有不同序列的siRNAS的双链寡核糖核苷酸结 构组成。也就是说，在对双调蛋白具有相同的目标基因特异性的同时，siRNAs可以有不同 的序列。而且，上述纳米颗粒也可包括由对癌症特异性目标基因而非双调蛋白具有特异性 的siRNAs组成的双链寡核糖核苷酸结构。
[0303] 优选地，包括在本发明纳米颗粒的双链寡核糖核苷酸结构中的双调蛋白特异 性-siRNA包含具有SEQ ID NO: 1至230的序列中任一条的有义链，和具有与有义链互补的 序列反义链，但不限于上述物质，且对于本领域的技术人员而言，显然任何具有双调蛋白特 异性且符合本发明目的的siRNA都可使用。
[0304] 本发明还提供了预防或治疗呼吸道疾病的组合物，该组合物包括双调蛋白特异 性-siRNA，包含了上述双调蛋白特异性-siRNA的双链寡核糖核苷酸结构和/或包含了上述 双链寡核糖核苷酸结构的纳米颗粒。
[0305] 根据本发明，上述包括双调蛋白特异性_s iRNA，包含了上述双调蛋白特异 性-siRNA的双链寡核糖核苷酸结构和/或包含了上述双链寡核糖核苷酸结构的纳米颗粒 的组合物通过抑制肺动脉重构和气道重构显示出预防或治疗呼吸道极影的效果。因此，本 发明的该组合物对预防或治疗呼吸道疾病有效，上述呼吸道疾病包括哮喘，慢性阻塞性肺 疾病（C0PD)，特发性肺纤维变性（IPF)，急性/慢性支气管炎，过敏性鼻炎，咳嗽，痰多，急性 下呼吸道感染（支气管炎和细支气管炎），以及急性上呼吸道感染如喉咙痛，扁桃体炎或喉 炎。
[0306] 除上述活性成分外，本发明的该组合物可包含一种或多种药物可接受的载体。上 述药物可接受载体应与活性成分相容，可以是选自以下物质中的一种：生理盐水，蒸馏水， 林格液，缓冲盐水，葡萄糖溶液，麦芽糊精溶液，甘油，乙醇及上述成分中两种或两种以上成 分的混合物。若需要，上述组合物可含有其它传统的添加剂比如抗氧化剂、缓冲液或抑菌 剂。此外，上述组合物可额外地添加稀释液，分散剂，表面活性剂，粘合剂和润滑剂来制备 可注射的配方，如水溶液，悬浮液和乳剂。特别地，上述组合物优选地选用冻干剂。可用 本发明所属技术领域中的传统方法制备冻干剂，也可在冻干剂中添加稳定剂。此外，可根 据针对的疾病或成分的不同通过本领域内的适合的方法或Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA中公开的方法优选地制备上述组合物。
[0307] 一般可由本领域内的技术人员根据病人的身体状况和疾病的严重性来决定本发 明的组合物中活性成分的含量和服用该组合物的方法。此外，该组合物可制备成各种剂型， 包括粉剂，片剂，胶囊，液体制剂，可注射用的溶液，膏剂和糖浆剂，也可通过使用一个剂量 单位或多剂量容器比如封闭的安瓿或者小瓶的形式来提供。
[0308] 本发明的组合物可以口服或者不经肠道给予。本发明的该组合物可通过以下方式 给予，例如，口服，静脉注射，肌肉注射，动脉注射，髓给药，皮内注射，心脏注射，经皮给药， 皮下注射，腹膜注射，直肠内给药，舌下给药或局部给药，但不限于上述方式。特别地，为了 治疗呼吸道疾病，本发明的组合物可通过支气管内点滴法给予至肺部。该组合物的剂量可 根据病人的体重，年龄，性别，健康状况和饮食而不同，本领域内的技术人员可以容易地确 定该组合物的服用时间，服用方式，排泄率，疾病的严重性，或类似问题。此外，本发明的组 合物可通过已知技术制备成适合临床服用的剂型。
[0309] 而且，本发明提供了根据本发明的双调蛋白特异性-siRNA，包含双调蛋白特异 性-siRNA的双链寡核糖核苷酸结构，或包含上述成分的组合物或纳米颗粒在制备用于预 防或治疗呼吸道疾病的药物中的用途。另外，本发明提供了预防或治疗呼吸道疾病的方法， 该方法包括向有需要的病人给予本发明的双链寡核糖核苷酸结构或包含上述结构的组合 物或纳米颗粒。
[0310] 实施例
[0311] 下文将用具体的实施例来进一步详细地描述本发明。对本领域内的普通技术人员 来说，显然这些实施例仅是为了达到详细阐述的目的而不是来限制或改变本发明的范围。
[0312]实施例1:目标核苷酸序列的设计和siRNA的制各
[0313] 根据小鼠的双调蛋白mRNA序列（NM_009704_verl)，设计了可结合上siRNA的 目标核苷酸序列（有义链），制备出一个包含一条与目标核苷酸序列互补的反义链的 siRNA (Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984)。特别地，根据上述双调蛋白 mRNA 的序列（NM_009704)，利用由Bioneer (韩国）开发的基因设计软件，设计了可结合上siRNA 的目标核苷酸序列。本发明的双调蛋白siRNA具有包含了由19个核苷酸组成的有义链和 与有义链序列互补的反义链的双链结构。通过利用氰乙基亚磷酰胺连接RNA骨架结构 中的磷酸二酯键，制备了上述 siRNA (Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984)。特别 地，一系列包括解阻断，耦合，氧化，和加帽的过程通过利用RNA合成剂在结合了核苷酸的 固体支持物上反复进行（384Synthesizer，BIONEER, KOREA)，从而得到包含了具有所期望长 度的RNA的反应产物。利用配备了 Daisogel C18柱（Daiso，日本）的HPLC918(日本分析 工业，日本）将上述RNA从反应产物中分离纯化出来，并利用MALDI-T0F质谱仪对其进行 分析，确认它是否与期望的核苷酸序列一致。接下来，RNA的有义链与反义链互相结合，从 而制备包含具有SEQ ID NO: 1至30各一序列的有义链的双链siRNAs。
[0314]实施例2 :通讨siRNA抑制成纤维（NIH3T3)细朐株内的双调蛋白的表汰
[0315] 用上述双调蛋白特异性_siRNAs(实施例1制备的）转化小鼠成纤维细胞 (NIH3T3)株，上述双调蛋白特异性-siRNAs分别具有S