本发明构建双链突变体文库的一种实施方式中，直接以含单链突变体文库的 PCR混合物作为模板，或者以经柱纯化回收后的单链突变体文库作为模板进行第二轮PCR 制备全长完整的双链突变体基因产物时，只需经过少数循环，就能得到大量双链突变体。
[0025] 在本发明构建双链突变体文库的一种实施方式中，直接向构建单链突变体文库的 反应体系中添加特异结合单链突变体的引物，进行边PCR获得单链突变体边进行双链化反 应的一步PCR时，是将上、下游锚点引物、编辑引物与模板DNA以适当摩尔比混合，同时，分 别加入2-5倍锚点引物量的上、下游外端引物，添加DNA聚合酶、DNA连接酶和反应缓冲液； 反应缓冲液中Mg 2+浓度为1-lOmM，PCR退火温度为40-66°C，PCR延伸温度为65-72°C，PCR 反应循环数为1-35个。PCR产物含大量的双链突变体，及极少量的模板DNA。
[0026] 在本发明所述一步PCR的一种实施方式中，为避免退火过程中，锚点引物与外端 引物的结合，锚点引物中锚点序列的长度约占锚点引物长度的三分之一。
[0027] 在本发明所述一步PCR的一种实施方式中，上（下）游锚点引物为60bp，其中40bp 与亲本模板完全匹配，还有20bp的锚点序列；上（下）游外端引物长度为20bp，与锚点序 列相同或互补。
[0028] 在本发明所述一步PCR的一种实施方式中，上（下）游锚点引物和上（下）游外 端引物的添加量为1 : (2-5)，过量的上（下）游外端引物能使生成的突变单链完全双链化 成双链突变体。
[0029] 在本发明的一种实施方式中，采用的DNA聚合酶为高保真的耐热DNA聚合酶，优选 5' -3'外切酶活性缺失的高保真DNA聚合酶，如Phusion DNApolymerase(NEB)。
[0030] 在本发明的一种实施方式中，采用的DNA连接酶为耐热DNA连接酶，如Taq DNAligase(NEB)、9N DNAligase(NEB)和 Ampligase(EPI)，优选 Ampligase。
[0031] 为筛选突变体，可将突变体文库与载体通过体外组装技术进行整合。
[0032] 所述的体外组装技术可以为融合PCR、Gibson组装、T4DNA聚合酶介导的重组技术 或者体内酵母组装技术。Gibson组装技术的原理为在组装反应体系中，T5核酸外切酶能从 双链DNA片段的5'端往里进行切割，产生3'端突出的黏性末端，由于各个片段之间具有同 源臂序列，相邻近的两个完全互补配对的黏性末端片段发生结合，产生的缺口由DNA聚合 酶补平和Taq DNA连接酶连接完成，从而实现重组片段的无缝组装。
[0033] 图1可以帮助理解本发明的原理，图1不代表本发明的唯一实施方式。本发明主 要包括分别采用不同引物进行的两轮PCR以及对第二轮PCR产物进行筛选的过程。第一轮 PCR涉及图1上端显示的5条5'至3'方向的引物，其中带有虚线的两条引物为锚点引物， 虚线所示部分即为锚点序列，分别带有★、▲、?的为针对不同目标突变区域设计的编辑引 物；在PCR过程的变性阶段，亲本DNA解链得到两条单链DNA，由于5条引物都只能与3'至 5'方向的DNA链结合，因此，整个PCR过程中只有3'至5'方向的亲本DNA链能作为模板 链，相应地，这一轮PCR结束后会得到大量5'至3'方向的单链突变体、少量未被用作模板 的单链DNA、少量与模板结合着的处于双链状态的发生突变的DNA链。以第一轮PCR混合产 物作为模板，或采用DNA溶液柱纯方式回收单链突变体作为模板，以减少其它影响因素。相 应地，第二轮PCR可以不更换反应体系，直接向第一轮PCR混合产物中加入上、下游外端引 物，或者重新配制PCR反应体系。第二轮PCR涉及一对外端引物，该外端引物与第一轮PCR 中的锚点引物的锚点序列匹配或相同，因此该外端引物只与带有锚点序列的单链DNA结合 进行扩增反应，而亲本DNA由于缺少能与锚点序列匹配的序列而得不到扩增。最后，通过对 丰富的双链突变体库进行筛选获取理想的突变体。
[0034] 图2为在图1的基础上进行简化后得到的一步PCR，能直接制备双链突变体文库。 一步PCR是在第一轮PCR反应体系中就添加了上、下游外端引物，这样，在反应的过程中，新 生成的单链突变体与上游或下游外端引物结合，并扩增形成双链突变体，而亲本链由于不 能和外端引物结合，不会被扩增。在此过程中，形成的突变体以指数的形式增长，相比两轮 PCR反应体系，产生的突变体更多。同时，在操作上更加方便，耗时短。
[0035] 本发明以体外PCR重组技术为基础，人工合成单链突变体文库，通过设计针对多 个目标区域的编辑引物，PCR后获得含有多样性极其丰富的突变文库，双链化后再采用体外 重组技术构建突变体筛选文库。本发明克服了现有随机突变多样性不足、DNA shuf f 1 ing技 术受同源序列和同源基因材料限制的缺点，而且操作实施简单，易于获得丰富的突变体文 库，为基因体外快速进化奠定了基础。用于快速高效进化的对象可以为任何DNA序列，包括 启动子、核糖体结合位点、非转录翻译调控区、酶基因以及构成代谢合成途径的多个DNA序 列。当然，本发明同样适用于只有一个目标突变区域的情况。
【附图说明】
[0036] 图1所示为RECODE技术采用两轮PCR反应系统组合进化DNA的方法示意图；两端 虚线位置为锚点序列。
[0037] 图2所示为RECODE技术采用一步PCR反应系统组合进化DNA的方法示意图；两端 虚线位置为锚点序列。
[0038] 图3所示为0半乳糖苷酶和酯酶LacZ-Esterase重组pMD19转化JM109,进行底 物平板筛选显色反应图。
[0039]图4所示为采用RECODE技术两轮PCR反应系统（回收单链产物做模板）制备的 LacZ-Esterase组合突变文库平板筛选显色反应图。
[0040] 图5所示为采用RECODE技术两轮PCR反应系统（以第一轮未回收的PCR产物做 模板）制备的LacZ-Esterase组合突变文库平板筛选显色反应图。
[0041] 图6所示为采用RECODE技术一步PCR反应系统制备的LacZ-Esterase组合突变 文库平板筛选显色反应图。
[0042] 图7所示为rpoS启动子突变体文库中各突变体单位菌体的荧光强度示意图，箭头 所指为野生型启动子的单位荧光强度值。
[0043] 图8所示为不同强度的rpoS突变启动子的突变序列比对示意图。
[0044] 图9所示为透明质酸酶突变体显示的不同酶活力示意图。
[0045] 图10所示为表现酶活差异的透明质酸酶突变体的氨基酸突变位点示意图。
[0046] 图11所示为ALA合成途径大肠杆菌内源性基因hemL-hemA-hemF构建示意图。
[0047] 图12所示为突变重组ALA代谢途径元件获得突变株的ALA产量图；LAF为重组构 建的原质粒，A1-A5分别为不同产量的突变株。
【具体实施方式】
[0048] 核苷酸序列说明：SEQ ID NO. 1所示为LacZ启动子、0半乳糖苷酶基因lacZ和酯 酶Esterase基因的融合序列。SEQ ID N0. 2所示为大肠杆菌基因rpoS组成型启动子核苷 酸序列；SEQ ID N0. 3所示为透明质酸酶基因LHyal核苷酸序列；SEQ ID N0. 4所示为重组 构建的ALA合成途径基因hemL-hemA-hemF核苷酸序列。
[0049] 实施例1REC0DE技术两轮PCR反应系统制备组合突变文库
[0050] A对单突变体文库纯化后制备双链突变体文库
[0051] 以0半乳糖苷酶和酯酶lacZ-Esterase的基因为例进行组合致死突变，核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。本实施例采用半乳糖苷酶和酯酶基因进行组合致死突变，可以根 据平板筛选来指示文库的多样性，在筛选平板中添加底物〇. ImM IPTG、20μg/ml X-Gal和 1 %的三丁酸甘油酯。两个基因重组PMD19载体并转化JM109宿主，在筛选平板上，亲本基 因宿主如图3所示，菌落显蓝色（lacZ降解X-gal)，且产生水解透明圈（Esterase水解三丁 酸甘油酯）。
[0052] 0半乳糖苷酶（带启动子）下游串联酯酶基因，对lacZ基因内部一处位点 和Esterase基因内部两处位点进行进行组合突变，分别设计三条编辑引物，编辑引 物（JPS-MD/LacZ-PlF、JPS-MD/Est-P2F 和 JPS-MD/Est-P3F)、锚点引物（JPS-LZE/UTA、 JPS-LZE/DTA)和外端引物（LZE-F、LZE-R)和载体制备引物分别如下所示：
[0053] JPS-MD/LacZ-PlF:GTGACTGGGAAAACCCTGGCTAAACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCA
[0054] JPS-MD/Est-P2F:GTGCTTTATCTGCACGGTGGCGGCTAAGTTATCGGCTCGATCAACACGC
[0055] JPS-MD/Est-P3F:CGATATGGAAGGAGTCGGCGATTCGTGAAGACGAAGGCGGCTGTCG
[0056] JPS-LZE/UTA : CATCACAGTCTTGCTAAAGCGCAAGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTG
[0057] JPS-LZE/DTA : CGACAAAATTGGAGCGTTCATCCGCGCCAACGCCGAGTAAATCACTAGTCTGAATCG GCC
[0058] LZE-F ：CATCACAGTCTTGCTAAAGCGCAAG
[0059] LZE-R ：GGCCGATTCAGACTAGTGAT
[0060] 三条编辑引物的内部（划线处）引入突变，即分别由原来的三联密码子GTT、TAC 和ATGA突变为TAA、TAA和-TGA，任何一个终止子的引入，都将导致相应的酶蛋白翻译提前 终止而失活。两条锚点引物（JPS-LZE/UTA和JPS-LZE/DTA)与编辑引物为同方向，且都与同 一单链模板配对，锚点引物带有20多bp的锚点序列（锚点序列可与克隆载体的缺口位置 序列一致，用于同源重组克隆使用，本实施例采用