本发明可单独使用每个基因作为诊断或者预后标记物的来实践， 或者使用结合成组显示形式（panel display format)的几个标记物基因来实践，从而对于 甲基化的基因的全部类型或列表可以检测多个标记基因以增加可靠性和效率。此外，在本 申请中识别的任何基因可单独或者作为与在此记载的任何其他基因以任何组合而成的一 组基因使用。或者，基因可根据它们的重要性以及甲基化基因数目被分级和加权，并且可确 定发展癌症的可能性水平。这些算法也落入本发明的范围之内。
[0102] 检测甲基化的方法
[0103] 甲基化特异性PCR
[0104] 当使用亚硫酸氢盐处理基因组DNA时，5' -CpG' -3区中的甲基化胞嘧啶保持不变， 但是未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶。因此，基于通过亚硫酸氢盐处理而转变的碱基序列，构 建了与具有5'-CpG-3'碱基序列的区域相对应的PCR引物组。这里，所构建的引物组是两 种引物组：与甲基化碱基序列对应的引物组和与未甲基化碱基序列对应的引物组。当基因 组DNA被亚硫酸氢盐转变然后使用上述两种引物组进行PCR扩增时，在基因组DNA被甲基 化的情况下，在使用与甲基化碱基序列对应的引物的PCR混合物中检测到PCR产物，而在基 因组DNA未甲基化的情况下，在使用与未甲基化的碱基序列对应的引物的PCR引物中检测 到基因组DNA。这一甲基化可使用琼脂糖凝胶电泳定量分析。
[0105] 实时甲基化特异性PCR
[0106] 实时甲基化特异性PCR是由甲基化特异性PCR法改良而来的实时测定方法，并且 包括使用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，设计与甲基化碱基序列对应的PCR引物，并使用该引 物进行实时PCR。检测基因组DNA甲基化的方法包括两种方法：使用与扩增的碱基序列互 补的TanMan探针进行检测的方法，和使用Sybergreen进行检测的方法。因此，实时甲基化 特异性PCR能够选择性地定量分析甲基化的DNA。这里，使用体外甲基化DNA样品绘制标准 曲线，并且将在碱基序列中不含5'-CpG-3'序列的基因作为阴性对照组扩增，以进行标准 化来定量分析甲基化程度。
[0107] 焦磷酸测序
[0108] 焦磷酸测序法是由亚硫酸氢盐测序法改良而来的实时测序方法。与亚硫酸氢盐测 序相似，基因组DNA通过亚硫酸氢盐处理被转变，然后构建与不含5' -CpG-3'序列的区域对 应的PCR引物。具体地，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，使用PCR引物对其进行扩增，然后使 用测序引物进行实时碱基序列分析。分析5' -CpG-3'区域中胞嘧啶和胸腺嘧啶的量，以甲 基化指数表示甲基化程度。
[0109] 使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、定量PCR和DNA芯片测定法
[0110] 当仅仅与甲基化DNA特异性结合的蛋白质与DNA混合时，蛋白质仅仅特异性地与 甲基化DNA结合。因此，无论是使用甲基化特异性结合蛋白的PCR，或DNA芯片测定法都允 许只选择性地分离甲基化DNA。基因组DNA与甲基化特异性结合蛋白混合，然后只有甲基化 DNA被选择性地分离出来。使用对应于启动子区域的PCR引物扩增分离的DNA，然后通过琼 脂糖凝胶电泳测定DNA甲基化。
[0111] 此外，DNA的甲基化还可以通过定量PCR法测定，并且用甲基化DNA特异性结合蛋 白分离的甲基化DNA可以用荧光探针标记并与含有互补探针的DNA芯片杂交，从而测量甲 基化DNA。这里，甲基化DNA特异性结合蛋白可以是，但不限于，MBD2bt (截短的甲基-CpG 结合域蛋白2)。
[0112] 差异性甲基化-甲基化-敏感的限制性内切酶的检测
[0113] 差异性甲基化的检测可以通过将核酸样品与只裂解未甲基化CpG位点的甲基化 敏感限制性内切酶接触来实现。
[0114] 在一个单独的反应中，将样品进一步接触既裂解甲基化又裂解未甲基化的 CpG-位点的甲基化敏感限制酶，从而裂解甲基化的核酸。
[0115] 将特异性引物加入到核酸样品中，并且通过任何常规的方法扩增核酸。在用甲基 化敏感限制酶处理的样品中存在扩增产物而在用甲基化敏感限制酶的同裂酶处理的样品 中不存在扩增产物表明在检测的核酸区域中发生了甲基化。但是，在用甲基化敏感限制酶 处理的样品中不存在扩增产物以及在用甲基化敏感限制酶的同裂酶处理的样品中不存在 扩增产物一起表明在检测的核酸区域中没有甲基化发生。
[0116] 如本文所用，术语"甲基化敏感限制酶"是指一种限制性酶（例如，Smal)，其包括 CG作为其识别位点的一部分，并且当C被甲基化时相比于C未甲基化时具有活性。甲基化 敏感限制酶的非限制性实例包括MspI、HpaII、BssHII、BstH和NotI。这些酶可以单独使 用或组合使用。其它甲基化敏感限制酶的实例包括但不限于：SacII和EagI。
[0117] 该甲基化敏感限制酶的同裂酶是识别与甲基化敏感限制酶相同的识别位点，但裂 解甲基化和未甲基化CG两者的限制性酶。其实例包括MspI。
[0118] 本发明的引物被设计成与待扩增座位的每条链"基本上"互补，并包括如上所述的 适当的G或C核苷酸。这意味着引物必须充分互补以便在聚合反应条件下与它们各自的链 杂交。本发明的引物用于酶链式反应（例如PCR)扩增过程中，其中靶标座位通过一些反应 步骤呈指数增长。典型地，一个引物与座位的负（-)链同源（反义引物）而另一个引物与正 (+)链同源（有义引物）。在引物与变性核酸退火后，核酸通过诸如DNA聚合酶I (Klenow) 的酶和注入核苷酸的试剂延伸，结果是，新合成了含有靶标座位序列的+和-链。当这些新 合成的序列用作模板，并进行变性、引物退火和延伸的重复循环时，发生靶标座位序列的指 数合成。所得的反应产物是具有与采用的特定引物末端相对应末端的离散核酸双螺旋。
[0119] 扩增反应是本领域中通常使用的PCR。然而，也可以采用替代方法，例如实时PCR 或使用等温酶的线性扩增。此外，还可以使用多重扩增反应。
[0120] 亚硫酸氢盐测序法
[0121] 用于检测含有甲基化CpG的核酸的另一种方法包括将含核酸的样品与修饰未甲 基化胞嘧啶的试剂接触，并使用与甲基化无关的寡核苷酸引物扩增样品中含CpG的核酸。 此处，寡核苷酸引物扩增核酸，而不区分修饰的甲基化核酸和未甲基化的核酸。扩增产物使 用测序引物通过桑格法测序或由与针对亚硫酸氢盐测序所描述的下一代测序方法进行测 序以检测甲基化的核酸。这里，下一代测序方法可以由测序-合成或测序-连接技术执行。 此方法的特征在于，代替制备细菌克隆，对单个DNA片段进行空间分离，原位扩增（克隆扩 增），并测序。这里，数十万片段被同时读出，因此，该方法也被称为"大规模并行测序法"。
[0122] 通常，使用在依次加入单或二核苷酸时获得信号的测序-合成法。这种方法的实 例包括焦磷酸测序、离子流，和Solexa法。
[0123] 基于测序-合成的NGS系统包括454平台（Roche)、HiSeq平台（Illumina)、离子 PGM平台（Life Technology)和 PacBio 平台（Pacific BioScienceshdS^：和离子 PGM平台 使用再现PCR (emersion PCR)进行克隆扩增，而HiSeq平台使用Bridge扩增。在测序-合 成法中，通过检测在依次加入单核苷酸来合成DNA时产生的磷酸盐、氢离子或荧光进行测 序。在检测序列的过程中，454平台是基于焦磷酸测序法，而离子PGM平台是基于氢离子的 检测。HiSeq和PacBio平台是通过检测荧光执行测序。
[0124] 测序-连接法是使用DNA连接酶，并且执行用来识别在DNA核苷酸序列的特定位 置存在的核苷酸的测序技术。与使用聚合酶的大多数测序技术不同，测序-连接法的特征 在于不使用聚合酶并且DNA连接酶不连接错配序列。SOLiD系统对应于这种方法。在该技 术中，在测序过程的每一步中读出两个核苷酸。读数通过引物重置被单独重复五次，并且因 此每个核苷酸被读两次，使得数据高度准确。
[0125] 在测序-连接法中，在由16个组合形成的二核苷酸引物组中，顺序连接对应于目 的核苷酸序列的二核苷酸引物，并且对连接组合进行最后分析，以确定目的DNA的碱基序 列。
[0126] 使用甲基化DNA特异性结合蛋白或抗体的测序、测序-合成或测序-连接
[0127] 在使用甲基化DNA特异性结合蛋白或抗体的测序或下一代测序法中，将特异性结 合甲基化DNA的蛋白质或抗体与DNA混合，然后使其特异结合甲基化DNA。因此，只有甲基 化DNA可以被选择性地分离出来。在本发明中，将基因组DNA与甲基化DNA特异性结合蛋 白混合，然后只有甲基化DNA被选择性地分离出来。用PCR引物扩增被分离的DNA，然后使 用Sanger法或测序-合成或测序-连接法来测量DNA是否被甲基化。
[0128] 这里，新一代测序方法可以通过测序-合成或测序-连接法进行。此外，甲基化 DNA特异性结合蛋白可以是MBD2bt，但不限于此，并且抗体可以是5'-甲基胞嘧啶，但不限 于此。
[0129] 试剂盒
[0130] 本发明提供了一种可用于检测受试者的细胞增殖性病症的试剂盒。本发明的试 剂盒包含被区室化以在其中容纳样品的载体装置，一个或多个容器，包括含有用于扩增 5' -CpG-3'碱基序列的PCR引物的第二容器和含有用于对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序 的测序引物的第三容器。
[0131] 载体装置适合于含有一个或多个容器，例如小瓶、管等，每个容器包括用于本方法 的分离元件之一。鉴于本文所提供的本发明方法的描述，本领域的技术人员可容易地确定 必要试剂在容器中的分配。
[0132] 基底
[0133] 在扩增了靶标核酸区域后，可将核酸扩增产物与结合于固体支持物（基底）的已 知基因探针杂交来检测核酸序列的存在。
[0134] 如本文所用，在参照物质、结构、表面或材料使用时，术语"基底"是指包含非生物 的、合成的、非存活的（